Presentamos un protocolo paso a paso para el aislamiento de células madre hematopoyéticas a largo plazo (LT-HSCs) y HSCs a corto plazo (ST-HSCs) utilizando el sistema reportero Hoxb5.
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Artículo de método
Método de aislamiento para células madre hematopoyéticas a largo y corto plazo
En este artículo
Resumen
Resumen
La capacidad de autorrenovación y el potencial de diferenciación multilinaje se consideran generalmente como las características definitorias de las células madre hematopoyéticas (HSC). Sin embargo, numerosos estudios han sugerido que existe heterogeneidad funcional en el compartimento HSC. Análisis recientes de células individuales han reportado clones de HSC con diferentes destinos celulares dentro del compartimento HSC, que se conocen como clones de HSC sesgados. Los mecanismos subyacentes a los resultados heterogéneos o poco reproducibles son poco conocidos, especialmente con respecto a la duración de la autorrenovación cuando las fracciones purificadas de HSC se trasplantan mediante inmunotinción convencional. Por lo tanto, establecer un método de aislamiento reproducible para las HSC a largo plazo (LT-HSC) y las HSC a corto plazo (ST-HSC), definido por la duración de su autorrenovación, es crucial para superar este problema. Mediante el cribado imparcial de varios pasos, identificamos un factor de transcripción, Hoxb5, que puede ser un marcador exclusivo de LT-HSC en el sistema hematopoyético de ratón. Con base en este hallazgo, establecimos una línea de ratón reportero Hoxb5 y aislamos con éxito LT-HSC y ST-HSC. Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de LT-HSC y ST-HSC utilizando el sistema informador Hoxb5 . Este método de aislamiento ayudará a los investigadores a comprender mejor los mecanismos de autorrenovación y la base biológica de dicha heterogeneidad en el compartimento HSC.
Introducción
Las células madre hematopoyéticas (HSC), que poseen capacidad de autorrenovación y multipotencia, residen en el ápice de la jerarquía hematopoyética 1,2. En 1988, Weissman y sus colegas demostraron por primera vez que el aislamiento de las HSC de ratón podría lograrse utilizando la citometría de flujo3. Posteriormente, se informó que una fracción definida por una combinación de marcadores de superficie celular, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, contenía todas las HSCs en ratones 4....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Centro RIKEN para la Investigación de Dinámica de Biosistemas.
1. Preacondicionamiento de los ratones receptores
- Preparar ratones congénicos machos C57BL/6 de 8-10 semanas de edad como ratones receptores. El número de ratones receptores depende del protocolo experimental. Por lo general, preparamos de 10 a 20 ratones para cada condición.
- Alimente a los ratones con agua esterilizada suplementada con enrofloxacino (170 mg / L). Como los ratones receptores irradiados son altamente susceptibles a la infección, mantenga las jaulas lo más limpi....
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Resultados
Anteriormente, la capacidad de autorrenovación se ha medido mediante ensayos de trasplante competitivos, en los que se cree que las HSC del donante conservan su capacidad de autorrenovación solo si se observan células donantes de múltiples linajes en la sangre periféricareceptora 17. Además, varios relatos definen las LT-HSC como células que continúan produciendo células de sangre periférica varios meses después del segundo trasplante de médula ósea10,18
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Discusión
Tradicionalmente, las HSC definidas por marcadores de superficie celular se han preparado para estudiar las funciones de las HSC, como la capacidad de autorrenovación y la potencia múltiple 19,20,21. Sin embargo, la fracción HSC inmunofenotípicamente definida (Linaje−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/lo Flk2−) contiene dos poblaciones discretas de HSC: LT-HSCs y ST-HSCs
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses asociados con este estudio.
Agradecimientos
Agradecemos a Hiroshi Kiyonari por el cuidado de los animales y por proporcionar ratones receptores en RIKEN BDR, así como a Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka y Masaki Miyahashi por la gestión del laboratorio en la Universidad de Kobe. Los autores también aprecian enormemente el apoyo continuo a este trabajo. Masanori Miyanishi fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 y JP20H03268, The Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, The Life Science Foundation of Japan, The Takeda Science Foundation, The Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders, y AMED-PRIME, AMED bajo el....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,2 mL tira de 8 tubos, tapón de cúpula | SSIbio | 3230-00 | |
| 0,5M EDTA pH 8,0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µ m Filtro de células | Falcon | 352360 | |
| 30G jeringa de insulina | BD 326668 | ||
| 40 µ m Filtro de células | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo, con filtro de células Tapón a presión | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Solución de tinción de viabilidad | BioLegend | 420404 | |
| 96 pocillos U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirador con trampa matraz | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotina (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6. Ratones congénitos CD45.1 | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II sistema de pedido especial | BD | N/A | |
| Tampón antimanchas brillante | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotina (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3&épsilon; -Biotina (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3&épsilon; -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| Ratones congénitos CD45.1/CD45.2 | N/A | /A | Criados en nuestro laboratorio |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotina (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotina (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Tubo de Centrífuga 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Tubo de centrífuga 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) sin Ca y Mg, líquido | Nacalai | 14249-24 | |
| Suero Fetal Bovino | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo versión 10 | BD Biosciences | ||
| Gmmacell 40 Exactor | Mejor Teratrónica | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mRatones Cherry (C57BL/6J fondo) | N/A | N/A | Criado en nuestro laboratorio |
| IgG a partir de suero de rata, grado técnico, >=80% (SDS-PAGE), solución acuosa tamponada | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurano | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Toallitas Kimwipes S200 | PAPEL NIPPON CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Columnas | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Tampón de lisis | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Microplaca para cultivo de tejidos (para célula de adhesión) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| Separador MidiMACS | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Jaulas para tartas de ratón | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Centrífuga refrigerada multiusos | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Solución mixta de penicilina-estreptomicina | nacalai | 26253-84 | |
| Mortero de porcelana φ 120mm con Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| Tubo LoBind de Proteínas 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Hoja de bisturí de acero inoxidable | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Restricción de venas de cola para ratones estándar | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotina (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Jeringa Concéntrica Luer-Slip | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Aguja Hipodérmica 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
Referencias
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L.
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Reimpresiones y permisos
