El protocolo actual permite la entrega eficiente y estable de microesferas fluorescentes (MS) y puntos cuánticos (QD) en el miocardio de peces vivos que pueden ser rastreados (rastreados) a lo largo del tiempo.
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Artículo de método
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El protocolo actual permite la entrega eficiente y estable de microesferas fluorescentes (MS) y puntos cuánticos (QD) en el miocardio de peces vivos que pueden ser rastreados (rastreados) a lo largo del tiempo.
El pez cebra ha demostrado ser un modelo importante para estudiar la formación y función cardiovascular durante el desarrollo y la regeneración postembrionaria. El presente protocolo describe un método para inyectar trazadores fluorescentes en el miocardio del pez cebra para estudiar la absorción de líquido intersticial y desechos en los vasos linfáticos cardíacos. Para ello, se introducen microesferas (200 nm de diámetro) y puntos cuánticos (<10 nm de diámetro) en el miocardio de peces cebra vivos, que pueden rastrearse mediante microscopía confocal ex vivo . Luego, estos marcadores se rastrean de forma intermitente durante varias horas para seguir el aclaramiento desde el miocardio hasta los vasos linfáticos cardíacos. Los puntos cuánticos se transportan a través de los vasos linfáticos cardíacos lejos del corazón, mientras que las microesferas más grandes permanecen en el lugar de la inyección durante más de tres semanas. Este método de inyección intramiocárdica puede extenderse a otros usos, incluida la inyección de MS encapsulada o hidrogeles para liberar localmente células, proteínas o compuestos de interés para una región específica del corazón.
El sistema linfático es esencial para mantener el equilibrio tejido-líquido, la modulación de la respuesta inmunitaria tras una lesión y la absorción de lípidos en elintestino. La evidencia acumulada respalda las amplias funciones del sistema linfático en diversos contextos de enfermedad y desarrollo. Sin embargo, los estudios mecanicistas se ven obstaculizados porque los vasos linfáticos pueden ser difíciles de visualizar y su funcionalidad puede ser incierta. Las primeras técnicas de imagen se basaban en la capacidad natural del sistema linfático para absorber intersticialmente los trazadores inyectados y lue....
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Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Weill Cornell Medicine (protocolo 2020-0027) y siguieron las pautas adecuadas. Los siguientes experimentos se realizaron con machos y hembras de pez cebra AB de tipo salvaje de 14 a 20 meses después de la fertilización para los adultos, y 35 días después de la fertilización para los juveniles.
1. Extracción de agujas y preparación de reactivos
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Inmediatamente después de la inyección, debe ser visible una pequeña región blanca de la pared miocárdica (Figura 3F). Esta región mostrará un marcaje fluorescente brillante de la MS y QD inyectadas (Figura 4B, E). Además, puede haber puntos de fluorescencia débiles y esporádicos en la superficie externa del corazón debido a cualquier QD y MS en el espacio pericárdico después del procedimiento (Figura 4B, E<.......
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En el presente artículo se describe un método para introducir material exógeno en el miocardio del pez cebra. Esta técnica fue desarrollada para introducir QD y MS en el miocardio para estudiar la función linfática en la homeostasis y la regeneración 2,18. Un abordaje similar también se ha utilizado para introducir QD en el miocardio de ratones con el fin de investigar la presencia y función de los linfáticos después de un infart.......
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Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecemos a Adedeji Afolalu, Chaim Shapiro, Soji Hosten y Chelsea Quaies por el cuidado de los peces (Weill Cornell Medicine), Caroline Pearson (Weill Cornell Medicine) por la lectura crítica del manuscrito. Jingli Cao (Weill Cornell Medicine) por el uso del telescopio de disección y la cámara para registrar el procedimiento, además de la lectura crítica del manuscrito. Nathan Lawson (Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts), Brant Weinstein (NICHD), Elke Ober (Universidad de Copenhague) y Stephan Schulte-Merker (WWU Münster) para líneas de peces cebra transgénicos. Daniel Castranova (NICHD) para asesoramiento sobre ....
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Plato de cristalización | VWR | 89000-288 | |
| Osciloscopio de disección | Zeiss | 495010-0007-000 | |
| Agua para instalaciones piscícolas | N/A | N/A | Agua de ósmosis inversa con sal marina y bicarbonato de sodio añadida a una conductividad de 226uS y pH de 7,35 |
| Pinzas | Dumont | 11252-20 | |
| Capilares de vidrio | WPI | 1B120-3 | sin filamento |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| Tijeras de iridectomía | Fine Scientific Tools | 15000-00 | |
| Microinyector | Warner Instruments | 64-1735 | |
| Microcargador femtotips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Extractor de micropipetas | Sutter Instrument | P-97 | Entrada de pedal cerrada |
| Microesferas | Thermo Fisher Scientific | B200 | Blue |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| Quantum dots (QD) | Thermo Fisher Scientific | Q21061MP | Qtracker705 etiqueta vascular |
| Sponge | cualquiera | cualquiera | (1,5 veces; 5 veces; 3 cm) con ranura (0,5 veces; 2,5 cm) |
| Filtro de jeringa | Corning | 431220 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | concentración: 4 mg/mL |
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