Generación de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes sanas y específicas de la enfermedad retiniana inducida por humanos

Resumen

Este protocolo describe un método eficiente para diferenciar las hiPSC en grupos de campo ocular y generar organoides neurorretinianos utilizando condiciones de cultivo simplificadas que involucran sistemas de cultivo adherentes y en suspensión. Otros tipos de células oculares, como el EPR y el epitelio corneal, también se pueden aislar de campos oculares maduros en cultivos de retina.

Resumen

Las células madre pluripotentes pueden generar organoides tisulares complejos que son útiles para estudios de modelado de enfermedades in vitro y para desarrollar terapias regenerativas. Este protocolo describe un método más simple, robusto y gradual para generar organoides retinianos en un sistema de cultivo híbrido que consiste en cultivos monocapa adherentes durante las primeras 4 semanas de diferenciación retiniana hasta la aparición de grupos primordiales de campo ocular (EFP) distintos y autoorganizados. Además, las islas neurorretinianas en forma de rosquilla, circulares y translúcidas dentro de cada EFP se recogen manualmente y se cultivan bajo suspensión utilizando placas de cultivo no adherentes en un medio de diferenciación retiniana durante 1-2 semanas para generar copas ópticas 3D multicapa (OC-1M). Estos organoides retinianos inmaduros contienen precursores retinianos multipotentes proliferantes PAX6+ y ChX10⁺. Las células precursoras se autoensamblan linealmente dentro de los organoides y aparecen como estrías radiales distintas. A las 4 semanas después del cultivo en suspensión, los progenitores retinianos sufren un paro postmitótico y diferenciación de linaje para formar organoides retinianos maduros (OC-2M). Los precursores comprometidos con el linaje fotorreceptor se desarrollan dentro de las capas más externas de los organoides retinianos. Estas células fotorreceptoras CRX+ y RCVRN⁺ maduran morfológicamente para mostrar extensiones similares a segmentos internos. Este método se puede adoptar para generar organoides retinianos utilizando células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Todos los pasos y procedimientos están claramente explicados y demostrados para garantizar la replicabilidad y para aplicaciones más amplias en ciencia básica e investigación traslacional.

Introducción

La retina es un tejido sensible a la luz presente en la parte posterior del ojo de los vertebrados que convierte las señales de luz en impulsos nerviosos por un fenómeno bioquímico conocido como la vía de fototransducción. Los impulsos nerviosos iniciales generados en las células fotorreceptoras de la retina se transducen a otras interneuronas retinianas y células ganglionares de la retina (CGR) y llegan a la corteza visual del cerebro, lo que ayuda en la percepción de la imagen y la respuesta visual.

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), se estima que 1,5 millones de niños son ciegos, de los cuales 1 millón están en Asia. La dis....

Protocolo

Todos los experimentos con hiPSC se llevaron a cabo de forma aséptica, en cumplimiento de las prácticas estándar de laboratorio, las pautas éticas y de bioseguridad, y con las aprobaciones de organismos reguladores como el Comité de Ética Institucional (IEC), el Comité Institucional para la Investigación de Células Madre (IC-SCR) y el Comité Institucional de Bioseguridad (IBSC).

1. Preparación de cultivo de iPSC y medio de diferenciación retiniana y reactivos

1. Medio de cultivo y mantenimiento iPSC
   1. Cultivar y mantener la línea normal^{hiPSC 23} (hiPSC-F2-3F1) y una línea RB1-/- hiPSC edit....

Resultados

La diferenciación de hiPSCs en linajes oculares se logra cultivando las células en diferentes cócteles de medio de cultivo que contienen suplementos y factores de crecimiento en pasos secuenciales en diferentes puntos de tiempo, como se describe en la Figura 1. Los cultivos de hiPSC se mantienen en medio Essential 8, el medio pluripotente de mantenimiento de células madre. Una vez que alcanzan una confluencia del 70%-80% (Figura 2A), el medio se reemplaza con el.......

Discusión

Las hiPSC son una herramienta poderosa para estudiar el desarrollo de órganos y tejidos in vitro. Recapitular el fenotipo de la enfermedad diferenciando las hiPSC sanas versus específicas de la enfermedad hacia el linaje retiniano puede ayudar a obtener nuevos conocimientos sobre la fisiopatología de diferentes formas de distrofias retinianas hereditarias. Se han descrito y adoptado varios protocolos para la diferenciación in vitro de PSCs en tipos de células retinianas. La mayoría de ellos implican el .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,22 y micro; m Filtros de jeringa	TPP	99722
Tubo de centrífuga de 15 mL	TPP	91015
Tubo de centrífuga de 50 mL	TPP	91050
Placas de 6 pocillos	TPP	92006
Anticuerpo anti-Chx10; Anticuerpo anti-CRX monoclonal	Santa Cruz	SC365519	ratón con dilución 1:50
; Anticuerpo anti-Recoverina anti-Recoverina monoclonal	Abcam	ab140603	dilución 1:300
Anticuerpo anti-Recoverina anti-Recoverina monoclonal de ratón	Abcam	ab3201	dilución 1:250
; Policlonal de conejo	Millipore	AB5585	Dilución 1:300
B-27 Suplemento (50x), sin suero	Thermo Fisher	17504044
Factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF)	Sigma Aldrich	F0291
Centrífuga 5810R	Eppendorf
Coplin Tarro (50 mL)	Tarson
Corning Matrigel Matrix Certified	hESC Corning
CryoTubes	Thermo Fisher	V7884
DMEM/F-12, GlutaMAX suplemento (medio basal)	Thermo Fisher	10565-018
DreamTaq ADN polimerasa	Thermo Fisher	EP0709
Dulbeco' s Solución salina tamponada con fosfato	Thermo Fisher	14190144
Essential 8 kit mediano	Thermo Fisher	A1517001
Etileno diamina tetraacético sal disódica de ácido disódico dihidratado (EDTA)	Sigma Aldrich	E5134
Falcon No tratado con TC Placa de Petri tratada, 60 mm	Corning	351007
Fetal  Bovinos  Suero, calificado, Estados Unidos	Gibco	26140079
GelDocXR+ con software de laboratorio de imágenes	BIO-RAD		Sistema de documentación de gel de agarosa
GlutaMAX Suplemento	Thermo Fisher 35050061
Cabra anti-Ratón IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	dilución 1:300
Cabra anti-Ratón IgG (H+L), Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11030	1:300 dilución
Cabra anti-Conejo IgG (H+L), Alexa Fluo 546	Invitrogen	A11035	dilución 1:300
Cabra anti-Conejo- IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	dilución 1:300
HistoCore MULTICUT	Leica	Para el corte KnockOut
Replacement	Thermo Fisher	10828028
Ácido L-Acsórbico	Sigma Aldrich	A92902
MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales (100x)	Thermo Fisher	11140-050
N2 suplemento (100x)	Thermo Fisher	17502048
NanoDrop 2000	Thermo Fisher		Para cuantificar el ARN
Paraformaldehído	Qualigens	23995
Pipetas Pasteur, 9 pulgadas, No Estériles, Desenchufadas	Corning	7095D-9
Penicilina-Estreptomicina	Thermo Fisher	15140-122
Anticuerpo recombinante Anti-Otx2 , monoclonal de conejo	Abcam	ab183951	dilución 1:300
Anticuerpo anti-PAX6 recombinante; Monoclonal de conejo	Abcam	ab195045	dilución 1:300
Anticuerpo recombinante anti-RPE65, monoclonal de conejo	Abcam	ab231782	dilución 1:300
Proteína recombinante de Noggin humana	R& D Systems	6057-NG
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Pipetas serológicas 10 mL	TPP	94010
Pipetas serológicas 5 mL	TPP	94005
Cloruro de sodio	Sigma Aldrich	S7653
Citrato de sodio Tribásico dihidratado	Sigma Aldrich	S4641
Starfrost ( recubierto de silano) portaobjetos microscópicos	Knittel
SuperScript III Sistema de síntesis de primera cadena	Thermo Fisher	18080051
SuperScript III Sistema de síntesis de primera cadena para RT-PCR	Invitrogen	18080051
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
TRIzol  Reactivo	Invitrogen	15596026
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
VECTASHIELD Medio de montaje antidecoloración con DAPI	Laboratorios de vectores	H-1200
Vitronectina	Thermo Fisher	A27940
Y-27632 diclorhidrato (inhibidor de la rho-quinasa)	Sigma Aldrich	Y0503
Zeiss LSM 880	Zeiss		Microscopio confocal

de de conejo con , con 354277Serum