El presente trabajo describe un novedoso protocolo experimental que utiliza un soporte impreso en 3D para permitir imágenes de células vivas de alta resolución de globos enucleados. A través de este protocolo, la actividad de señalización de calcio celular en el epitelio corneal herido de globos ex vivo se puede observar en tiempo real.
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Artículo de método
Imágenes de células vivas de globos intactos ex vivo utilizando un novedoso soporte impreso en 3D
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Resumen
Resumen
La cicatrización de heridas epiteliales corneales es un proceso migratorio iniciado por la activación de receptores purinérgicos expresados en las células epiteliales. Esta activación da como resultado eventos de movilización de calcio que se propagan de célula a célula, que son esenciales para iniciar la motilidad celular en el lecho de la herida, promoviendo la cicatrización eficiente de la herida. El laboratorio de Trinkaus-Randall ha desarrollado una metodología para obtener imágenes de la respuesta de cicatrización de heridas corneales en globos murinos ex vivo en tiempo real. Este enfoque implica la enucleación de un globo intacto de un ratón que ha sido sacrificado según los protocolos establecidos e inmediatamente la incubación del globo con un tinte indicador de calcio. Una contratinción que tiñe otras características de la célula se puede aplicar en esta etapa para ayudar con las imágenes y mostrar puntos de referencia celulares. El protocolo funcionó bien con varios colorantes de células vivas diferentes utilizados para la contratinción, incluida la actina SiR para teñir la actina y la tinción de la membrana plasmática de color rojo intenso para teñir la membrana celular. Para examinar la respuesta a una herida, el epitelio corneal se lesiona con una aguja de 25 G, y los globos se colocan en un soporte impreso en 3D. Las dimensiones del soporte impreso en 3D están calibradas para garantizar la inmovilización del globo durante toda la duración del experimento y se pueden modificar para adaptarse a ojos de diferentes tamaños. Las imágenes de células vivas de la respuesta de la herida se realizan continuamente a varias profundidades en todo el tejido a lo largo del tiempo utilizando microscopía confocal. Este protocolo nos permite generar imágenes de alta resolución y calidad de publicación utilizando un objetivo de aire 20x en un microscopio confocal. Otros objetivos también se pueden utilizar para este protocolo. Representa una mejora significativa en la calidad de las imágenes de células vivas en globos murinos ex vivo y permite la identificación de nervios y epitelio.
Introducción
Córnea
La córnea es una estructura transparente y avascular que cubre la superficie anterior del ojo que refracta la luz para permitir la visión y protege el interior del ojo del daño. Como la córnea está expuesta al medio ambiente, es susceptible al daño tanto por causas mecánicas (rascado) como por infección. Una lesión corneal en un paciente sano generalmente se cura dentro de 1-3 días. Sin embargo, en pacientes con afecciones subyacentes, incluida la deficiencia de células madre limbares y la diabetes tipo II, el proceso de cicatrización de la herida corneal puede prolongarse en gran medida1. Como la córnea está altament....
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Protocolo
Los procedimientos que involucran sujetos animales fueron aprobados por la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el Uso de Animales en Cuidados Oftalmológicos e Investigación de la Visión y el protocolo IACUC de la Universidad de Boston (201800302).
1. Diseño de los soportes impresos en 3D y la barra de cubierta
- Diseñe los soportes impresos en 3D y la barra de cubierta que representan el diámetro promedio de los globos del ratón e imprima en 3D el diseño (Figura 1A, B).
- Mantenga el diámetro de la pared interna del soporte ligeramente....
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Resultados
Este protocolo se ha utilizado para producir consistentemente datos e imágenes con calidad de publicación10. Las imágenes obtenidas representan una mejora significativa en comparación con los enfoques anteriores (Figura 2). Usando el soporte impreso en 3D, las imágenes se pueden capturar a través de las capas de la córnea, y se puede observar la movilización de calcio en diferentes planos z (Figura 3). Este enfoque se ha utilizado para co.......
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Discusión
Este protocolo describe una técnica de imagen de células vivas que utiliza un soporte impreso en 3D para estabilizar e inmovilizar los ojos intactos de los animales. Está diseñado para eludir varias desventajas significativas reconocidas con protocolos previos de imágenes de células vivas de tejido corneal ex vivo . Este protocolo ofrece muchas ventajas para la obtención de imágenes de células vivas de globos intactos. Reduce significativamente el daño tisular innecesario que podría interferir con la respuesta d.......
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Divulgaciones
No tenemos conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a los NIH por el siguiente apoyo de subvención: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) y 5T32GM008541-24 (KS). También nos gustaría reconocer al Fondo de Investigación del Ojo de los Leones de Massachusetts y al Fondo de Trasplante de Córnea de Nueva Inglaterra.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1.75 plástico de ácido poliláctico (PLA) azul | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material para el soporte |
| Plato de 35 mm, cubreobjetos n.º 1.5, diámetro de vidrio de 14 mm, recubierto de poli-D-lisina | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Pozo para imágenes. |
| Software Autodesk Fusion 360 | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software utilizado para la impresión de los soportes. |
| BD 25 G 7/8 agujas estériles de un solo uso 100 agujas/caja | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | Para heridas inducidas experimentalmente en los globos |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Contratinción de membrana celular. Indicador de calcio. Concentración 1:10.000 con una concentración final de 1% (v/v) de DMSO y 0,1% (p/v) de ácido plurónico |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | Para fijar el soporte al pocillo de imágenes |
| Impresora 3D Ender 3 Pro | Creality (Shenzen, China) | N/A | Para imprimir el soporte |
| FIJI/ | ImageJ ImageJ (Bethesda, MD) | licencia: GPL2 | Software utilizado para confirmar la consistencia de la profundidad y el diámetro de la bobina entre globos independientes mediante el análisis de la región de interés |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Indicador de calcio. Concentración 1:100 con una concentración final de 1% (v/v) de DMSO y 0,1% (p/v) de ácido plurónico |
| sin suero de queratinocitos | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL de extracto pituitario bovino, 0,02 nM de EGF, 0,3 mM de CaCl2 y penicilina-estreptomicina (100 unidades/mL, 100 y micro; g/mL, respectivamente) añadidos al medio |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Se utiliza para lavar el exceso de tinción de las córneas antes de obtener imágenes |
| Microscopio Zeiss Confocal 880 con AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A Se | utilizó un objetivo de aumento de 20x |
Referencias
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al.
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Reimpresiones y permisos
