Se presenta un protocolo rápido y eficaz para el aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobullos asociadas a diversos organismos fotosintéticos. La preparación exitosa de plastoglóbulos aislados es un primer paso crucial que precede a las investigaciones moleculares detalladas, como los análisis proteómicos y lipidómicos.
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Artículo de método
Aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobulo del tejido foliar de plantas y cianobacterias
En este artículo
Resumen
Resumen
Las gotitas lipídicas de plastoglobulo son un subcompartimento dinámico de cloroplastos vegetales y cianobacterias. Se encuentran ubicuamente entre las especies fotosintéticas, se cree que desempeñan un papel central en la adaptación y remodelación de la membrana tilacoide en condiciones ambientales que cambian rápidamente. La capacidad de aislar plastoglóbulos de alta pureza ha facilitado enormemente su estudio a través de metodologías proteómicas, lipidómicas y otras. Con plastoglóbulos de alta pureza y rendimiento, es posible investigar su composición lipídica y proteica, actividad enzimática y topología proteica, entre otras posibles características moleculares. Este artículo presenta un protocolo rápido y eficaz para el aislamiento de plastoglóbulos de cloroplastos de tejido foliar vegetal y presenta variaciones metodológicas para el aislamiento de plastoglóbulos y estructuras de gotitas lipídicas relacionadas de hojas de maíz, el tejido foliar desecado de la planta de resurrección, Eragrostis nindensis, y la cianobacteria, Synechocystis PCC 6803. El aislamiento se basa en la baja densidad de estas partículas ricas en lípidos, lo que facilita su purificación por flotación por densidad de sacarosa. Esta metodología resultará valiosa en el estudio de plastoglóbulos de diversas especies.
Introducción
La comprensión actual de la composición y función de los plastoglobullos ha surgido a través de estudios proteómicos y lipidómicos detallados 1,2,3,4,5. Tales estudios han sido ayudados en gran medida por un método rápido y efectivo de aislamiento que se basa en su muy baja densidad para una separación eficiente utilizando gradientes de sacarosa. Los métodos iniciales de aislamiento de plastoglobullos se lograron a partir de especies como el haya (Fagus sylvatica), la escoba (Sarothamnus scopar....
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Protocolo
1. Aislamiento de plastoglóbulos crudos
- Extracción cruda de plastoglóbulo del tejido foliar de maíz no estresado
- Adquiera seis plántulas de maíz sanas de aproximadamente 3 semanas de edad y casi en la etapa de crecimiento V5, con un peso aproximado de 120 g.
- Recorte todas las hojas en la base del tallo, sumérjalas rápidamente en un baño de hielo y transpógrelas a la cámara frigorífica.
- Trabajando bajo una lámpara de seguridad verde, retire las hojas de maíz del baño de hielo y córtelas en trozos más pequeños (alrededor de 5 cm x 5 cm) con tijeras.
- Moler suavemente pero a fondo la mitad del tejido de la....
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Resultados
Al finalizar el paso 1 del protocolo, uno debería poder ver fácilmente una cantidad considerable de material de plastoglóbulo/gota de lípidos flotando sobre (o cerca) de la capa superior del cojín de sacarosa (Figura 1B-C). Otras fracciones también podrían ser recogidas en esta etapa. Por ejemplo, los tilacoides se granularán y se pueden volver a suspender con el medio R 0,2 para análisis posteriores. Después de la centrifugación posterior, se obtendrán plas.......
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Discusión
Para minimizar los cambios fisiológicos/bioquímicos en el material y proteger ciertos pigmentos fotolípidos y termolábiles que son un componente rico en plastoglobulos, es fundamental realizar el aislamiento a 4 °C y protegido de la luz. Como se indicó anteriormente, los pasos iniciales se realizan en la cámara frigorífica bajo una lámpara de seguridad utilizando una bombilla emisora de color verde. Los pasos posteriores realizados en el laboratorio son bajo luces tenues y utilizan hielo o centrifugación refrigerada. Por.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
La investigación en el grupo de laboratorio de Lundquist está respaldada por subvenciones de la NSF (MCB-2034631) y USDA (MICL08607) a P.K.L. Los autores agradecen a la Dra. Carrie Hiser (MSU) por su apoyo en el desarrollo del método de aislamiento de plastoglóbulos cianobacterianos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbato | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glicerofosfato. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Albúmina sérica bovina | Proliant Biológico | 68700 | |
| Quimostatina | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| Francés Célula de presión (modelo FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptina | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Cloruro de magnesio | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Incubadora de agitación Multitron | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Hidróxido de potasio | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Cisteína reducida | MP Biochemicals | 101444 | |
| fluoruro de sodio | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Ortovanadato de sodio | Sigma Aldrich | 450243 | |
| pirofosfato de sodio · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| sacarosa | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescente Gro-Lux bombilla de tubo, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrífuga | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Licuadora comercial |
| Zea mays | N/A | N/A |
Referencias
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029(2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Ara....
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Reimpresiones y permisos
