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Los neutrófilos funcionan como la primera línea de defensa celular en una respuesta inmune innata mediante el empleo de diversos mecanismos, como la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE). Este estudio analiza los cambios morfológicos y de composición en los NET inducidos por estímulos microbianos y químicos utilizando metodologías estandarizadas in vitro para la inducción y caracterización de NET con células humanas. Los procedimientos descritos aquí permiten el análisis de la morfología NET (lítica o no lítica) y la composición (estructuras ADN-proteína y actividad enzimática), y el efecto de los factores solubles o el contacto celular sobre dichas características. Además, las técnicas descritas aquí podrían modificarse para evaluar el efecto de los factores solubles exógenos o el contacto celular en la composición de NET.
Las técnicas aplicadas incluyen la purificación de células polimorfonucleares de sangre periférica humana utilizando un gradiente de doble densidad (1.079-1.098 g/mL), garantizando una pureza y viabilidad óptimas (≥ 95%) como lo demuestra la tinción de Wright, la exclusión de azul de tripano y la citometría de flujo, incluido el análisis FSC versus SSC y la tinción 7AAD. La formación de NET se induce con estímulos microbianos (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Candida albicans) y químicos (acetato de forbol miristato, HOCl), y los NET se caracterizan por tinción de ADN-DAPI, inmunotinción para el péptido antimicrobiano catelicidina (LL37) y cuantificación de la actividad enzimática (elastasa de neutrófilos, catepsina G y mieloperoxidasa). Las imágenes se adquieren a través de microscopía de fluorescencia y se analizan con ImageJ.