Análisis morfológico y composicional de trampas extracelulares de neutrófilos inducidas por estímulos microbianos y químicos

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para la inducción y análisis de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) in vitro . La cuantificación del ADN, la catelicidina (LL37) y la actividad enzimática arrojó datos que muestran la variabilidad en la composición y morfología de los NET inducidos por estímulos microbianos y químicos en condiciones controladas similares.

Resumen

Los neutrófilos funcionan como la primera línea de defensa celular en una respuesta inmune innata mediante el empleo de diversos mecanismos, como la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE). Este estudio analiza los cambios morfológicos y de composición en los NET inducidos por estímulos microbianos y químicos utilizando metodologías estandarizadas in vitro para la inducción y caracterización de NET con células humanas. Los procedimientos descritos aquí permiten el análisis de la morfología NET (lítica o no lítica) y la composición (estructuras ADN-proteína y actividad enzimática), y el efecto de los factores solubles o el contacto celular sobre dichas características. Además, las técnicas descritas aquí podrían modificarse para evaluar el efecto de los factores solubles exógenos o el contacto celular en la composición de NET.

Las técnicas aplicadas incluyen la purificación de células polimorfonucleares de sangre periférica humana utilizando un gradiente de doble densidad (1.079-1.098 g/mL), garantizando una pureza y viabilidad óptimas (≥ 95%) como lo demuestra la tinción de Wright, la exclusión de azul de tripano y la citometría de flujo, incluido el análisis FSC versus SSC y la tinción 7AAD. La formación de NET se induce con estímulos microbianos (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Candida albicans) y químicos (acetato de forbol miristato, HOCl), y los NET se caracterizan por tinción de ADN-DAPI, inmunotinción para el péptido antimicrobiano catelicidina (LL37) y cuantificación de la actividad enzimática (elastasa de neutrófilos, catepsina G y mieloperoxidasa). Las imágenes se adquieren a través de microscopía de fluorescencia y se analizan con ImageJ.

Introducción

Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en el torrente sanguíneo, desempeñando un papel esencial durante la eliminación de agentes patógenos por varios mecanismos, incluyendo la liberación de grandes estructuras de cromatina compuestas de ADN y varias proteínas antibacterianas nucleares, citoplasmáticas y granulares ^1,2. El antecedente directo que describe este papel antimicrobiano de los neutrófilos fue elaborado por Takei et ^al.3 en 1996. Estos autores relataron una nueva forma de muerte diferente de la apoptosis y necroptosis en neutrófilos, mostraron cambios morfológicos q....

Protocolo

Las muestras de sangre se obtuvieron como donaciones de participantes clínicamente sanos después del consentimiento informado. Todos los experimentos se realizaron con el permiso del Comité de Ética en Investigación Humana de la Facultad de Ciencias Bioquímicas de la Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca.

NOTA: Los criterios de inclusión en el estudio fueron sexo y edad indistintos, y clínicamente sanos de acuerdo con las respuestas de los participantes a un cuestionario antes de tomar una muestra de sangre. Se realizó un análisis hematológico para determinar el recuento celular y descartar infecciones o anemia, así como la prueba ....

Resultados

Pureza y viabilidad de los neutrófilos
Las fases celulares dinámicas se visualizan en el tubo a partir de la purificación de gradiente de doble densidad. Dentro de estas capas, la capa correspondiente a los granulocitos está por encima de la capa de densidad de 1,079 g/ml, que se distingue de las fases de los mononucleocitos de sangre periférica (PBMC) y eritrocitos (Figura 1A). La morfología de las células purificadas se verificó con la tinción de Wright mediante la obse.......

Discusión

Se debe obtener una población altamente pura de neutrófilos viables para inducir la liberación de TNE, ya que estas células tienen una vida útil ex vivo limitada de 8 h en promedio, un período dentro del cual se deben realizar todos los experimentos. Para ello, la metodología ideal es el gradiente de doble densidad para optimizar el tiempo de purificación mediante el aislamiento de células no activadas más sensibles a la estimulación exógena, en contraste con el gradiente de Ficoll-Histopaque o las técnicas de s.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de 24 pocillos para cultivo celular	Corning	3526
7-aminoactinomicina D (7-AAD)	BD Pharmingen	51-668981E
96 Placa de pocillos para cultivo celular	Costar	3596	Agitador de fondo plano
	CRM Globe	CRM-OS1
Anticuerpo LL37	Santa Cruz Biotechnology	sc-166770
Sangre tubos de recolección	BD VACUTAINER	368171	K2 EDTA 7,2 mg
Carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE)	Sigma-Aldrich	21878
Centrífuga	Hettich	1406-01
Cubreobjetos	Madesa	M03-CUB-22X22	22 mm x 22 mm
Dulbecco´ Solución salina tamponada con fosfato (DPBS)	Caisson	1201022
Falcon tubos 50 mL	Tubos	430829
	Miltenyi Biotec		5 mL - Sin tapones
FlowJo Software	BD Biosciences	Analice los datos de citometría
flujo Microscopio de fluorescencia	DM 2000	LEICA
Fluoroshield con DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Incubadora	NUAIRE	UN-4750
MACSQuante	Miltenyi Biotec		Citómetro de flujo
Fotómetro lector de microplacas Clarkson	Laboratory - CL
Microtubos 1.5 mL	Zhejiang Runlab Tech	35200N	broche de alambre
Minitab Software	Minitab		análisis estadístico
Agujas	BD VACUTAINER	301746	Diámetro 1,34 mm
Microscopio óptico	VELAB	VE-B50
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	Solución para gradiente de densidad
Solución salina tamponada con fosfato (10x)	Caisson	PBL07-500ML
Tubos de cultivo Pyrex	CORNING	CLS982025	N° 9820
RPMI 1640 1x	Corning	10-104-CV	contiene Glutagro
Slides	Madesa	PDI257550	22 mm x 75 mm
Trypan Blue solution 0.4%	SIGMA	T8154-100ML