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Artículo de método

Análisis de la afluencia de calcio inducida por receptores de células T en células T murinas primarias mediante citometría de flujo de espectro completo

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DOI:

10.3791/64526

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16 de diciembre de 2022

 ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado-Anschutz School of Medicine

En este artículo

Resumen

La afluencia de calcio, una medida de la señalización de las células T, es una forma efectiva de analizar las respuestas a la estimulación del receptor de células T. Este protocolo para multiplexar Indo-1 con paneles de anticuerpos dirigidos a moléculas de superficie celular aprovecha las capacidades altamente flexibles de la citometría de flujo de espectro completo.

Resumen

La afluencia de calcio en respuesta a la estimulación del receptor de células T es una medida común de la señalización de células T. Se han desarrollado varios colorantes indicadores de calcio para evaluar la señalización de calcio mediante citometría de flujo de paso de banda. Este protocolo está diseñado para medir las respuestas de calcio en células T murinas primarias utilizando citometría de flujo de espectro completo. Los esplenocitos totales se marcan con el colorante indicador de calcio ratiométrico Indo-1, junto con un panel de anticuerpos conjugados con fluorocromo contra moléculas de la superficie celular. Aprovechar las capacidades de la citometría de flujo de espectro completo proporciona una plataforma para utilizar una amplia gama de tinciones de superficie celular en combinación con Indo-1. Las células se analizan en tiempo real a 37 °C antes y después de la adición de un anticuerpo anti-CD3 para estimular el receptor de células T. Después de desmezclar las señales espectrales, se calcula la proporción de Indo-1 unido a calcio libre y se puede visualizar a lo largo del tiempo para cada población cerrada de esplenocitos. Esta técnica puede permitir el análisis simultáneo de las respuestas de calcio en poblaciones celulares múltiples.

Introducción

La afluencia de calcio inducida por receptores de células T (TCR) es una medida útil de la activación de células T y se usa con frecuencia para determinar si una población de células T tiene respuestas deterioradas en los pasos proximales de la vía de señalización TCR1. Las mediciones de la afluencia de calcio generalmente se realizan marcando previamente las células T con uno o un par de colorantes indicadores fluorescentes de calcio, y luego examinando las señales fluorescentes utilizando citometría de flujo en tiempo real después de la reticulación TCR 2,3,4. Indo-1, un colorante de calcio métrico de relación, es excitado por el láser UV con emisiones máximas en dos longitudes de onda diferentes dependiendo de la unión al calcio5, y es un colorante indicador comúnmente utilizado para el análisis de citometría de flujo de las respuestas de calcio en linfocitos vivos. Como el perfil de emisión de Indo-1 es bastante amplio, puede ser difícil combinar la evaluación de Indo-1 con el análisis simultáneo de múltiples marcadores de superficie celular mediante citometría de flujo de paso de banda. Esta limitación restringe la utilización del análisis de citometría de flujo de las respuestas de calcio a poblaciones prepurificadas de células T o a poblaciones identificadas por un conjunto limitado de moléculas de superficie celular.

Para abordar las limitaciones de medir las respuestas de calcio en poblaciones heterogéneas de linfocitos primarios mediante citometría de flujo de paso de banda, se desarrolló un protocolo para medir la fluorescencia Indo-1 mediante citometría de flujo de espectro completo. Este método permite multiplexar Indo-1 con paneles de anticuerpos dirigidos a moléculas de la superficie celular, aprovechando las capacidades altamente flexibles de la citometría de flujo de espectro completo. La ventaja de utilizar la citometría de flujo de espectro completo sobre la citometría de flujo convencional es su capacidad para distinguir las señales fluorescentes de colorantes altamente superpuestos, aumentando así el número de marcadores de superficie que se pueden evaluar simultáneamente en cada muestra. La citometría de flujo convencional utiliza filtros de paso de banda y está restringida a un fluorocromo por sistema detector6. La citometría de flujo de espectro completo recoge señales en todo el espectro del fluorocromo utilizando 64 detectores en un sistema de citometría de flujo espectral de cincoláseres 7,8. Además, la citometría de flujo de espectro completo aprovecha los detectores APD (Avalanche Photo Diode) que tienen una mayor sensibilidad en relación con los detectores de tubos fotomultiplicadores presentes en los citómetros de flujo convencionales8. En consecuencia, este enfoque es ideal para las poblaciones de células heterogéneas, como las células mononucleares de sangre periférica o las suspensiones murinas de células de órganos linfoides secundarios, ya que elimina la necesidad de aislar poblaciones específicas de células T antes del marcado del colorante de calcio. En cambio, los perfiles de expresión del marcador de superficie celular y la activación por citometría de flujo después de la recopilación de datos se pueden usar para evaluar las respuestas al calcio en cada población de interés. Como se muestra en este informe, Indo-1 se puede combinar fácilmente con ocho anticuerpos conjugados con fluorocromo, lo que resulta en un total de 10 firmas espectrales únicas. Además, este método se puede aplicar fácilmente a mezclas de células de líneas de ratón congénicamente distintas, lo que permite el análisis simultáneo de las respuestas de calcio en células T de tipo salvaje en comparación con las de una línea de ratón dirigida a genes.

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Protocolo

Los ratones se mantuvieron en el campus médico Anschutz de la Universidad de Colorado de acuerdo con los protocolos de IACUC. Todos los ratones fueron sacrificados de acuerdo con los estándares de AAALAC.

1. Preparación de células inmunes del bazo del ratón

NOTA: Eutanasia a ratones ingenuos con eutanasia deCO2 . Los ratones C57BL / 6 comprados en Jackson Laboratories y criados internamente se utilizan para experimentos a las 6-12 semanas de edad. Tanto los ratones machos como las hembras se utilizan para experimentos.

  1. Desinfecte la piel del ratón con etanol al 70% para reducir la posibilidad de que los contaminantes externos entren en la muestra.
  2. Diseccionar el bazo del ratón con herramientas de disección, tijeras quirúrgicas y fórceps. Recolecte el bazo y coloque el bazo desprendido en un tubo cónico de 50 ml con ~ 5 ml de medios RPMI completos (cRPMI) en hielo.
    NOTA: El RPMI completo está compuesto por 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina.
    1. Para cosechar el bazo del ratón, haga una incisión de 5 cm en el pelaje y la piel a lo largo del lado izquierdo del ratón a medio camino entre las patas delanteras y traseras con tijeras. Abra la cavidad corporal ~ 5 cm y retire el bazo con fórceps. El bazo es del color de un frijol y es más largo y plano que el riñón vecino.
  3. Verter el contenido del paso 1.2 en un filtro estéril de 70 μm conectado a un nuevo tubo cónico de 50 ml. Separe mecánicamente el bazo en una suspensión de una sola célula empujando el bazo a través del filtro con un émbolo de jeringa de 5 ml hasta que no quede pulpa de bazo en la superficie del filtro.
  4. Granular los esplenocitos utilizando una centrífuga de encimera de rotor basculante a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
  5. Decantar cuidadosamente el sobrenadante. Los esplenocitos granulados permanecen en el fondo del tubo cónico de 50 ml.
  6. Para eliminar los glóbulos rojos, vuelva a suspender los esplenocitos granulados en 1 ml de tampón de lisis ACK durante 3 minutos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mezclar bien.
  7. Apague el tampón de lisis ACK con 15 ml de cRPMI.
  8. Granular los linfocitos como se indica en el paso 1.4.
  9. Vuelva a suspender la suspensión celular en 5 ml de cRPMI en un tubo cónico de 50 ml. Coloque las muestras en hielo.
    1. Para contar las células, transfiera 10 μL de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 0,6 ml y diluya en una proporción de 1:1 con la solución de azul de tripano. Luego, transfiéralo a un hemocitómetro o sistema automatizado de conteo celular.
  10. Después de contar, dependiendo de la concentración celular en suspensión celular como en el paso 1.9, granular las celdas en una centrífuga de mesa a 500 x g a 4 °C durante 5 min para prepararse para la adición de medios cRMPI que contengan colorante éster Indo-1 AM.
  11. Calcular el volumen para la resuspensión de las células para lograr 10-12 x 106 células/ml. Esta es una concentración de 2x del recuento total de células requerido.
  12. Vuelva a suspender las celdas en el volumen de cRPMI calculado en el paso 1.11. Coloque las células a 37 °C con 5% deCO2 en un tubo cónico de 50 ml con la tapa ventilada o en una placa de cultivo de tejidos.

2. Colorante ratiométrico Indo-1 y etiquetado de anticuerpos fluorescentes

  1. Según las instrucciones del fabricante, añadir 50 μL de DMSO en un vial que contenga 50 μg de Indo-1 AM. La concentración de la solución madre es de 1 μg/μL.
    NOTA: DMSO se proporciona en micro-viales con el kit para evitar cualquier oxidación de DMSO.
  2. Diluir la alícuota madre (1 μg/μL) en el volumen experimental apropiado (establecido en 1.11) de cRPMI a una concentración de 6 μg/ml, una concentración de 2x. No almacene Indo-1 en una solución acuosa.
    NOTA: Se pueden usar otros tampones con calcio agregado dependiendo de las necesidades celulares.
  3. Ponga a un lado el soporte completo con Indo-1 en un baño maría a 37 °C.
    NOTA: Utilice la concentración mínima de éster Indo-1 AM necesaria para obtener una señal adecuada. Esto debe ajustarse para diferentes tipos de células. Típicamente, una concentración entre 3-5 μM es suficiente. Para las células T primarias, la carga de células con Indo-1 a una concentración >5 μg/ml aumenta la intensidad fluorescente media (MFI) por encima de un log de 6 en los citómetros de flujo espectral. Si esto ocurre, disminuya la intensidad del láser UV y titule el Indo-1 a una concentración más baja.
  4. Diluir la suspensión celular previamente preparada (en el paso 1.12), 1:1 en cRPMI, incluyendo los medios 2x Indo-1 fabricados en el paso 2.2. Asegúrese de que las células estén en una concentración entre 5-6 x 106/mL.
    NOTA: No cargue con tinte el control de manchas individuales sin teñir ni los controles de celda de tinción única con Indo-1. Agregar Indo-1 a los controles de anticuerpos de tinción única creará una muestra multicolor debido al Indo-1 agregado a las células teñidas individuales. Incluya el control agregado de EGTA indo-1 (sin calcio) a la placa de muestra creada en el paso 2.6.
  5. Agregue 1 ml de células/pozo/condición experimental en una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos.
  6. Cree un solo control teñido para la muestra Indo-1 (libre de calcio) utilizando células previamente cargadas con colorante Indo-1 y agregue EGTA a una concentración final de 2 mM. EGTA quelará el calcio en la suspensión celular, dando una muestra de control más limpia.
    1. Cree un control positivo de Indo-1 (Indo-1 unido al calcio) agregando 50 μM de ionomicina a la suspensión celular cargada de colorante en el citómetro de flujo. La ionomicina es un ionóforo de calcio permeable a la membrana que se une a los iones de calcio y facilita la transferencia de iones de calcio a las células.
  7. Crear un pozo para el control biológico negativo sin fluoróforos ni colorante Indo-1.
  8. Crear un pozo para controles de tinción única para cualquier población celular adicional de interés (anticuerpos definidos por el usuario) utilizando fluoróforos conjugados con anticuerpos en un diseño de panel de citometría de flujo. Estos no incluirán el tinte ratiométrico Indo-1.
  9. Agregue el anticuerpo bloqueador del receptor Fc (~ 2 μg / 1 x 106 células), según las instrucciones del fabricante, antes de agregar anticuerpos conjugados con fluorocromo adicionales para la tinción de superficie.
  10. Incubar la placa durante 45 min a 37 °C con 5% deCO2.
  11. Vuelva a suspender las células en una placa de 12 pocillos golpeando suavemente la placa cada 15 minutos.
  12. Mezcle y retire todo el volumen de células suspendidas en el medio de la placa de 12 pocillos. Luego agregue la suspensión celular a los tubos de microcentrífuga de 1.7 ml.
  13. Granular las células en una microcentrífuga a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Decantar el sobrenadante y lavar las células añadiendo 1 ml de cRPMI precalentado. Pellet de nuevo y decantar el sobrenadante.
    NOTA: El lavado de las células elimina cualquier anticuerpo bloqueador FC restante.
  14. Resuspender las células en 1 ml de cRPMI en tubos de microcentrífuga de 1,7 ml e incubar cada tubo a 37 °C durante 30 minutos adicionales al 5% deCO2, dejando la parte superior del tubo ligeramente abierta para permitir el intercambio de gases. Esto permite la desesterificación completa de los ésteres AM intracelulares.
  15. Transfiera las células de nuevo a una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos, si es necesario. Se pueden agregar anticuerpos conjugados con fluorocromo titulados adicionales definidos por el usuario en una fase de reposo.
    NOTA: Los marcadores utilizados en el panel de métodos incluyen: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 y tetrámero CD1d/α-galcer. Los marcadores se eligen para analizar subconjuntos de células T.
    1. Cree una mezcla maestra de todos los anticuerpos conjugados con fluorocromo definidos por el usuario de acuerdo con los tipos de células de interés a un volumen previamente titulado en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
    2. Agregue una mezcla maestra calculada para 1 ml del volumen celular, dependiendo de los anticuerpos titulados contra las células en reposo.
      NOTA: La ventaja de teñir en el paso 2.15 en lugar del paso posterior 2.18 es que la tinción en el paso 2.15 disminuirá el tiempo total de incubación para el experimento. Sin embargo, la tinción en un volumen total de 1 ml en el paso 2.15 aumenta el uso de anticuerpos.
  16. Después del reposo, granular las células a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Las células en una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos se pueden peletizar en la placa con un accesorio de centrífuga de placa. De lo contrario, granule las células en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
  17. Lavar las células resuspendiendo el pellet en 1 ml de cRPMI frío a 4 °C y volver a granular las células como en el paso 2.16. Coloque las celdas en hielo.
    NOTA: Si las células de tinción superficial por separado, después de la desesterificación en el paso 2.18, se necesita menos volumen de anticuerpos. La tinción superficial en este paso se puede realizar después de la fase de reposo en tampón de flujo frío (1x DPBS con FBS agregado al 1%), utilizando anticuerpos definidos por el usuario, en hielo durante 30 min. Lave las células después de la tinción en cRPMI como en el paso 2.17.
    1. Agregue la tinción de viabilidad Ghost540 diluida 1:7,500 en DPBS a las muestras de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El calor mata las células a 55 °C en un bloque de calentamiento para un solo control vivo / muerto teñido.
      NOTA: La viabilidad funcional de la tinción de colorante para eliminar las células muertas en el análisis citométrico de flujo se realiza sin FBS. FBS puede interactuar con colorantes de amina según las instrucciones del fabricante.
  18. Vuelva a suspender muestras individuales en 500 μL de cRPMI (libre de rojo de fenol) utilizando un tubo de flujo de poliestireno de 5 ml con una tapa.
    NOTA: Las células se pueden dejar a 4 °C durante un máximo de una hora.
  19. Calentar cada tubo de 5 ml que contenga células, individualmente, a 37 °C usando un baño de perlas durante 7 minutos antes del análisis en el citómetro de flujo manteniendo el tiempo constante entre las muestras. Utilice un temporizador.

3. Tubo de baño de cuentas: mantenimiento de la temperatura durante el análisis de flujo de calcio

  1. Agregue cuentas de baño a un pequeño baño de agua, sin agua agregada; calentamiento hasta 37 °C.
  2. Corte cuidadosamente un tubo cónico de 50 ml por la mitad, en la marca de 25 ml, con una cuchilla de afeitar; Deseche la parte superior del tubo.
  3. Llene el tubo cortado por la mitad 3/4 del camino con cuentas de baño.
  4. Coloque el tubo creado en el paso 3.2 en el baño de cuentas creado en el paso 3.1. Llevar el tubo y las perlas a 37 °C.
  5. Enchufe el baño de perlas en una toma de corriente junto al citómetro de flujo para mantener la temperatura en preparación para el análisis de muestras.
  6. Agregue un corte de rejilla de espuma de poliestireno cónico de 50 ml para sostener un tubo para colocar el tubo en su lugar mientras se ejecuta en el citómetro de flujo. Esto eliminará la necesidad de sostener manualmente el tubo durante la duración del análisis de la curva.

4. Adquisición de afluencia de calcio mediante análisis citométrico de flujo

  1. Inicie sesión en el software del citómetro de flujo en un analizador de flujo.
  2. Haga clic en la pestaña Biblioteca para agregar etiquetas fluorescentes Indo-1 (unido al calcio) e Indo-1 (sin calcio). Seleccione Etiquetas fluorescentes en el menú de software de la izquierda. Seleccione láser UV en grupos de etiquetas fluorescentes y haga clic en +agregar para agregar un nombre de etiqueta fluorescente (Indo-1 (unido al calcio) / Indo-1 (sin calcio)) a la biblioteca. Elija la longitud de onda de excitación láser y la longitud de onda de emisión, y luego haga clic en Guardar. Continúe con la configuración experimental.
    NOTA: Indo-1 es excitado por el láser UV a una longitud de onda de 355 nm. La longitud de onda de emisión de Indo-1 (unida al calcio) es de 372 nm. La longitud de onda de emisión de Indo-1 (libre de calcio) es de 514 nm.
  3. Haga clic en la pestaña Adquisición. Abra / cree un nuevo experimento y agregue las etiquetas fluorescentes deseadas al experimento.
  4. Cree un grupo de referencia y un nuevo grupo de muestra para el experimento. Etiquete tanto las muestras como los grupos de referencia según sea necesario.
  5. En la pestaña Adquisiciones , establezca los eventos que se registrarán al máximo: 10.000.000.
  6. Ajuste el volumen de parada al volumen máximo: 3.000 μL.
  7. Ajuste el tiempo de parada al tiempo máximo: 36.000 s.
  8. Adquiera controles de tinción única para anticuerpos conjugados definidos incluidos en el panel multicolor.
  9. Adquiera controles de tinción única para el tinte funcional Indo-1.
    1. Añadir 50 μM de ionomicina al control positivo Indo-1 unido al calcio. Vórtice para mezclar. Agregue el tubo de flujo al puerto de inyección de muestra y haga clic en Grabar.
    2. Agregue el control negativo Indo-1 libre de calcio al citómetro de flujo y haga clic en Grabar. EGTA se agregó en el paso 2.6.
    3. Desmezcle los controles de una sola mancha haciendo clic en el botón Desmezclar .
      NOTA: Todos los controles de tinción única de todos los anticuerpos conjugados y colorantes funcionales deben registrarse antes de desmezclar las muestras. Para que el botón Desmezclar funcione, primero deben grabarse todos los controles de referencia. La mezcla se puede hacer antes o después de la recolección de muestras.
  10. Una vez completada la desmezcla, cree gráficos secuenciales utilizando la hoja de cálculo sin mezclar. SSC-A versus FSC-A eliminando restos de la muestra, SSC-A versus SSC-H para eliminar dobletes. Esto es seguido por una puerta de limpieza de viabilidad junto con una mayor activación de las poblaciones de interés. Para crear puertas, haga clic en Trazar. Agregue una gráfica a la hoja de cálculo y haga doble clic dentro de la puerta para crear una población cerrada aguas abajo. Continúe hasta que se contabilicen todas las poblaciones de interés.
  11. Muestras de control teñidas individuales calientes (desde los pasos 2.6-2.9 en la sección Indo-1 colorante ratiométrico y etiquetado de anticuerpos fluorescentes) hasta 37 °C para análisis secuencial. Configure el software de citometría de flujo.
  12. Deje correr agua DI en el citómetro durante 2-3 minutos para garantizar la estabilidad fluídica del citómetro de flujo.
  13. Configure gráficos secuenciales en la hoja de cálculo sin mezclar creando puertas con los botones Polígono, Rectángulo o Elipse. Puerta para incluir la población de interés (es decir, linfocitos que usan SSC-A vs. FSC-A [discriminación de tamaño / linfocitos]). Las poblaciones negativas aparecen agrupadas alrededor de cero, mientras que las poblaciones positivas se pueden visualizar aumentando la IMF. Las poblaciones de interés serán definidas por el usuario en función de la cuestión biológica.
  14. Haga doble clic dentro de la puerta creada y cambie los parámetros del eje Y y del eje X a SSC-A frente a SSC-H (discriminación de singletes). Complete la definición de los parámetros del eje haciendo clic izquierdo en las palabras del eje.
  15. Cree una gráfica con SSC-A frente a la señal de colorante de viabilidad (parámetros de compuerta de viabilidad). Puerta en células vivas, que son negativas para la tinción de colorante de amina. Las células vivas, negativas para la tinción muerta viva, se agruparán en la marca 0 en los ejes Y y X.
  16. Haga doble clic en la gráfica interior para crear una nueva gráfica que contenga solo linfocitos vivos de una sola célula. Cambie el eje Y a Indo-1 (calcio unido) (V1) y/o Indo-1 (calcio libre) (V7) frente al tiempo en el eje X para la visualización de la afluencia de calcio.
  17. Coloque la muestra biológica calentada en la máquina SIT y ejecute las muestras a 2,500-3,000 eventos / s en el medio para permitir la visualización de la afluencia de calcio en poblaciones de número limitado de células (por ejemplo, iNKT).
    NOTA: Al resuspender las células a una concentración de 1 x 106/ml, los eventos celulares recogidos a un caudal medio deben ser iguales a 2.500-3.000 eventos/s. Baje el caudal bajo control de adquisición haciendo clic en el menú desplegable o diluya la muestra si la suspensión celular tiene una concentración aumentada. Ejecutar las muestras a un alto caudal puede aumentar la propagación de la señal de un fluoróforo a otros fluoróforos en el panel.
  18. Añadir el siguiente tubo al baño de perlas para calentar a 37 °C.
  19. En el Control de adquisición, pulse Grabar para registrar los datos iniciales durante 30 s para obtener un nivel basal de señalización de calcio en la muestra.
  20. En el Control de adquisición, haga clic en Detener y retire el tubo del puerto de inyección de muestras (SIP).
  21. Agregue 30 μg de anti-CD3 no conjugado directamente en el tubo de muestra para iniciar la afluencia de calcio. La concentración final por tubo es de 60 μg/ml.
    NOTA: No hay ningún paso de lavado después de la adición de anti-CD3.
  22. Vuelva a colocar el tubo en el SIP de la máquina lo más rápido posible y pulse Grabar en el software.
  23. Registre los datos durante 7 minutos, observando el tiempo transcurrido bajo los controles de adquisición en el software, para observar el curso temporal de la afluencia de calcio dentro de las poblaciones de la muestra.
  24. Después de 7 minutos, presione Detener en el software y agregue 1 μg / ml de ionomicina. Registrar durante 30 s para obtener la máxima señal de calcio en las células de interés. Para limitar el arrastre de ionomicina a la siguiente muestra, complete dos descargas SIT en el instrumento entre muestras.
  25. Continúe con la siguiente muestra y repita el flujo de trabajo hasta que se hayan recopilado todas las muestras.
  26. Guarde el experimento y haga clic en el archivo zip de exportación . Los archivos sin mezclar (.fsc) se cargan en un software externo de análisis de citometría de flujo.

5. Análisis de la curva de calcio

  1. Usando un software de análisis6 para citometría de flujo, convierta las señales fluorescentes Indo-1 a una proporción para mediciones de calcio de lapso de tiempo. Derive parámetros en la pestaña de herramientas insertando referencias Indo-1 (unido al calcio)/Indo-1 (calcio libre) utilizando una escala lineal. Establezca el mínimo en cero y el máximo de acuerdo con la afluencia de la proporción de calcio, generalmente alrededor de 10. La proporción máxima varía según el tipo de célula y la MFI de Indo-1.
  2. Resalte el parámetro seleccionado. En herramientas, agregue análisis cinético para elegir el parámetro haciendo clic en la pestaña Cinética . Establezca el eje Y en derivado.
  3. Seleccione MFI (intensidad fluorescente media) en la pestaña Cinética.
  4. Agregue suavizado gaussiano, si lo desea. Para agregar suavizado gaussiano, seleccione la opción en el menú desplegable de estadísticas del software de análisis de flujo. Se puede agregar suavizado gaussiano para suavizar la visualización de la curva de afluencia de calcio del análisis.
  5. Crear múltiples rangos para estadísticas a lo largo del curso de tiempo de flujo de calcio para comparaciones biológicas dentro de las muestras.
  6. Arrastre las muestras al editor de diseño y agregue las estadísticas como desee. El análisis estadístico varía dependiendo de la cuestión biológica. Para fines de publicación, se analizan múltiples réplicas utilizando t-test o ANOVA.
  7. Para un momento de análisis de tiempo, coloque la puerta en un momento específico en el tiempo a lo largo del flujo de calcio. Examine los marcadores de superficie deseados y la puerta en la población de interés; luego, evalúe un diagrama de puntos bidimensional de Indo-1 (libre de calcio) versus Indo-1 (unido al calcio) para células cerradas dentro de ese momento en la región de tiempo.

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Resultados

El flujo de trabajo experimental para evaluar las respuestas de calcio en células T murinas primarias utilizando un colorante ratiométrico Indo-1 con tinciones superficiales de multiplexación se muestra en la Figura 1. Después de cosechar y procesar los esplenocitos de ratón en una suspensión de una sola célula, las células se tiñen con un éster Indo-1 AM y se tiñen superficialmente con anticuerpos ligados al fluorocromo. Una vez que se completa la carga de colorante y la tinción de anticuer...

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Discusión

Este protocolo describe un ensayo optimizado diseñado para medir las respuestas de calcio en células T murinas primarias cargadas con colorante indicador ratiométrico Indo-1 titulado utilizando citometría de flujo de espectro completo 7,8. La ventaja de realizar ensayos de flujo de calcio utilizando citometría de flujo de espectro completo es la capacidad de multiplexar la tinción del marcador celular de superficie en combinación con la evaluación de la fluoresce...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses contrapuestos que declarar.

Agradecimientos

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Muchas gracias a nuestros colegas de Cytek por las continuas discusiones sobre el análisis citométrico espectral completo en el software Aurora y SpectroFlo. Las figuras fueron creadas con BioRender.com.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas tratadas con TC de 12 pocillosCell Treat229111
50 mL cónicoGreiner Bio141-12-17-0350 mL Tubos de centrífuga de polipropileno con tapa
5mL tubos de flujo de poliestirenoCorning352052
jeringa de 5 mLJeringa BD309646solo se usa el émbolo Sheith se descarta
Filtro de 70uMGreiner bio1542070
aCD3 (17A2)Biolegend100202
tampón de lisis AKCGibcoA1049201
Aurora Zigcómetro espectralhttps://cytekbio.com/pages/aurora
Bath BeadsColeparmerArtículo # UX-06274-52
CD19 PETonbo50-0193-U100
CD1d Tetrámero APCNIH
CD25 PECy7ebioscience15-0251
CD4 APC Cy7Tonbo25-0042-U100
CD8a FITCebioscience11-0081-85
Incubadora de célulasHerramientas de
pinzasMcKesson#487593Pinzas de tejido McKesson Adson 4-3/4 pulgadas de longitud Acero inoxidable de grado de oficina No estéril No bloqueante Mango de pulgar 1 x 2 dientes
Herramientas de disección TijerasMcKesson#970135Tijeras de operación McKesson Argent™ 4-1/2 pulgadas de acero inoxidable de grado quirúrgico Mango de anillo de dedo Punta afilada recta / punta afilada
DPBS 1xGibco14190-136DPBS 
EGTAFisherNC1280093
FBSHyclondSH30071.03lote AE29165301
FlowJo Softwarehttps://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dyeebioscience65-085-39Colorante de carga de calcio 
ionomicinaMillipore407951-1mg
Fantasma vivo/muerto 540Tonbo13-0879-T100
Tubos de microcentrífuga 1,7 ml LightLabsA-7001
Penicilina/Estreptomicina/L-glutaminaGibco10378-016
PRN694Med Chem ExpressHy-12688
Anti-ratón purificado CD16/CD32 (escudo FC) ( 2.4G2)Tonbo70-0161-M001FC Bloque
RPMIGibco1875093 + rojo
fenol RPMI libre de fenolGibco11835030 -rojo fenol
Centrífuga de mesaBeckman CoulterAllegra612
TCRβ PerCP Cy5.5ebioscience45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5ebioscience15-5961-82
Paquete de reactivos Vi-Cell Blu N.ºde producto: C06019Incluye Tripan
Vi-Cell BluBeckman Coulter
Baño de aguaFisher Brand Baño seco
disección científica formal

Referencias

  1. Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
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