El patógeno fúngico humano Cryptococcus neoformans produce una variedad de factores de virulencia (por ejemplo, peptidasas) para promover su supervivencia dentro del huésped. Los nichos ambientales representan una fuente prometedora de nuevos inhibidores naturales de la peptidasa. Este protocolo describe la preparación de extractos de moluscos y la evaluación de su efecto sobre la producción de factores de virulencia fúngica.
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Artículo de método
Evaluación de las propiedades anticriptocócicas putativas de extractos crudos y clarificados de moluscos
En este artículo
Resumen
Resumen
Cryptococcus neoformans es un patógeno fúngico humano encapsulado con una distribución global que infecta principalmente a individuos inmunocomprometidos. El uso generalizado de antifúngicos en entornos clínicos, su uso en la agricultura y la hibridación de cepas han llevado a una mayor evolución de la resistencia. Esta creciente tasa de resistencia contra los antifúngicos es una preocupación creciente entre los médicos y científicos de todo el mundo, y existe una mayor urgencia para desarrollar nuevas terapias antimicóticas. Por ejemplo, C. neoformans produce varios factores de virulencia, incluyendo enzimas intra y extracelulares (por ejemplo, peptidasas) con roles en la degradación de tejidos, regulación celular y adquisición de nutrientes. La interrupción de dicha actividad peptidasa por inhibidores perturba el crecimiento y la proliferación de hongos, lo que sugiere que esta puede ser una estrategia importante para combatir el patógeno. Es importante destacar que los invertebrados como los moluscos producen inhibidores de la peptidasa con aplicaciones biomédicas y actividad antimicrobiana, pero están poco explorados en términos de su uso contra patógenos fúngicos. En este protocolo, se realizó una extracción global de moluscos para aislar posibles inhibidores de peptidasa en extractos crudos y clarificados, y se evaluaron sus efectos contra los factores clásicos de virulencia criptocócica. Este método apoya la priorización de moluscos con propiedades antifúngicas y brinda oportunidades para el descubrimiento de agentes antivirulentes al aprovechar los inhibidores naturales que se encuentran en los moluscos.
Introducción
Cryptococcus neoformans es un patógeno fúngico humano que produce enfermedad grave en huéspedes inmunocomprometidos, como las personas que viven con VIH / SIDA1, y conduce a aproximadamente el 19% de las muertes relacionadas con el SIDA2. El hongo es susceptible a varias clases de antifúngicos, incluyendo azoles, polienos y flucitosina, que ejercen actividad fungicida y fungistática utilizando mecanismos distintos 3,4. Sin embargo, el uso extensivo de antifúngicos en entornos clínicos y agrícolas combinado con la hibridación de cepa....
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Protocolo
1. Extracción de proteínas de moluscos
- Recolectar moluscos de un área natural designada y aprobada (por ejemplo, Speed River, Guelph, Ontario). Para este estudio, se seleccionaron especies nativas e invasoras para evaluar una amplia gama de posibles efectos antifúngicos.
- Rompa suavemente la cáscara de los moluscos (por ejemplo, Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi y Cipangopaludina chinensis) con un mortero, y retire las piezas sólidas con un par de pinzas. Generalmente, 10 moluscos se agrupan para su uso en todo el protocolo.
- Recoger y pesar los órganos. Aproximadamente 15-20 g de muestra es ....
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Resultados
El flujo de trabajo descrito en este documento permite el aislamiento de proteínas y péptidos de moluscos con posibles propiedades antivirulencia contra C. neoformans. Del mismo modo, la evaluación de diferentes formas de extractos (es decir, crudos y clarificados) permite la semipurificación de los compuestos activos potenciales y apoya la evaluación posterior (por ejemplo, proteómica basada en espectrometría de masas). Típicamente, el flujo de trabajo de extracción de proteínas produce soluciones homogeneizada.......
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Discusión
El protocolo de extracción descrito aquí describe el aislamiento de compuestos de moluscos recolectados en Ontario, Canadá, y demuestra una investigación novedosa del uso de extractos de moluscos contra el patógeno fúngico humano, C. neoformans. Este protocolo se suma a un creciente cuerpo de investigación que investiga la actividad de los inhibidores de peptidasa de los invertebrados13. Durante la extracción, algunas muestras de extracto fueron difíciles de filtrar-esterilizar, posibleme.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los miembros del Laboratorio Geddes-McAlister por su valioso apoyo a lo largo de esta investigación y sus comentarios sobre el manuscrito. Los autores reconocen el apoyo financiero de la Ontario Graduate Scholarship and International Graduate Research Award - University of Guelph a D. G.-G y de la Fundación Canadiense de Innovación (JELF 38798) y Ontario Ministry of Colleges and Universities - Early Researcher Award para J. G.-M.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.2 μ m Filtros | VWR | 28145-477 (Norteamérica) | |
| Tubos de 1,5 mL (Safe-Lock) | Tubos Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| Placas de 96 pocillos | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Mezcladora Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrífuga 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resina | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubadora (Estática) | SANYO | No disponible | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| Microscopio DIC | Software | ||
| DIC | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucosa (D-glucosa, anhidra, grado reactivo) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prisma 9 | Dotmatics | ||
| Hemocitómetro | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Sal tampón de fososato pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Lector de placas (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | No disponible | |
| Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisina A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Baño termal | VWR | 76308-834 | |
| Clorhidrato de tiamina | Fisher-Bioreactivos | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Extracto de levadura | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Levadura base de nitrógeno (con aminoácidos) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
Referencias
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adu....
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Reimpresiones y permisos
