Automatización del ensayo de micronúcleos mediante citometría de flujo de imágenes e inteligencia artificial

Summary

El ensayo de micronúcleos (MN) es una prueba bien establecida para cuantificar el daño del ADN. Sin embargo, calificar el ensayo utilizando técnicas convencionales como la microscopía manual o el análisis de imágenes basado en características es laborioso y desafiante. Este artículo describe la metodología para desarrollar un modelo de inteligencia artificial para calificar el ensayo MN utilizando datos de citometría de flujo de imágenes.

Abstract

El ensayo de micronúcleos (MN) es utilizado en todo el mundo por los organismos reguladores para evaluar los productos químicos en busca de toxicidad genética. El ensayo se puede realizar de dos maneras: marcando MN en células binucleadas bloqueadas por citocinesis una vez divididas o células mononucleadas completamente divididas. Históricamente, la microscopía óptica ha sido el método estándar de oro para calificar el ensayo, pero es laborioso y subjetivo. La citometría de flujo se ha utilizado en los últimos años para calificar el ensayo, pero está limitada por la incapacidad de confirmar visualmente aspectos clave de las imágenes celulares. La citometría de flujo de imágenes (IFC) combina la captura de imágenes de alto rendimiento y el análisis automatizado de imágenes, y se ha aplicado con éxito para adquirir rápidamente imágenes y calificar todos los eventos clave en el ensayo MN. Recientemente, se ha demostrado que los métodos de inteligencia artificial (IA) basados en redes neuronales convolucionales se pueden utilizar para calificar los datos de ensayos MN adquiridos por IFC. En este documento se describen todos los pasos para usar el software de IA para crear un modelo de aprendizaje profundo para calificar todos los eventos clave y aplicar este modelo para calificar automáticamente datos adicionales. Los resultados del modelo de aprendizaje profundo de IA se comparan bien con la microscopía manual, lo que permite una puntuación totalmente automatizada del ensayo MN mediante la combinación de IFC e IA.

Introduction

El ensayo de micronúcleos (MN) es fundamental en toxicología genética para evaluar el daño del ADN en el desarrollo de cosméticos, productos farmacéuticos y productos químicos para uso humano 1,2,3,4. Los micronúcleos se forman a partir de cromosomas enteros o fragmentos de cromosomas que no se incorporan al núcleo después de la división y se condensan en cuerpos pequeños y circulares separados del núcleo. Por lo tanto, MN puede ser utilizado como un punto final para cuantificar el daño del ADN en las pruebas de genotoxicidad

Protocol

1. Adquisición de datos mediante citometría de flujo de imágenes

NOTA: Consulte Rodrigues et ^al.16 con las siguientes modificaciones, señalando que las regiones de adquisición que utilizan IFC pueden necesitar ser modificadas para una captura óptima de la imagen:

1. Para el método no Cyt-B, realice un recuento de células utilizando un contador de células disponible comercialmente siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales) en cada cultivo inmediatamente antes del cultivo e inmediatamente después del período de recuperación.
2. Si se ejec....

Results

La figura 1 muestra el flujo de trabajo para usar el software de IA para crear un modelo para el ensayo MN. El usuario carga los archivos .daf deseados en el software de IA, luego asigna objetos a las clases de modelo de verdad del terreno utilizando los algoritmos de etiquetado de clúster asistido por IA (Figura 2) y predicción (Figura 3). Una vez que todas las clases de modelos de verdad básica se han poblado con suficientes objet.......

Discussion

El trabajo presentado aquí describe el uso de algoritmos de aprendizaje profundo para automatizar la puntuación del ensayo MN. Varias publicaciones recientes han demostrado que las herramientas intuitivas e interactivas permiten la creación de modelos de aprendizaje profundo para analizar datos de imágenes sin necesidad de un conocimiento computacional profundo^18,19. El protocolo descrito en este trabajo utilizando un paquete de software basado en interfaz de usu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de centrífuga de 15 mL		Falcon
Cleanser - Coulter Clenz	Beckman Coulter	8546931	Llene el recipiente con 200 mL de limpiador.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine	MilliporeSigma	64-86-8
Filtro de vacío con tapa de botella Corning	MilliporeSigma	CLS430769	0.22 y micro; Filtro m, frasco de 500 mL
Citocalasina B	MilliporeSigma	14930-96-2	Frasco de 5 mg
Deburbujeador - 70% Isopropanol	MilliporeSigma	1.3704	Llene el recipiente con 200 mL de Deburbujeador. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimetilsulfóxido (DMSO)	MilliporeSigma	67-68-5
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1X	EMD Millipore	BSS-1006-B	PBS Ca++MG++ Gratis
Suero fetal bovino	HyClone	SH30071.03
Formaldehído, 10%, libre de metanol, Ultra Pure	Polysciences, Inc.	04018	Esto es lo que se utiliza para el 4% y el 1% de formalina. PRECAUCIÓN: La formalina/formaldehído es tóxica por inhalación y si se ingiere. Irritante para los ojos, el sistema respiratorio y la piel. Puede causar sensibilización por inhalación o contacto con la piel. Riesgo de daños graves en los ojos. Riesgo potencial de cáncer.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Analizador de células Guava Muse	Luminex	0500-3115	Se utilizó un analizador de células Guava Muse de configuración estándar.
Hoechst 33342	Thermo Fisher	H3570	10 mg/mL solución
Manitol	MilliporeSigma	69-65-8
MEM Aminoácidos no esenciales 100X	HyClone	SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II	Luminex, una empresa DiaSorin	100220	Se utilizó una cámara ImageStreamX Mark II de 2 cámaras con los láseres de 405 nm, 488 nm y 642 nm.
Software de análisis MIFC - IDEAS	Luminex, una empresa de DiaSorin	100220	"Software de análisis de imágenes" El software complementario del software MIFC (ImageStreamX MKII)
Software MIFC - INSPIRE	Luminex, una empresa de DiaSorin	100220	"Software de adquisición de imágenes" Este es el software que ejecuta el software MIFC (ImageStreamX MKII)
Amnis AI software	Luminex, una empresa	de DiaSorin100221	"Software de IA" Este es el software que permite la creación de modelos de inteligencia artificial para analizar datos
Mitomicina C	MilliporeSigma	50-07-7
NEAA Mezcla 100x	Lonza BioWhittaker	13-114E
Solución de Penicllina/Estreptomicina/Glutamina 100X	Gibco	15070063 Cloruro
de potasio (KCl)	MilliporeSigma	P9541
Enjuague - Agua ultrapura o agua desionizada	NA	NA	Utilice cualquier agua ultrapura o agua desionizada. Llene el recipiente con 900 mL de enjuague.
RNase	MilliporeSigma	9001-99-4
RPMI-1640 Medio 1x	HyClone	SH30027.01
Funda - PBS	MilliporeSigma	BSS-1006-B	Esto es lo mismo que la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1x  Ca++MG++ gratis.  Llene el recipiente con 900 mL de funda.
Esterilizador de agua estéril	HyClone	SH30529.01
- 0.4%– Hipoclorito al 0,7 %	VWR	JT9416-1	Se trata de un blanqueador de Clorox al 10 % que se puede fabricar mediante el uso de lejía de Clorox con agua. Llene el recipiente con 200 ml de Sterilzer.
Matraz T25	Falcon	353109
matraz T75	Falcon	353136
células TK6	MilliporeSigma	95111735