Este protocolo describe el aislamiento de células madre musculares y progenitores fibroadipogénicos de músculos esqueléticos individuales en ratones. El protocolo incluye la disección de un solo músculo, el aislamiento de células madre mediante clasificación de células activadas por fluorescencia, la evaluación de la pureza mediante tinción de inmunofluorescencia y la medición cuantitativa de la entrada en fase S mediante un ensayo de incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina.
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Artículo de método
Aislamiento de poblaciones de células madre quiescentes de músculos esqueléticos individuales
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Resumen
Resumen
El músculo esquelético alberga distintas poblaciones de células madre adultas que contribuyen a la homeostasis y reparación del tejido. Las células madre del músculo esquelético (MuSC) tienen la capacidad de producir músculo nuevo, mientras que los progenitores fibroadipogénicos (FAP) contribuyen a los tejidos de soporte del estroma y tienen la capacidad de producir fibroblastos y adipocitos. Tanto los MuSC como los FAP residen en un estado de salida reversible prolongada del ciclo celular, llamado quiescencia. El estado de reposo es clave para su función. Las células madre quiescentes se purifican comúnmente a partir de múltiples tejidos musculares agrupados en una sola muestra. Sin embargo, estudios recientes han revelado claras diferencias en los perfiles moleculares y la profundidad de quiescencia de los MuSC aislados de diferentes músculos. El presente protocolo describe el aislamiento y estudio de MuSCs y FAPs de músculos esqueléticos individuales y presenta estrategias para realizar análisis moleculares de activación de células madre. Detalla cómo aislar y digerir músculos de diferentes orígenes de desarrollo, grosores y funciones, como el diafragma, tríceps, gracilis, tibial anterior (TA), gastrocnemio (GA), sóleo, extensor largo de los dedos (EDL) y los músculos maseteros. Los MuSC y FAP se purifican mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y se analizan mediante tinción de inmunofluorescencia y ensayo de incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU).
Introducción
El músculo esquelético tiene una alta capacidad de regeneración debido a la presencia de células madre musculares (MuSC). Los MuSC se encuentran en las miofibras, debajo de la lámina basal, y residen en un estado quiescente de salida prolongada y reversible del ciclo celular 1,2,3,4. Tras la lesión, los MuSCs se activan y entran en el ciclo celular para dar lugar a progenitores amplificadores que pueden diferenciarse y fusionarse para formar nuevas miofibras 2,5. Trabajos previos han....
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Protocolo
El presente protocolo se realizó de acuerdo con las pautas de cuidado de animales en la Universidad de Aarhus y las regulaciones éticas locales.
NOTA: Asegúrese de cumplir con las regulaciones del comité ético local para la experimentación animal y el manejo de muestras de roedores post mortem. Los ratones son una fuente potencial de alérgenos; Si está disponible, encienda la ventilación por extracción y colóquela sobre el espacio de trabajo para evitar la exposición excesiva a alérgenos. Alternativamente, use una máscara facial si el experimento se lleva a cabo regularmente. Este protocolo implica trabajar con objetos punzantes, y se recom....
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Resultados
Siguiendo el protocolo para el aislamiento individual del músculo esquelético (Figura 2), los músculos gracilis, TA, EDL, GA, sóleo, tríceps, masetero y diafragma se aislaron de tres ratones machos suizos criados que habían sido descontinuados de un programa de cría local (Figura 2). Después de la disociación tisular y la tinción de anticuerpos, los MuSC y FAP de los músculos individuales fueron purificados por FACS (Figura 3). La a.......
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Discusión
Varios pasos son clave en la ejecución de este protocolo para lograr buenos rendimientos. Los músculos individuales tienen un volumen pequeño en comparación con la cantidad de músculo utilizado en los protocolos de aislamiento a granel. Esto resulta en un riesgo de que el músculo se seque durante la disección, lo que reduce el rendimiento. Para evitar esto, es importante agregar medio a los músculos inmediatamente después de la disección. Además, si la disección está tomando más tiempo, la piel se puede quitar de una ext.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros en competencia ni conflictos de intereses.
Agradecimientos
La clasificación celular se realizó en la instalación central de FACS, Universidad de Aarhus, Dinamarca. Las figuras se crearon utilizando Biorender.com. Agradecemos al Dr. J. Farup por compartir el anticuerpo anti-PDGFRa del conejo. Este trabajo fue apoyado por una subvención inicial de AUFF para E.P. y subvenciones Start Package de NovoNordiskFonden a E.P. (0071113) y a A.D.M. (0071116).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de 1,5 mL( Rendimiento de PCR probado, PP, 30.000 xg, Libre de ADN/DNasa-/RNasa, Baja unión al ADN, Estéril) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | Tubo de 1,5 mL |
| Tubo de 15 mL (PP/HD-PE, 20.000 xg, IVD/CE, IATA, ADN/DNasa-/RNasa-, No citotóxico, Libre de pirógenos, Estéril) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | Tubo |
| de 15 mLTubo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL Falcon | , Fisher Scientific | 352054 | Tubo FACS sin tapón de filtro |
| 5 mL de poliestireno Tubo de fondo redondo con tapón de filtro de celdas | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | Tubo FACS con tapón de filtro |
| Tubo de 5 mL (PP, esterilizable en autoclave no estéril) | Colección VWR | 525.0946 | Tubo de 5 mL Tubo |
| 50 mL( PP/HD-PE, 20.000 xg, IVD/CE, ADR, libre de ADN/DNasa-/RNasa, no citotóxico, libre de pirógenos, Estéril) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | Tubo de 50 mL |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-conejo IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lote: 2387458 (Cat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H + L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lote: 2420713 (Cat # A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Instalación central Centrífuga de la Universidad de Aarhus | |
| 5810 | Centrífuga | Eppendorf | |
| Click-iT EdU Kit de proliferación celular para imágenes, Alexa Fluor 488 tinte | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | Kit de proliferación celular |
| Colágeno de piel de becerro | Biorreactivo, Sigma Aldrich | Fuente: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| Colagenasa tipo II | Worthington, Fisher Scientific | Lote: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Colagenasa |
| Dispasa | Gibco, Fisher Scientific | Lote: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispasa |
| Suero de burro (no estéril) | Sigma Aldrich, Merck | Lote: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Pinzas rectas con puntas finas |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Pinzas |
| curvasF-10 Mezcla de nutrientes (Jamón) (1x), +L-glutamina | Gibco, Fisher Scientific | Lote. 2453614 (cat# 31550-023) | |
| FITC anti-ratón CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (cat # 102506) | |
| FITC Anti-ratón CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
| Ácido acético glacial (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
| Rotor de minitubos de cabeza sobre cabeza | Fisher Scientific | 15534080 (Modelo n.º 88861052)Rotor | de minitubos de cabeza sobre cabeza |
| Suero de caballo | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Baño de agua agitador |
| MS2 mini-agitador | IKA | Unidad de vórtice | |
| Aguja 20 G (0,9 mm x 25 mm) | Microlanza BD, Fisher Scientific | 304827 | aguja de 20G |
| Tampón de formalina neutro 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lote: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
| Filtro de células no pirogénico (40 µ M) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Filtro de células |
| Azul Pacífico anti-ratón Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Anticuerpo primario Pax7 | DSHB | Lote: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x concentrado en polvo | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM. A) (Cat # 105720) | |
| Pluma/estreptococo | Gibco, Fisher Scientific | Lote. 163589 (cat# 11548876 ) | |
| Puntas de pipeta p10 | Puntas Art, barrera autosellante, Thermo Scientific | 2140-05 | Puntas de filtro preesterilizadas de baja retención, preesterilizadas Puntas |
| pipeta p1000 | Puntas Art, barrera autosellante, Thermo Scientific | 2279-05 | Puntas de filtro de baja retención, preesterilizadas, puntas |
| filtro Puntas de pipeta p20 | Puntas Art, barrera autosellante, Thermo Scientific | 2149P-05 | Puntas de filtro de baja retención, preesterilizadas, |
| pipeta p200 | Puntas de arte, barrera autosellante, Thermo Scientific | 2069-05 | Puntas de filtro de baja retención, preesterilizadas, |
| almohadilla protectora | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40 cm, 8 capas |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipetas (P10, P20, P200, P1000) |
| Recombinante anti-PDGFR-alfa | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| Bisturí (eje n.º 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Bisturí |
| Hoja de bisturí n.º 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Bisturí |
| Scanlaf mars | Labogene | Gabinete de clase 2: Mars | Flow banco |
| ScanR | Microscopio Olympus | , Instalación central Universidad de Aarhus | |
| Tijeras | FST | 14568-09 | |
| Serie 8000 DH | Incubadora Thermo Scientific | 3540-MAR | |
| Pipeta serológica 10 mL | VWR | 612-3700 | Estéril, no pirogénica |
| Pipeta serológica 5 mL | VWR, Avantor suministrado por VWR | 612-3702 | Jeringa estéril, no pirogénica |
| 5 mL, punta Luer (6%), estéril | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Jeringa |
| TC Dish 100, estándar | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Placa de Petri |
| Superficie tratada con cultivo de tejidos (TC), poliestireno negro, fondo plano, estéril, tapa, paquete de 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | Placa de medio fondo de 96 pocillos |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Fuente: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
Referencias
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692(2021).
- Cheung....
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