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Artículo de método

Aislamiento de poblaciones de células madre quiescentes de músculos esqueléticos individuales

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DOI:

10.3791/64557

⸱

9 de diciembre de 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, Aarhus University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el aislamiento de células madre musculares y progenitores fibroadipogénicos de músculos esqueléticos individuales en ratones. El protocolo incluye la disección de un solo músculo, el aislamiento de células madre mediante clasificación de células activadas por fluorescencia, la evaluación de la pureza mediante tinción de inmunofluorescencia y la medición cuantitativa de la entrada en fase S mediante un ensayo de incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina.

Resumen

El músculo esquelético alberga distintas poblaciones de células madre adultas que contribuyen a la homeostasis y reparación del tejido. Las células madre del músculo esquelético (MuSC) tienen la capacidad de producir músculo nuevo, mientras que los progenitores fibroadipogénicos (FAP) contribuyen a los tejidos de soporte del estroma y tienen la capacidad de producir fibroblastos y adipocitos. Tanto los MuSC como los FAP residen en un estado de salida reversible prolongada del ciclo celular, llamado quiescencia. El estado de reposo es clave para su función. Las células madre quiescentes se purifican comúnmente a partir de múltiples tejidos musculares agrupados en una sola muestra. Sin embargo, estudios recientes han revelado claras diferencias en los perfiles moleculares y la profundidad de quiescencia de los MuSC aislados de diferentes músculos. El presente protocolo describe el aislamiento y estudio de MuSCs y FAPs de músculos esqueléticos individuales y presenta estrategias para realizar análisis moleculares de activación de células madre. Detalla cómo aislar y digerir músculos de diferentes orígenes de desarrollo, grosores y funciones, como el diafragma, tríceps, gracilis, tibial anterior (TA), gastrocnemio (GA), sóleo, extensor largo de los dedos (EDL) y los músculos maseteros. Los MuSC y FAP se purifican mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y se analizan mediante tinción de inmunofluorescencia y ensayo de incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU).

Introducción

El músculo esquelético tiene una alta capacidad de regeneración debido a la presencia de células madre musculares (MuSC). Los MuSC se encuentran en las miofibras, debajo de la lámina basal, y residen en un estado quiescente de salida prolongada y reversible del ciclo celular 1,2,3,4. Tras la lesión, los MuSCs se activan y entran en el ciclo celular para dar lugar a progenitores amplificadores que pueden diferenciarse y fusionarse para formar nuevas miofibras 2,5. Trabajos previos han demostrado que los MuSCs son absolutamente esenciales para la regeneración muscular 6,7,8. Además, un solo MuSC puede injertar y generar tanto nuevas células madre como nuevas miofibras9. El músculo esquelético también alberga una población de células estromales mesenquimales llamadas progenitores fibro-adipogénicos (FAPs), que juegan un papel crucial en el apoyo a la función MuSC durante la regeneración muscular 6,10,11,12.

Debido a su potencial para coordinar la regeneración muscular, ha habido un gran interés en comprender cómo funcionan los MuSC y los FAP. Los MuSC quiescentes están marcados por la expresión de los factores de transcripción Pax7 y Sprouty1, y el receptor de calcitonina de la proteína de la superficie celular, mientras que los FAP quiescentes están marcados por el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas de la proteína de superficie celular (PDGFRa)10,12,13,14,15 . Estudios previos han demostrado que los MuSC y FAPs podrían purificarse a partir de los músculos esqueléticos utilizando marcadores de superficie celular y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)9,15,16,17,18,19,20,21. Si bien estos protocolos han avanzado enormemente la capacidad de estudiar MuSC y FAP, un inconveniente es que la mayoría de estos protocolos requieren el aislamiento de MuSC de un conjunto de diferentes tejidos musculares. Trabajos recientes de nosotros y otros han revelado diferencias en el fenotipo celular y los niveles de expresión génica entre MuSCs aislados de diferentes tejidos22,23. Los MuSCs del diafragma, tríceps y gracilis muestran una activación más rápida que los MuSCs de los músculos de las extremidades posteriores inferiores22, mientras que los MuSCs del músculo extraocular muestran una diferenciación más rápida que los MuSCs del diafragma y los músculos de las extremidades posteriores inferiores23.

Este protocolo describe el aislamiento de MuSCs y FAPs de músculos esqueléticos individuales (Figura 1). Esto incluye la disección del diafragma, tríceps, gracilis, tibial anterior (TA), sóleo, extensor largo de los dedos (EDL), gastrocnemio (GA) y músculos maseteros. Los músculos diseccionados se disocian posteriormente por digestión enzimática utilizando colagenasa II (una proteasa que se dirige específicamente a la secuencia amino Pro-X-Gly-Pro en el colágeno, lo que permite la degradación del tejido conectivo y la disociación tisular24) y dispasa (una proteasa que escinde la fibronectina y el colágeno IV, lo que permite una mayor disociación celular25). Los MuSC y los FAP se aíslan de suspensiones unicelulares mediante FACS. Como ejemplos de ensayos posteriores para el análisis celular, la activación de células madre se determina mediante el ensayo de incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), mientras que la pureza celular se determina mediante tinción de inmunofluorescencia para los marcadores específicos de tipo celular Pax7 y PDGFRa.

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Protocolo

El presente protocolo se realizó de acuerdo con las pautas de cuidado de animales en la Universidad de Aarhus y las regulaciones éticas locales.

NOTA: Asegúrese de cumplir con las regulaciones del comité ético local para la experimentación animal y el manejo de muestras de roedores post mortem. Los ratones son una fuente potencial de alérgenos; Si está disponible, encienda la ventilación por extracción y colóquela sobre el espacio de trabajo para evitar la exposición excesiva a alérgenos. Alternativamente, use una máscara facial si el experimento se lleva a cabo regularmente. Este protocolo implica trabajar con objetos punzantes, y se recomienda a los investigadores que se familiaricen con los procedimientos y la logística para aplicar primeros auxilios en caso de un corte.

1. Preparación (1-2 h; el día antes de la disección)

NOTA: Las soluciones, placas y medios se preparan en condiciones estériles y se filtran (0,45 μm) antes de su uso, a menos que se indique lo contrario. Preparar soluciones madre de dispasa (11 U/mL en PBS) y colagenasa II (1.000 U/mL en PBS) y almacenarlas a -20 °C (Tabla 1). Las cepas se descongelan y se utilizan para la digestión secundaria en el paso 4.2.6.

  1. Recubrimiento de colágeno de una placa de 96 pocillos de media área
    1. Prepare agua ácida. Agregue 5.15 ml de ácido acético glacial a 895 ml de agua esterilizada en autoclave en un vaso de precipitados de 2 L.
    2. Filtrar la solución con una unidad filtrante de 0,45 μm y 500 ml. Transfiera 800 ml del agua ácida filtrada a una botella de 1 L.
    3. Agregue 40 ml de solución madre de colágeno estéril a la botella. Mezclar suavemente la solución agitando y conservar a 4 °C, protegido de la luz, hasta su uso.
    4. Cubra una o más placas de media área de 96 pocillos con colágeno. Añadir 50 μL de solución de recubrimiento de colágeno a cada pocillo y cubrir la placa durante la noche (ON) a 4 °C.
    5. Aspirar la solución de colágeno al día siguiente con un aspirador a base de vacío y lavar la placa 2 veces añadiendo 100 μL de agua esterilizada en autoclave y aspirando.
    6. Incline la tapa de la placa y deje que la placa se seque en la campana durante 20-30 minutos.
    7. Cuando la placa esté completamente seca, envuélvala en papel de aluminio y guárdela a 4 °C hasta su uso. Las placas recubiertas se pueden almacenar hasta por 4 semanas.
      NOTA: El recubrimiento de colágeno permite la adhesión celular. Es importante eliminar el colágeno libre, ya que podría interferir con la función celular y la señalización (por ejemplo, la unión del colágeno V a los receptores de calcitonina en los MuSC)26.

2. Preparación (0,5 h; el día de la disección):

  1. Preparación de soluciones adicionales y espacio de trabajo
    1. Prepare un medio de lavado estéril agregando 50 ml de suero de caballo y 5 ml de pluma/estreptococo a 445 ml de medio F10 de HAM. Trabaje en una campana de flujo laminar para evitar la contaminación.
    2. Calcular y pesar la cantidad adecuada de colagenasa II necesaria para preparar el tampón de disociación. (Para cada ratón, se utilizan 26.000 unidades de colagenasa II para producir 40 ml de tampón de disociación a 650 U/ml de colagenasa II). Agregue el polvo pesado a un tubo cónico de 50 ml y guárdelo en hielo.
    3. Preparar dos platos de 10 cm para el aislamiento muscular. Vierta 3 ml de medio de lavado (Tabla 1) en cada placa de Petri. Coloque los platos de 10 cm fuera de la campana de flujo laminar para su uso posterior.
    4. Preparar los materiales para la digestión muscular. Según el número de muestras, etiquete el número apropiado de tubos cónicos de 50 ml (ocho por ratón, uno para cada músculo) y déjelos en el banco. Rocíe las agujas, las jeringas de 10 ml y los coladores de células de 40 μm con etanol al 70% (ocho de cada ratón, uno para cada músculo) y llévelos dentro de la campana de flujo laminar. Coloque agujas en las jeringas.
    5. Prepare los materiales para la clasificación. Etiquete los tubos de fondo redondo de 5 ml con tapas de filtro celular según el número de muestras. Cubra los tubos con papel de aluminio y déjelos en la campana de flujo laminar.
    6. Correspondiente al número de muestras y poblaciones que se están clasificando, preparar tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con 500 μL de medio de lavado para la recolección celular (16 por ratón, un tubo por cada población celular por tejido muscular). Guarde estos tubos en hielo.

3. Disección muscular (20-30 min)

NOTA: Esta sección del protocolo se lleva a cabo en un ambiente no estéril. El procedimiento se puede llevar a cabo utilizando uno o varios ratones. Sin embargo, un ratón es suficiente para preparar tanto las muestras para la clasificación como los controles para configurar la compensación y las puertas FACS.

  1. Iniciar el aislamiento muscular
    1. Prepare el espacio de trabajo no estéril para la disección y el aislamiento muscular. Desinfecte la estación de trabajo con etanol al 70%. Coloque una almohadilla protectora desechable estéril en la estación de trabajo.
    2. Usando un marcador permanente, dibuje una caja para cada músculo en la parte superior de una tapa de placa de Petri para luego colocar el músculo aislado.
    3. Rocíe los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70%.
    4. Eutanasia al ratón por inhalación deCO2 y/o luxación cervical.
    5. Aísle los músculos individuales (de un ratón a la vez si usa varios ratones). Rocíe el ratón con etanol al 70% para humedecer el pelaje y desinfectar la piel. Coloque el ratón en la almohadilla inferior con el abdomen hacia arriba. Una visión general de los ocho músculos y su respectiva ubicación anatómica se muestra en la Figura 2A.
  2. Aislar los músculos gracilis
    1. Use un par de tijeras para hacer una incisión horizontal de 0,5 cm en la piel abdominal.
    2. Retire la piel: Con ambas manos, use el pulgar y el índice para agarrar la parte superior e inferior de la incisión. Tire de cada lado de la incisión para rasgar y separar la piel del torso y las extremidades inferiores. Tire hacia abajo de la piel de la extremidad inferior para exponer ambas extremidades posteriores (hacia abajo desde la cadera hasta los dedos de los pies). Del mismo modo, tire hacia arriba para exponer el torso.
    3. Localice el músculo gracilis (parte interna del muslo). Con fórceps curvos, agarre el gracilis y levante ligeramente el músculo (Figura 2B). Con unas tijeras, haga una incisión de 0,5 cm (Figura 2C), de la cual se corta el gracilis y se aísla completamente (Figura 2D). Repita esto para la otra pierna para aislar el segundo músculo gracilis.
  3. Aislar los músculos TA y EDL (miembro posterior inferior, lado ventral)
    1. Con un bisturí, corte la fascia haciendo una incisión de 0,5 cm a lo largo del lado lateral de la tibia (el hueso más grueso de la extremidad posterior inferior). Use fórceps curvos para agarrar la fascia y tire para eliminarla.
      NOTA: Cuando la fascia se ha eliminado por completo, los tendones en el extremo distal de la pata trasera son visibles y se pueden separar.
    2. Use fórceps rectos con puntas superfinas para ir entre el tendón distal del TA (lado lateral de la tibia) y el EDL (debajo del AT) (Figura 2E-G).
      NOTA: Con la experiencia, se puede usar el extremo romo de una hoja de bisturí en lugar de las pinzas rectas.
    3. Deslice los fórceps hacia el extremo proximal del músculo para separar los músculos.
    4. Lleve los fórceps rectos de vuelta al extremo distal. Cortar el tendón distal.
    5. Agarre suavemente el tendón distal del músculo con fórceps curvos. Levante el músculo hacia arriba y por encima de su inserción proximal y corte cuidadosamente el tendón proximal lo más cerca posible de su punto de unión. Corte el otro extremo y transfiera el TA a una placa de Petri.
    6. Use fórceps rectos con puntas superfinas para ir debajo del tendón distal de la EDL.
    7. Deslice los fórceps hacia el extremo proximal del músculo para separar los músculos.
    8. Lleve los fórceps rectos de vuelta al extremo distal. Cortar el tendón distal sin dañar el músculo.
    9. Agarre suavemente el tendón distal de la EDL con fórceps curvos. Levante el músculo hacia arriba y por encima de su inserción proximal y corte cuidadosamente el tendón proximal lo más cerca posible de su punto de unión. Corte el otro extremo y transfiera el EDL a una placa de Petri. Repita para la otra extremidad posterior para aislar los segundos músculos TA y EDL.
  4. Aislar los músculos GA y sóleo (miembro posterior inferior, lado dorsal)
    1. Use fórceps rectos con puntas superfinas para ir entre el tendón de Aquiles y los huesos inferiores de las extremidades posteriores.
    2. Deslice los fórceps hacia el extremo proximal del músculo para separar el músculo.
    3. Lleve los fórceps rectos de vuelta al extremo distal. Cortar el tendón distal.
      NOTA: Para evitar dañar el músculo sóleo, que se encuentra debajo de la AG, corte lo más cerca posible de su unión distal del tendón de Aquiles, dejando un trozo del tendón unido a la AG (Figura 2H).
    4. Para revelar y aislar el músculo sóleo, tire del GA hacia arriba y sobre el peroné (el hueso más delgado de los dos huesos en la extremidad posterior inferior).
      NOTA: El músculo sóleo se distingue por su característico color rojo oscuro en relación con el AG (Figura 2I).
    5. Localice el tendón sóleo proximal. Con pinzas rectas, vaya entre el sóleo y GA.
    6. Mueva los fórceps hacia el extremo distal del músculo para separar el sóleo del AG.
    7. Aísle primero el sóleo. Corte su tendón proximal, agarre el tendón con pinzas curvas y levante con cuidado el sóleo para acceder a su tendón distal. Cortar el tendón distal para aislar el sóleo de la AG. Colocar el sóleo en la placa de Petri con medio de lavado (Figura 2J)
    8. Cortar el GA y colocarlo en la placa de Petri. Repita esto para la otra pierna para aislar el segundo sóleo y los músculos GA.
  5. Aislar los músculos tríceps (extremidad anterior superior, lado dorsal)
    1. Use fórceps rectos con puntas superfinas para ir entre el músculo tríceps y el hueso del húmero (el hueso principal de la pata delantera superior) (Figura 2K-M).
    2. Deslice los fórceps hacia el extremo proximal del músculo para separar el músculo. Cortar el extremo proximal del músculo.
    3. Agarre el extremo proximal del tríceps con pinzas curvas y tire de él hacia arriba y sobre el codo para acceder al tendón distal. Corte el tendón distal del tríceps, transfiera el músculo a una placa de Petri y repita el procedimiento para la otra extremidad anterior.
  6. Aislar los músculos maseteros
    1. Retire el pelaje y la piel de la mandíbula. Realice una incisión horizontal de 0,5 cm con tijeras. Con ambas manos, pellizque cada lado de la incisión con los dedos pulgar e índice. Retire la piel tirando hacia arriba y hacia abajo.
    2. Localice el tendón principal del masetero (caudal, debajo del ojo). Inserte la hoja de bisturí plana entre el hueso y el músculo (Figura 2N). Cortar el tendón.
    3. Agarre el tendón masetero mayor con pinzas curvas. Córtelo con una hoja de bisturí o tijeras en la dirección rostral para separar el músculo masetero del hueso de la mandíbula (Figura 2O, P). Coloque el músculo masetero aislado en la placa de Petri. Repita el procedimiento para el segundo músculo masetero.
  7. Aislar el músculo del diafragma
    NOTA: Al aislar el músculo del diafragma, asegúrese de cortar con cuidado para evitar cortar los órganos internos y el intestino, ya que esto es una fuente de contaminación.
    1. Usando tijeras, haga una toracotomía (un corte entre las costillas) en el medio del esternón (un hueso largo y plano, situado en el centro del tórax, que conecta las costillas) y corte a través del esternón (Figura 2Q).
    2. Exponga el diafragma cortando 360° a través de la caja torácica.
    3. Separe la parte superior del cuerpo de la parte inferior/abdomen. Con un par de tijeras, corte la tráquea, el esófago, la vena cava y la aorta abdominal.
    4. Separe el diafragma de la parte inferior del cuerpo. Con unas tijeras, realice una laparotomía (una incisión quirúrgica en la cavidad abdominal) a 1 cm por debajo del esternón y haga un corte de 360° (Figura 2R).
    5. Coloque las tijeras cerradas entre la caja torácica y los órganos abdominales y presione hacia abajo. Tire suavemente de la caja torácica para separarla de los órganos abdominales (Figura 2S).
    6. Separe el diafragma de la caja torácica. Sostenga libremente el diafragma entre dos dedos y corte a través de la caja torácica con tijeras. Use tijeras para cortar el diafragma lo más cerca posible de las costillas en un corte de 360°. Coloque el diafragma aislado en una placa de Petri.
      NOTA: Durante la luxación cervical, el diafragma puede romperse y colapsar contra la caja torácica, lo que dificulta su localización. El músculo todavía se puede aislar. Identifique el músculo colapsado, sosténgalo entre dos dedos y corte 360 ° siguiendo la caja torácica.

4. Digestión muscular a una suspensión unicelular (~1 h 35 min)

NOTA: Los siguientes pasos incluyen entornos de trabajo no estériles (pasos 4.1-4.2) y estériles (paso 4.3).

  1. Digestión mecánica
    1. Coloque los músculos aislados en la tapa de una placa de Petri de 10 cm.
    2. Usando fórceps curvos, agarre los músculos aislados uno por uno. Para el sóleo y la AG, retire las partes restantes del tendón de Aquiles.
    3. Usando tijeras, pica los músculos aislados uno por uno cortándolos en aproximadamente 1 mm3 pedazos.
  2. Digestión enzimática
    1. Prepare el tampón de disociación muscular agregando 40 ml de medio de lavado en frío al polvo de colagenasa II pesado (colagenasa II: 650 U/ml en medios de lavado).
      NOTA: Utilice un tampón de disociación muscular recién preparado para garantizar una actividad enzimática óptima.
    2. Transfiera los músculos picados a un tubo cónico de 15 ml que contenga 5 ml de tampón de disociación.
    3. Incubar el tubo durante 35 min en un baño de agua agitada a 37 °C a 60 rpm.
    4. Después de la incubación, agregue el medio de lavado a un volumen total de 15 ml. Girar el tubo a 1.600 x g durante 5 min a 4 °C.
    5. Aspire el sobrenadante hasta un volumen de 4 ml utilizando un aspirador basado en vacío. Para evitar perturbar el pellet, aspire lentamente desde la parte superior y elimine cualquier grasa flotante.
    6. Descongelar las alícuotas de dispasa y colagenasa II. Añadir 500 μL de la solución de colagenasa II (1.000 U/ml de stock, -20 °C) a la muestra restante de 4 ml. A continuación, añadir 500 μL de la solución de dispasa (11 U/ml de material, -20 °C).
      NOTA: La dispasa puede generar un precipitado. Si esto ocurre, gire la solución madre de dispasas a 10,000 x g, 1 minuto antes de usar. Transfiera el sobrenadante ahora transparente a la suspensión celular sin alterar el pellet.
    7. Vortex las muestras brevemente para disolver el pellet.
    8. Incubar las muestras durante 20 min en un baño maría agitante a 37 °C a 60 rpm.
      NOTA: La digestión de un gran número de muestras de músculo lleva mucho tiempo. Para los pasos 4.3.1-4.3.6, calcule tomar 2-5 min por muestra. Este paso va más rápido cuando se realiza en paralelo por dos o más investigadores.
  3. Homogeneización de muestras
    1. Homogeneizar la suspensión celular. Transfiera la suspensión del tubo de 15 ml a un tubo de 50 ml. Use una jeringa de 10 ml con una aguja de 20 G para resuspender la muestra tirando de la muestra hacia arriba y hacia abajo a través de la aguja 5x.
      NOTA: Si trozos de músculo no digerido obstruyen la aguja, límpielos en un pañuelo de papel.
    2. Coloque un filtro de células de 40 μm en un nuevo tubo cónico de 50 ml.
    3. Tome la suspensión de celda completa en la jeringa y cuele la muestra en un nuevo tubo cónico de 50 ml con un filtro celular en la parte superior. Colar la muestra dispensando el volumen total directamente sobre el filtro.
    4. Para recuperar todas las células mononucleadas, agregue 20 ml del medio de lavado al tubo cónico vacío y viértalo a través del filtro celular en el tubo cónico de 50 ml que contiene la muestra filtrada. Recupere el volumen restante debajo del filtro celular con una pipeta p1000.
    5. Desechar el filtro celular y girar la muestra a 1.600 x g durante 5 min a 4 °C.
    6. Al pipetear con una pipeta p1000, aspirar el sobrenadante sin alterar el pellet.
    7. Pipeteando con una pipeta p1000, resuspender el pellet de diafragma en 500 μL del medio de lavado y resuspender las otras muestras musculares en 300 μL del medio de lavado cada una.
      NOTA: El diafragma es el más grande de los músculos con el mayor contenido de células madre y, por lo tanto, se puede utilizar para las tinciones de control.

5. Tinción y clasificación (~40 min + 30 min ordenación/muestra)

NOTA: Trabaje en un ambiente estéril sobre hielo para los siguientes pasos.

  1. Transfiera una alícuota de 50 μL de la suspensión de la celda del diafragma a cuatro nuevos tubos de microcentrífuga de 2 ml para las tinciones de control (50 μL cada uno). Añadir 250 μL del medio de lavado a cada tubo de control hasta un volumen final de 300 μL.
  2. Añadir 3 μL (1:100) de anticuerpos fluorescentes menos uno (control FMO) a los tres tubos de tinción de control y dejar un tubo sin anticuerpos (control no teñido) (ver Tabla 2).
  3. Agregue 3 μL (1:100) de anticuerpos (VCAM1-PECy7, CD45-FITC, CD31-FITC y SCA1-PacificBlue) a las suspensiones musculares unicelulares restantes, incluida la muestra de diafragma restante.
  4. Incubar las suspensiones celulares durante 15 min a 4 °C en un agitador de cabeza sobre cabeza.
    NOTA: Las tinciones de control son necesarias para determinar los niveles de fluorescencia de fondo y establecer las compuertas para la citometría de flujo. Se pueden usar diferentes anticuerpos, pero cada uno tendrá una concentración de trabajo específica y un tiempo de incubación que debe probarse. Si se utilizan anticuerpos de diferentes proveedores, la concentración, y por lo tanto la dilución, puede variar. Se puede agregar un tinte de viabilidad celular a la mezcla de tinción para eliminar cualquier célula muerta o moribunda durante la clasificación.
  5. Girar las muestras a 1.600 x g durante 5 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante sin alterar el pellet mediante pipeteo.
  6. Mediante pipeteo con una pipeta p1000, resuspender cada muestra en 800 μL del medio de lavado.
  7. Filtrar las muestras utilizando un tubo FACS con una tapa de filtro celular (40 μm) para eliminar cualquier grupo de células (o agregados) restante.
  8. Lave el colador celular añadiendo 800 μL adicionales del medio de lavado.
  9. Mantenga las muestras cubiertas con papel de aluminio en hielo hasta el análisis.
    NOTA: Si en este punto la suspensión celular aparece turbia/densa debido a la alta concentración de células, agregue 800 μL adicionales del medio de lavado para disminuir la densidad celular.
  10. Ponga en marcha el sistema de control de los bienes sobre el terreno con una boquilla de 70 μm.
  11. Utilice los controles sin teñir y FMO para establecer la estrategia de compuerta: los MuSC son negativos para CD45-FITC, CD31-FITC y SCA1-PacBlue, y son positivos para VCAM1-PECy7; Los FAP son negativos para CD45-FITC, CD31-FITC, VCAM1-PECy7 y positivos para SCA1-PacBlue.
  12. Clasificar las suspensiones unicelulares teñidas mediante clasificación bidireccional y recoger los MuSC y FAP en tubos de recogida separados que contengan 500 μL del medio de lavado.
    NOTA: Utilizando FACS con cuatro láseres (configuración: boquilla de 70 μm, 405 nm, 488 nm, 561 nm, 633 nm), la combinación elegida de fluoróforos no requiere compensación de la señal de fluorescencia. Sin embargo, si se utiliza un citómetro de flujo diferente o una combinación diferente de fluoróforos, se recomiendan muestras de control adicionales de una sola tinción para la compensación. De los músculos más pequeños (EDL, sóleo, TA), se esperan rendimientos de 3.000 MuSC y 5.000 FAP. Para los otros músculos más grandes, se esperan rendimientos de 20,000 MuSC y FAP. Los recuentos de eventos enumerados por el software FACS pueden diferir del número real de células viables en el tubo de recolección. El número de células se puede confirmar mediante el recuento de células utilizando un hemocitómetro.
  13. Girar las celdas clasificadas a 1.600 x g durante 5 min a 4 °C. Mediante el pipeteo, aspire el sobrenadante sin alterar el pellet celular.
  14. Añadir 100 μL del medio de lavado a cada muestra y resuspender cuidadosamente las células sin crear burbujas de aire. Transfiera los 100 μL de la muestra resuspendida a una placa de 96 pocillos recubierta de colágeno de media área. Placa 1.000-3.000 células por pozo.
    NOTA: Si las células no se resuspenden correctamente, las células pueden pegarse en grupos, confundiendo los análisis de microscopía posteriores.
  15. Inspeccione las células bajo el microscopio y observe su distribución, forma y tamaño.
  16. Incubar la placa a 37 °C, 5%CO2. Las células se adherirán dentro de 2 h.
    NOTA: Se recomienda confirmar la pureza de las poblaciones celulares recolectadas, ya sea mediante análisis de citometría de flujo (cargando una alícuota de la muestra clasificada en el clasificador y registrando un pequeño número de eventos) o mediante tinción de anticuerpos de las células plateadas seguida de microscopía (Pax7 es un marcador definitorio para MuSC de ratón, PDGFRa es un marcador definitorio para FAP de ratón). Comenzando en la sección 7 a continuación hay un protocolo para la tinción de células para los niveles de proteína Pax7 y PDGFRa.

6. Ensayo de incorporación de EdU

NOTA: Trabaje en condiciones estériles y use la campana extractora química cuando manipule paraformaldehído (PFA) para los siguientes pasos. EdU es un análogo de nucleótido incorporado en el ADN a medida que las células pasan por la fase S del ciclo celular. Es mutagénico a altas concentraciones. Siempre use guantes cuando manipule EdU. Consulte las pautas locales para el manejo de residuos de EdU.

  1. Pulso de EdU (día 1)
    1. Prepare una solución de trabajo de 2x EdU en un medio de lavado fresco.
    2. Saque la placa de 96 pocillos con las células de la incubadora. Inspeccione las células bajo el microscopio para monitorear la confluencia. Pase a la campana de flujo laminar.
    3. Retirar 50 μL de medio de la placa mediante pipeteo. Agregue 50 μL de solución de trabajo 2x EdU para que el volumen final en el pozo sea de 100 μL.
    4. Cultivar las células en presencia de EdU durante el período de tiempo previsto a 37 °C, 5% deCO2.
      NOTA: El tiempo y la duración del pulso EdU pueden variar. En promedio, los MuSC inactivos tardan 2 días en activarse completamente y completar su primera división celular19. EdU se puede agregar a las celdas clasificadas inmediatamente después del recubrimiento.
  2. Fijación (día 2)
    NOTA: El PFA es un carcinógeno. Siempre maneje la PFA con cuidado. Familiarizarse con las regulaciones locales para el manejo de PFA y la eliminación de desechos.
    1. Saque la placa de 96 pocillos con las células de la incubadora. Inspeccione las células bajo el microscopio y mueva la placa hacia la campana extractora.
    2. Mediante el pipeteo, retire el medio y fije las células agregando 50 μL de PFA al 4% a cada pocillo. Incubar la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT) en una campana extractora de humos químicos.
    3. Retire el PFA con una pipeta y deséchelo en un contenedor de residuos adecuado.
    4. Lave las células agregando 100 μL de PBS a todos los pocillos. Mediante el pipeteo, aspirar el PBS y repetir el lavado. Mantener las células en 100 μL de PBS.
      NOTA: Para evitar el lavado de cualquier celda, dispense el PBS al lado del pozo pipeteando lentamente.
  3. Etiquetado EdU
    1. Permeabilizar las células antes de la detección de EdU eliminando el PBS y agregando 100 μL de Triton X-100 al 0,5% en PBS. Incubar la placa durante 5 min a 4 °C.
      NOTA: Triton X-100 es un surfactante y puede causar irritación de la piel. Manéjelo con cuidado y use siempre guantes.
    2. Después de 5 min, aspirar el Triton X-100 y añadir 100 μL de PBS.
    3. Prepare una mezcla de reacción química de clic EdU de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    4. Aspirar el PBS y añadir 33 μL de la mezcla de reacción química de clics EdU. Incubar la placa durante 30 min en RT.
    5. Aspirar la mezcla de reacción química de clic EdU y lavar las células con 100 μL de PBS.
    6. Aspirar el PBS, añadir 100 μL de PBS con Hoechst (1:2.000), e incubar protegido de la luz durante 10 min a RT.
    7. Aspirar el Hoechst y lavar dos veces añadiendo 100 μL de PBS. Almacenar las células en 100 μL de PBS a 4 °C en la oscuridad.
    8. Imagen de las células en un microscopio invertido. Las células se pueden almacenar en la oscuridad durante meses, siempre y cuando los pozos no se sequen.
      NOTA: Es posible co-teñir las células con anticuerpos. En este caso, proceda con un paso de bloqueo seguido de la incubación con el anticuerpo primario. Seleccione un anticuerpo secundario con un fluoróforo conjugado cuyo espectro de emisión no se superponga con el del fluoróforo utilizado para detectar EdU. Asegúrese de no usar anticuerpos secundarios con fluoróforos superpuestos con el rango espectral de Hoechst.

7. Tinción por inmunofluorescencia

NOTA: Esta parte del protocolo se puede realizar independientemente de la sección 6. Al omitir la sección 6, realice los pasos 6.3.1 y 6.3.2 para habilitar la permeabilización celular antes de continuar con el paso 7.2 a continuación.

  1. Saque la placa que contiene las células marcadas con EdU.
  2. Prepare 20 ml de tampón de bloqueo agregando 2 ml de suero de burro a 18 ml de PBS.
  3. Para evitar la unión de anticuerpos inespecíficos, retire 100 μL del PBS de cada pocillo y agregue 50 μL del tampón de bloqueo con una pipeta p200. Incubar la placa durante 30 minutos a RT, protegida de la luz y cubierta con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo del EdU marcado con fluoróforo.
    NOTA: Las celdas se fijan al fondo del pozo, pero pueden desprenderse si se aplica demasiada fuerza al pipetear.
  4. Mientras bloquea las muestras, prepare la mezcla primaria de anticuerpos. Agregue 8.0 μL (1:100) de anti-Pax7 de ratón y anti-PDGFRa de conejo a 800 μL de tampón de bloqueo para teñir 16 pocillos (ocho tejidos, dos tipos de células).
  5. Después del bloqueo, retire el suero de burro y agregue 50 μL de la mezcla de anticuerpos primarios a cada pocillo. Incubar la placa durante la noche a 4 °C, cubierta con papel de aluminio.
  6. Después de la incubación, retire el anticuerpo primario y agregue 50 μL de Tritón (0,5% en PBS) a cada uno de los pocillos. Incubar la placa durante 5 minutos a RT protegida de la luz, para lavar el anticuerpo no unido. Repita el lavado tres veces.
  7. Prepare la mezcla maestra de anticuerpos secundarios agregando 1.0 μL (1: 1,000) de burro anti-ratón-Alexa647 y burro anti-conejo-Alexa555 a un tubo de microcentrífuga que contiene 1.000 μL del tampón de bloqueo.
  8. Agregue 33 μL de la mezcla maestra de anticuerpos secundarios a cada uno de los pocillos. Incubar la placa durante 60 minutos a RT protegida de la luz.
  9. Eliminar el exceso de anticuerpo secundario mediante pipeteo, añadir 50 μL de Tritón (0,1% en PBS) e incubar durante 5 min a RT protegido de la luz. Repita el lavado tres veces.
  10. Finalmente, agregue 100 μL de PBS. Decida si desea obtener imágenes de la placa inmediatamente utilizando un microscopio de fluorescencia invertida con una cámara CCD refrigerada, o almacenar la placa a 4 °C hasta un análisis posterior sellando los bordes de la placa con parafilm y envolviendo la placa sellada en papel de aluminio.

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Resultados

Siguiendo el protocolo para el aislamiento individual del músculo esquelético (Figura 2), los músculos gracilis, TA, EDL, GA, sóleo, tríceps, masetero y diafragma se aislaron de tres ratones machos suizos criados que habían sido descontinuados de un programa de cría local (Figura 2). Después de la disociación tisular y la tinción de anticuerpos, los MuSC y FAP de los músculos individuales fueron purificados por FACS (Figura 3). La a...

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Discusión

Varios pasos son clave en la ejecución de este protocolo para lograr buenos rendimientos. Los músculos individuales tienen un volumen pequeño en comparación con la cantidad de músculo utilizado en los protocolos de aislamiento a granel. Esto resulta en un riesgo de que el músculo se seque durante la disección, lo que reduce el rendimiento. Para evitar esto, es importante agregar medio a los músculos inmediatamente después de la disección. Además, si la disección está tomando más tiempo, la piel se puede quitar de una ext...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros en competencia ni conflictos de intereses.

Agradecimientos

La clasificación celular se realizó en la instalación central de FACS, Universidad de Aarhus, Dinamarca. Las figuras se crearon utilizando Biorender.com. Agradecemos al Dr. J. Farup por compartir el anticuerpo anti-PDGFRa del conejo. Este trabajo fue apoyado por una subvención inicial de AUFF para E.P. y subvenciones Start Package de NovoNordiskFonden a E.P. (0071113) y a A.D.M. (0071116).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de 1,5 mL( Rendimiento de PCR probado, PP, 30.000 xg, Libre de ADN/DNasa-/RNasa, Baja unión al ADN, Estéril)Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S72.706.700Tubo de 1,5 mL
Tubo de 15 mL (PP/HD-PE, 20.000 xg, IVD/CE, IATA, ADN/DNasa-/RNasa-, No citotóxico, Libre de pirógenos, Estéril)Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S62.554.502Tubo
de 15 mLTubo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL Falcon, Fisher Scientific 352054Tubo FACS sin tapón de filtro
5 mL de poliestireno Tubo de fondo redondo con tapón de filtro de celdasFalcon, Fisher Scientific   352235Tubo FACS con tapón de filtro
Tubo de 5 mL (PP, esterilizable en autoclave no estéril)Colección VWR525.0946Tubo de 5 mL Tubo
50 mL( PP/HD-PE, 20.000 xg, IVD/CE, ADR, libre de ADN/DNasa-/RNasa, no citotóxico, libre de pirógenos, Estéril)Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S62.547.254Tubo de 50 mL
Alexa Fluor 555 Donkey anti-conejo IgG (H+L)Invitrogen, Thermo FisherLote: 2387458 (Cat # A31572)
Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H + L)Invitrogen, Thermo FisherLote: 2420713 (Cat # A31571)
ARIA 3BDFACS, Instalación central Centrífuga de la Universidad de Aarhus
5810CentrífugaEppendorf
Click-iT EdU Kit de proliferación celular para imágenes, Alexa Fluor 488 tinteInvitrogen, Thermo FisherLot: 2387287 (Cat# C10337)Kit de proliferación celular
Colágeno de piel de becerro Biorreactivo, Sigma Aldrich Fuente: SLCK6209 (Cat# C8919)
Colagenasa tipo IIWorthington, Fisher Scientific Lote: 40H20248 (cat# L5004177 )Colagenasa
DispasaGibco, Fisher Scientific Lote: 2309415 (cat# 17105-041 )Dispasa
Suero de burro (no estéril)Sigma Aldrich, MerckLote: 2826455 (Cat# S30-100mL)
Dumont nr. 5, 110 mmDumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S1606.327Pinzas rectas con puntas finas
Dumont nr. 7, 115 mmDumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S1606.335Pinzas
curvasF-10 Mezcla de nutrientes (Jamón) (1x), +L-glutaminaGibco, Fisher Scientific Lote. 2453614 (cat# 31550-023)
FITC anti-ratón CD31BioLegend, NordicBioSiteMEC13.3 (cat # 102506)
FITC Anti-ratón CD45BioLegend, NordicBioSite30-F11 (Cat# 103108)
Ácido acético glacial (100%)EMSURE, Merck   K44104563 9Cat # 1000631000)
Rotor de minitubos de cabeza sobre cabeza Fisher Scientific 15534080 (Modelo n.º 88861052)Rotorde minitubos de cabeza sobre cabeza
Suero de caballoGibco, Fisher Scientific Lot. 2482639 (cat# 10368902 )
Isotemp SWB 15FisherBrand, Fisher Scientific15325887Baño de agua agitador
MS2 mini-agitador IKA Unidad de vórtice
Aguja 20 G (0,9 mm x 25 mm)Microlanza BD, Fisher Scientific 304827aguja de 20G 
Tampón de formalina neutro 10%CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/SLote: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)
Filtro de células no pirogénico (40 µ M)Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S83.3945.040Filtro de células 
Azul Pacífico anti-ratón Ly-6A/E (Sca-1)BioLegend, NordicBioSiteD7 (Cat# 108120)
Anticuerpo primario Pax7DSHBLote: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)
PBS 10x concentrado en polvoFisher BioReagents, Fisher ScientificBP665-1
PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1)BioLegend, NordicBioSite429 (MVCAM. A) (Cat # 105720)
Pluma/estreptococoGibco, Fisher Scientific Lote. 163589 (cat# 11548876 )
Puntas de pipeta p10Puntas Art, barrera autosellante, Thermo Scientific2140-05Puntas de filtro preesterilizadas de baja retención, preesterilizadas Puntas
pipeta p1000Puntas Art, barrera autosellante, Thermo Scientific2279-05Puntas de filtro de baja retención, preesterilizadas, puntas
filtro Puntas de pipeta p20Puntas Art, barrera autosellante, Thermo Scientific2149P-05Puntas de filtro de baja retención, preesterilizadas,
pipeta p200Puntas de arte, barrera autosellante, Thermo Scientific2069-05Puntas de filtro de baja retención, preesterilizadas,
almohadilla protectoraAbena ACTC-7712  60 x 40 cm, 8 capas
Rainin, pipet-lite XLSMettler Toledo, Thermo Scientific 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05Pipetas (P10, P20, P200, P1000)
Recombinante anti-PDGFR-alfaRabMAb, abcamAB134123
Bisturí (eje n.º 3)Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S1902.502Bisturí
Hoja de bisturí n.º 11Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S1902.0911Bisturí
Scanlaf marsLabogeneGabinete de clase 2: MarsFlow banco
ScanRMicroscopio Olympus, Instalación central Universidad de Aarhus
TijerasFST14568-09
Serie 8000 DHIncubadora Thermo Scientific3540-MAR
Pipeta serológica 10 mLVWR612-3700Estéril, no pirogénica
Pipeta serológica 5 mLVWR, Avantor suministrado por VWR612-3702Jeringa estéril, no pirogénica
5 mL, punta Luer (6%), estéril BD Emerald, Fisher Scientific307731Jeringa
TC Dish 100, estándarSarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S83.3902Placa de Petri 
Superficie tratada con cultivo de tejidos (TC), poliestireno negro, fondo plano, estéril, tapa, paquete de 20Corning, Sigma Aldrich3764Placa de medio fondo de 96 pocillos
Triton X-100Sigma Aldrich, MerckFuente: SLCJ6163 (Cat # T8787)
de EP022628188 de de puntas de

Referencias

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