Detección de proteína priónica anormal por inmunohistoquímica

Resumen

El inmunomarcaje de proteínas priónicas anormales mediante protocolos inmunohistoquímicos requiere metodologías específicas de preparación de muestras y anticuerpos anti-PrP. El presente protocolo describe los pasos clave en el desenmascaramiento de epítopos para garantizar un inmunoetiquetado adecuado de PrP y minimizar la tinción de fondo no específica. Además, este enfoque considera medidas de bioseguridad al realizar estudios inmunohistoquímicos con los tejidos infectados por priones.

Resumen

Las proteínas priónicas anormales (PrP^Sc) son la isoforma asociada a la enfermedad de la proteína priónica celular y los marcadores diagnósticos de las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET). Estas enfermedades neurodegenerativas afectan a los seres humanos y a varias especies animales e incluyen la tembladera, la encefalopatía espongiforme bovina zoonótica (EEB), la desgaste crónica de los cérvidos (CWD) y la recientemente identificada enfermedad priónica del camello (CPD). El diagnóstico de las EET se basa en la inmunodetección de PrP^Sc mediante la aplicación de métodos de inmunohistoquímica (IHC) e inmunoblot occidental (WB) en los tejidos del encéfalo, es decir, el tronco encefálico (nivel obex). IHQ es un método ampliamente utilizado que utiliza anticuerpos primarios (monoclonales o policlonales) contra antígenos de interés en células de una sección de tejido. La unión anticuerpo-antígeno se puede visualizar mediante una reacción de color que permanece localizada en el área del tejido o célula donde se dirigió el anticuerpo. Como tal, en las enfermedades priónicas, como en otros campos de investigación, las técnicas de inmunohistoquímica no se utilizan únicamente con fines diagnósticos, sino también en estudios de patogénesis. Dichos estudios implican la detección de los patrones y tipos de PrP^Sc a partir de los descritos anteriormente para identificar las nuevas cepas de priones. Como la EEB puede infectar a los seres humanos, se recomienda que se utilicen instalaciones y/o prácticas de laboratorio de bioseguridad de nivel 3 (BSL-3) para manipular muestras de ganado, pequeños rumiantes y cérvidos incluidas en la vigilancia de las EET. Además, se recomiendan equipos de contención y dedicados a priones, siempre que sea posible, para limitar la contaminación. El procedimiento IHC de PrP^Sc consiste en un paso de desenmascaramiento de epítopos de ácido fórmico que también actúa como una medida de inactivación priónica, ya que los tejidos fijados en formalina e incrustados en parafina utilizados en esta técnica siguen siendo infecciosos. Al interpretar los resultados, se debe tener cuidado para distinguir el inmunomarcaje no específico del etiquetado objetivo. Para este propósito, es importante reconocer los artefactos de inmunomarcaje obtenidos en animales de control TSE-negativos conocidos para diferenciarlos de los tipos específicos de inmunomarcaje PrP^Sc , que pueden variar entre cepas de EET, especies hospedadoras y genotipo prnp , descrito más detalladamente en este documento.

Introducción

Según la hipótesis del prión, la isoforma anormal (PrP^Sc) es el componente primario, o único, del agente infeccioso en las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET). La confirmación para el diagnóstico de EET se basa en la inmunodetección de PrP^Sc mediante la aplicación de protocolos de inmunohistoquímica (IHC) y/o métodos de inmunoblot occidentales (WB) de tejidos de encéfalo¹.

IHQ es un método que emplea anticuerpos monoclonales o, en algunos casos, policlonales (como anticuerpos primarios) como primer paso en la inmunotinción de antígenos de interés específicamente dirigidos localizado....

Protocolo

El procedimiento IHQ descrito en este documento es un componente del proyecto de investigación FAIRJ-CT98-7021, "El establecimiento de una red europea para la vigilancia de las EET de rumiantes y la normalización y armonización del proceso y los criterios para la identificación de casos sospechosos". Sigue los criterios diagnósticos definidos por la Organización Mundial de Sanidad Animal, WOAH (anteriormente denominada Office International des Épizooties, OIE)¹ y el Laboratorio Europeo de Referencia para las EET animales ^8,11. El procedimiento IHC descrito también está acreditado de acu....

Resultados

Dado que es posible el inmunomarcaje diana no específico, es importante determinar el nivel de inmunomarcaje no específico en animales control con EET negativas conocidas. Este es un paso importante para interpretar adecuadamente el inmunomarcaje específico de PrP^{Sc 7} (Figura 2). Se ha observado que el marcado no diana por anticuerpos anti-PrP ocurre como tinción intraneuronal discreta de partículas finas (más evidente en el núcleo hipogloso y el .......

Discusión

Las EET son enfermedades zoonóticas potenciales. Tras la aparición de la EEB en 1986 en el Reino Unido, Portugal se convirtió en uno de los Estados miembros de la Unión Europea con mayor incidencia de esta enfermedad^14,15. Para controlar esta enfermedad, han surgido otras EET (tembladera clásica y atípica, variantes de la EEB, y actualmente la vigilancia de la desgaste crónica en cérvidos), mecanismos de vigilancia desarrollados por la Dirección General de Alimen.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Etanol absoluto	Labchem	LB0507-9010	Undituled
			Diluido al 90%, 70% y 50% en agua destilada
Complejo avidina-biotina y peroxidasa Vectastain Elite ABC kit Peroxidasa	Vector Laboratories	PK-6100	Prepare y mezcle suavemente 30 minutos antes de usar de acuerdo con las instrucciones del kit. No mezclar después de reposar.
Anticuerpo secundario biotinilado (IgG H+L anti-ratón de caballo)	Vector Laboratories	BA-2000-1.5	Diluir a 1/200 en TBS con 10% de suero normal de caballo. Prepare el volumen requerido en función del número de secciones.
Cromógeno Diaminobencidina- DAB, kit de sustrato, Peroxidasa	Vector Laboratories	SK-4100	Prepare antes de usar de acuerdo con las instrucciones del kit. Use 400 µ L de solución por sección.
Cámara de presión DakoCytomation Pascal	DAKO	S2800
Ehrlich' s Hematoxilina:
Hematoxilina	Merck 115938		Disuelva 2 g de hematoxilina en 100 mL de etanol absoluto. Añadir 100 mL de agua destilada, 10 mL de ácido acético glacial y 15 g de alumbre potásico con agitación constante. Agrega 100 mL de glicerina. El proceso de oxidación natural tarda 2 meses, antes de su uso.
Etanol absoluto	Labchem	LB0507-9010
Ácido acético glacial	Merck	101830
Alumbre de potasio	Merck	1.01047.1000
Glicerina	Merck	1.04091.1000
Solución de bloque de peroxidasa endógena (concentración al 3% H2O2):			40 mL Peróxido de hidrógeno (30% p/p) en 360 mL Metanol. Preparar antes
de usar Peróxido de hidrógeno (30% p/p)	Scharlau	HI0136
Metanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Ácido fórmico 98%	Merck	1.00264.1000	Microtomo sin diluir
	Shandon-AS325	Microtomo	Shandon-AS325
Medio de montaje Entellan	Merck	107960	Listo para usar.
Suero normal (20%) solución de bloqueo en TBS: Suero normal de caballo	Gibco	16050-122	Preparar el volumen final de acuerdo con el número de secciones en el ensayo (200 µ L de solución por sección).
Anticuerpo primario anti-PrP de ratón MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 Ovinos, incluidos los atípicos tembladera, cevinos, felinos. No apto para bovinos. Según el número de secciones del ensayo (200 µ L de solución por sección) y dilución de anticuerpos, prepare el volumen final en TBS suplementado con un 10% de suero normal de la especie en la que se elevó el anticuerpo secundario (suero normal de caballo) Dilución habitual de anticuerpos: MAb 2G11 1/100 pero la dilución de trabajo debe establecerse en cada nuevo lote para obtener la concentración que proporcione el etiquetado más fuerte con el fondo más bajo. Para el almacenamiento, congele los volúmenes alícuotas de un mínimo de 10 μ L en microtubos estériles. Descongele y use una alícuota a la vez.
Anticuerpo primario anti-PrP de ratón MAb 12F10	Caimán  Empresa Química	189710	PrP142-160 Bovino, no apto para ovinos Dilución habitual de anticuerpos: 1/200 pero también debe establecerse una dilución de trabajo. Preparar como MAb 2G11
Shandon CoverplateTM cámara	Thermo Scientific
Shandon Sequenza® Centro de inmunización	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® Gradilla portaobjetos inmunizante	Thermo Scientific	73310017
Solution Citrato Buffer (10 mM pH 6,1):			2,55 g de citrato trisódico dihidratado y 0,255 g de ácido cítrico en un litro de agua purificada. Ajuste el pH de la solución de trabajo a 6,1 utilizando 10 mM de solución de ácido cítrico (1,05 g de ácido cítrico en 500 mL de agua purificada) Prepare el día del ensayo.
Citrato trisódico dihidratado	Sigma-aldrich	S4641-500G
Ácido cítrico	Sigma Aldrich	C0759
Tarro y cesta de tinción	Deltalab	19360
		19361
Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus	VWR	631-0108
Solución salina tamponada Tris (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0,8% NaCI; pH 7,6):			10xTBS (solución madre 0,5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7,6): TRIZMA BASE 60,57 g y NaCl 80 g en 800 mL de agua purificada. Ajuste el pH de la solución madre con ácido clorhídrico al 37% y el volumen final a un litro con agua purificada (mantener 5± 3 & deg; C hasta 2 meses) Diluir la solución madre TBS 1/10 el día del ensayo.
TRIZMA BASE	Sigma Aldrich	T6066-1KG
Cloruro de sodio (NaCl)	Merck	106404
Xileno	Reactivos Panreac Applied Chem ITW	251769	sin diluir

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