Cultivo, congelación, procesamiento e imágenes de organoides y esferoides completos mientras aún están en un hidrogel

El futuro de la investigación y terapia celular está dentro de los cultivos celulares 3D ^1,2,3. Los modelos organoides y esferoides cierran la brecha entre los experimentos in vitro y los modelos animales al crear mejores modelos que imitan el desarrollo del cuerpo humano, la fisiología y las enfermedades 4,5,6,7,8,9. Sin embargo, la reproducibilidad y repetibilidad de estos modelos siguen siendo un desafío. Además, el manejo, la cosecha, la transferencia y la centrifugación de estas estructuras con las tecnologías actuales resultan en la pérdida o daño de los organoides y esferoides en muchas condiciones, lo que afecta significativamente los resultados.

A pesar de muchos protocolos para la tinción histológica, la tinción inmunohistoquímica, el etiquetado de inmunofluorescencia y la criopreservación, no existe un enfoque universal relacionado con la estandarización de las condiciones experimentales, el manejo y el procesamiento de estas delicadas estructuras sin perderlas o dañarlas. Los protocolos actuales también son increíblemente largos, alternando desde unos pocos días hasta varias semanas, e incluyen procedimientos complejos con varios reactivos 10,11,12,13,14. Además, la recolección, el pipeteo, la centrifugación y la transferencia de estructuras de cultivo 3D entre los vasos de cultivo celular y los crioviales causan cambios en el posicionamiento de las estructuras y las fuerzas mecánicas y, en última instancia, afectan la diferenciación y maduración de los organoides y esferoides. Se ha reportado que la topología tisular, el posicionamiento de las células y las fuerzas mecánicas impactan significativamente la diferenciación y maduración celular 6,15,16,17.

Por lo tanto, es deseable mejorar las tecnologías convencionales actuales para generar organoides y esferoides con calidad estable. Un método / dispositivo que omita la centrifugación y otros pasos descritos anteriormente y proporcione el material en un solo entorno seguro desde el principio hasta el final de los múltiples procesos sería beneficioso para alcanzar los datos más consistentes y confiables. Además, esto reducirá las limitaciones de tiempo, mano de obra y costos.

El dispositivo multipropósito (MD) descrito aquí proporciona un único entorno seguro para múltiples procesos de organoides y esferoides (Figura complementaria 1). Este dispositivo y los protocolos complementarios eliminan los pasos de recolección, pipeteo, transferencia y centrifugación. Los organoides y esferoides permanecen en su ambiente in vitro durante los procesos secuenciales. Este entorno comprende principalmente componentes naturales o sintéticos de la matriz extracelular, como los hidrogeles disponibles comercialmente. En otras palabras, los métodos descritos aquí permiten procesar, examinar y congelar una muestra completa de organoides/esferoides mientras aún están en una gota de hidrogel.

El dispositivo biocompatible es resistente a temperaturas entre 60 °C y -160 °C, lo que hace posible restaurar los organoides/esteroides en un tanque de nitrógeno líquido a -160 °C o preparar bloques de resina para microscopía electrónica a 60 °C. El nicho en el dispositivo ha sido diseñado para definir un espacio limitado para estructuras de cultivo 3D y estimular la formación de esferoides u organoides basados en los estudios previos 18,19,20,21,22,23. Esa parte del dispositivo es transparente y contiene un plástico específico que proporciona una alta calidad óptica (índice de refracción: 1.43; valor abbe: 58; espesor: 7.8 mil [0.0078 in o 198 μm]). Tanto el nicho como la parte "lateral" circundante causan autofluorescencia. El nicho transparente en el centro tiene un área de⁸⁰ mm 2, mientras que la parte lateral es de 600 mm². La profundidad del contenedor es de 15 mm y el grosor es de 1,5 mm. Estas características, además del tamaño y el diseño del dispositivo, permiten realizar observaciones bajo diferentes tipos de microscopio de alta tecnología y preparar las muestras para exámenes microscópicos electrónicos (Figura 2). El sistema de cierre del dispositivo proporciona dos posiciones, una sellada en el congelador y la otra que permite el flujo de gas en la incubadora. Los ensayos de proliferación y citotoxicidad de CCK8 demuestran efectos similares en las células en comparación con las placas de cultivo celular tradicionales (Figura complementaria 2). La prueba de exclusión de azul de tripano demuestra una alta viabilidad celular (94%) durante el cultivo celular en la DM (Figura 3).

Los procesos que se pueden realizar para una muestra en el dispositivo único comprenden (1) cultivo, (2) tinción histológica, (3) inmunotinción, incluido el etiquetado inmunohistoquímico e inmunofluorescente, (4) congelación, (5) descongelación, (6) examen bajo microscopios ópticos, como microscopios de campo claro, campo oscuro, fluorescencia, confocales y de súper resolución, (7) recubrimiento y examen directamente bajo un microscopio electrónico de barrido, o (8) preparación para microscopía electrónica de transmisión ( Figura 2).

Existen diferentes metodologías para la tinción histológica, el marcaje inmunohistoquímico o el marcado fluorescente de organoides y esferoides 10,11,12,13,14,24,25. Cosecharlos del hidrogel es el primer y principal paso de la tecnología actual. Después de este paso, algunos métodos permiten el inmunoetiquetado de montaje completo. Los organoides cosechados se incrustan en parafina, se seccionan y se etiquetan para teñir e inmunotinción en otros. Sin embargo, las secciones pueden no presentar toda la muestra y proporcionar solo datos limitados relacionados con la arquitectura 3D de la estructura. Además, el daño a estas estructuras 3D y la pérdida de antigenicidad son efectos secundarios bien conocidos de estas tecnologías.

Los nuevos protocolos complementarios para exámenes microscópicos en este artículo permiten un análisis de muestras de montaje completo aún en un hidrogel. Los protocolos descritos aquí incluyen dos formulaciones recientemente desarrolladas: solución para inmunohistoquímica (S-IHC) y solución para etiquetado de inmunofluorescencia (S-IF). Los métodos con estas soluciones permiten a los investigadores obtener datos más precisos, ya que no hay efectos nocivos de los flujos de trabajo tradicionales, como la centrifugación, el pipeteo y la transferencia de las estructuras delicadas. El protocolo descrito aquí también elimina la necesidad de recolección, bloqueo, limpieza y pasos de recuperación de antígenos, y acorta todo el procedimiento a 6-8 h. Además, la metodología permite agregar simultáneamente de uno a tres anticuerpos al mismo S-IF. Por lo tanto, es posible obtener los resultados el mismo día incluso después de los múltiples experimentos de etiquetado, que es otra ventaja del protocolo descrito aquí; Los protocolos tradicionales de etiquetado de inmunofluorescencia de montaje completo suelen tardar entre 3 días y varias semanas 10,11,12,13,14.

También se omite la incorporación de parafina, otro paso dañino que reduce la antigenicidad. La estructura 3D permanece en su entorno in vitro desde el principio hasta el final del examen microscópico. Dado que la estructura 3D permanece en sus condiciones de crecimiento, la expresión de proteínas y los datos de localización imitan mejor las condiciones in vivo. Se esperan resultados más precisos, ya que la metodología elimina los pasos que afectan la expresión del antígeno de la muestra. La Tabla 1 y la Tabla 2 demuestran cómo estos nuevos protocolos eliminan pasos, ahorran tiempo y mano de obra en el laboratorio y reducen los costos y los productos de desecho en comparación con los flujos de trabajo tradicionales.

Además de los pasos cruciales descritos anteriormente, otro problema es proporcionar un medio de criopreservación y un método para preservar la estructura 3D de la muestra con mayores tasas de viabilidad celular 26,27,28,29,30,31. La criopreservación es esencial para crear un sistema modelo estable y permitir el biobanco de organoides y esferoides^32,33. Biobanco toda la estructura 3D original permitirá una recapitulación más fiel del estado natural de salud o enfermedad. Las consideraciones clave son la conveniencia y confiabilidad de la criopreservación y la descongelación de organoides / esferoides. La recuperación de organoides post-deshielo es muy baja en la mayoría de las tecnologías actuales, a menudo menos del 50%. Sin embargo, estudios recientes han mostrado resultados prometedores con mejores tasas de supervivencia^26,27,28,29. Lee et al. demostraron que el 78% de las células esferoides sobrevivieron después de la criopreservación cuando utilizaron la solución de la Universidad de Wisconsin que contenía 15% de DMSO²⁸. La razón de supervivencia celular aumentó al 83% en el estudio de Arai et ^al.29. Sin embargo, los resultados después de la criopreservación se ven afectados significativamente ya que las estructuras 3D no pueden mantener las mismas características y calidad. Además, se requieren reactivos sin suero para las buenas prácticas de fabricación en entornos farmacéuticos y de diagnóstico. Los flujos de trabajo tradicionales utilizan un medio que contiene suero bovino fetal (FBS) y dimetilsulfóxido (DMSO) para el método de congelación lenta, ambos asociados con discapacidades. FBS es un producto derivado de animales y puede tener variaciones de lotes. El DMSO es un crioprotector muy exitoso, pero la exposición a largo plazo, especialmente durante la descongelación, puede causar efectos citotóxicos^30,31.

Este artículo también describe la metodología de congelación/descongelación de organoides o esferoides enteros mientras aún están en un hidrogel. En el estudio se utilizan dos fórmulas para congelar organoides y esferoides: (1) DMSO al 10% que contiene solución de congelación tradicional (FS) y (2) un medio de criopreservación libre de suero y DMSO. Este medio de criopreservación contiene componentes de matriz extracelular, que son diferentes de las fórmulas actuales. La matriz extracelular comprende dos clases principales de macromoléculas, proteoglicanos y proteínas fibrosas, que son esenciales para el andamiaje físico de los constituyentes celulares, pero también inician procesos necesarios para la morfogénesis, diferenciación y homeostasis tisulares 34,35,36,37,38,39,40 . Los colágenos proporcionan resistencia a la tracción, regulan la adhesión celular, apoyan la quimiotaxis y la migración, y dirigen el desarrollo de los tejidos³⁷. Además, las fibras de elastina proporcionan retroceso a los tejidos que sufren estiramientos repetidos³⁸. Una tercera proteína fibrosa, la fibronectina, dirige la organización de la matriz extracelular intersticial y tiene un papel crucial en la mediación de la unión celular y funciona como un mecano-regulador extracelular³⁹. Du et al. han demostrado el efecto crioprotector del hidrolizado de colágeno de pollo sobre el sistema modelo de actomiosina natural⁴¹. Sus resultados sugieren que el hidrolizado de colágeno puede inhibir el crecimiento de cristales de hielo, reducir la desnaturalización por congelación de proteínas y la oxidación de manera similar a los crioprotectores comerciales, y proporcionar una mejor estructura de gel después de los ciclos de congelación y descongelación. Por lo tanto, la adición de componentes de matriz extracelular a los medios de criopreservación proporciona un entorno más seguro y protector para la muestra y ayuda a las estructuras vivas a sanar después de la congelación-descongelación.

Además, el presente estudio describe un protocolo sencillo para etiquetar las membranas citoplasmáticas y los núcleos de organoides y esferoides vivos mientras aún están en el hidrogel.

1. Cultivo de organoides y esferoides

1. Coloque el hidrogel en hielo durante la noche (en un refrigerador o en una cámara frigorífica) para descongelar.
2. Coloque el dispositivo multipropósito disponible comercialmente (MD; consulte la Tabla de materiales) en la incubadora 1 día antes del experimento (37 °C, 5% de_CO2) para calentarlo.
3. Introduzca las puntas de pipeta estériles de extremo ancho en la nevera a 4 °C.
   NOTA: Los pasos 1.1-1.3 deben realizarse el día 0 y los pasos 1.4-1.11 deben realizarse el día 1.
4. Coloque el hidrogel sobre hielo en una campana de flujo laminar durante 15 min.
   1. Opcional: Diluir el hidrogel en medio de cultivo de células frías de acuerdo con la recomendación del fabricante.
5. Coloque el tubo que contiene una bolita de células HepG2 (línea celular de carcinoma hepatocelular obtenida comercialmente; consulte la Tabla de materiales) en hielo.
6. Placa 30-35 μL de hidrogel 100% dentro del nicho del dispositivo precalentado para crear una gota de gel.
7. Coloque 10.000 células HepG2 en el centro de la parte superior de cada gota de hidrogel (Figura 2) e incube durante 15 minutos a 37 °C.
8. Cubra la gota de hidrogel con 200 μL de Medio de Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco con 10% de Suero Bovino Fetal.
9. Cubra la tapa del MD en la posición correcta para permitir el flujo de gas y coloque el dispositivo en la incubadora.
10. Alimente las células con 200 μL de DMEM con 10% de FBS cada dos días.
11. Comprobar el crecimiento de los esferoides bajo un microscopio invertido (Figura 3). La formación de esferoides comienza después del^3er día. El video 1 muestra la ubicación de los esferoides en diferentes niveles en una cúpula de hidrogel.
    NOTAS: Se recomienda encarecidamente aspirar suavemente el líquido que rodea el hidrogel y agregar lentamente el nuevo líquido al ambiente para evitar dañar las gotas de hidrogel.

2. Tinción de hematoxilina y eosina de organoides/esferoides de montaje entero en un hidrogel

1. Calentar el fijador (4% paraformaldehído; PFA), PBS y hematoxilina (ver Tabla de Materiales) hasta 37 °C.
2. Aspirar el medio que rodea la gota de hidrogel con una pipeta, añadir 100-200 μL de PFA al 4% para fijar e incubar durante 15-20 min a 37 °C.
3. Aspirar el PFA al 4% y añadir 200 μL de PBS para lavar 3 veces durante 5 min cada una a 37 °C. A continuación, aspirar el PBS e incubar con 200 μL de solución de hematoxilina durante 15-20 min a 37 °C.
4. Aspirar la hematoxilina y añadir 200 μL de_dH2Opara lavar 3 veces durante 10 min cada una a 37 °C. Aspirar el_dH2Oe incubar con 200 μL de etanol durante 5-10 min a 37 °C.
5. Aspirar el etanol e incubar con 200 μL de eosina (ver Tabla de materiales) durante 10 min a 37 °C. Aspirar la eosina y añadir 200 μL de_dH2Opara lavar durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
6. Aspirar el_dH2Oy añadir 100 μL de glicerol para cubrir la gota de hidrogel como medio de montaje.
7. Opcional: Monte el nicho con un cubreobjetos. Este paso se puede omitir para evitar apretar organoides/esferoides de tamaño considerable.
8. Cierre firmemente la tapa de MD para evitar que se seque hasta el examen. La muestra es estable para su examen durante al menos 6 meses.

3. Inmunohistoquímica de organoides/esferoides de montaje completo en un hidrogel

1. Calentar la solución obtenida comercialmente para inmunohistoquímica (S-IHC; ver Tabla de materiales) a 37 °C.
2. Incubar los organoides o esferoides en el hidrogel con peróxido de hidrógeno al 3% (_H2O2) en 200 μL de_dH2O durante5 min a 37 °C.
3. Aspirar la solución de peróxido de hidrógeno y lavar en_dH2Odurante 5 min a 37 °C. Aspirar el_dH2Oe incubar dos veces con 100 μL de S-IHC a 37 °C durante 10 min cada una.
4. Aspirar la S-IHC e incubar con 100 μL de anticuerpo primario (ver Tabla de materiales) diluido en S-IHC durante 1-2 h a 37 °C (siguiendo las recomendaciones del fabricante con respecto a la dilución de trabajo).
5. Aspirar la solución de anticuerpos primarios e incubar con 100 μL de S-IHC 3x durante 5 min cada uno a 37 °C.
6. Aspirar 100 μL de S-IHC e incubar con un anticuerpo secundario biotinilado (ver Tabla de materiales) durante 10 min a 37 °C.
7. Aspirar la solución de anticuerpos secundarios e incubar con 100 μL de S-IHC 3x durante 5 min cada uno a 37 °C. Aspirar la S-IHC e incubar con 100 μL de peroxidasa de rábano picante (HRP) marcada con estreptavidina (ver Tabla de materiales) durante 10 min a 37 °C.
8. Aspirar la estreptavidina marcada con HRP e incubar con 100 μL de S-IHC 3x durante 5 min cada uno a 37 °C.
9. Aspirar la S-IHC e incubar con 100 μL de mezcla de solución de cromógeno DAB/AEC (ver Tabla de materiales) durante 5-10 min a 37 °C.
10. Controle la intensidad de la tinción bajo un microscopio óptico.
11. Lavar con dH 2 O 3x durante₂min cada uno.
12. Opcional: Incubar con 100 μL de hematoxilina (ver Tabla de Materiales) para la contratinción nuclear durante 5 min a 37 °C.
13. Aspirar la Hematoxilina y lavar en_dH2Odurante 5 min.
14. Aspirar el_dH2Oy cubrir la gota de hidrogel con 100 μL de glicerol como medio de montaje.
15. Cierre firmemente la tapa del MD hasta el examen microscópico.
    NOTAS: Los pasos de recuperación de antígenos y bloqueo de proteínas se omiten en este protocolo ya que S-IHC elimina estos pasos.

4. Etiquetado por inmunofluorescencia de organoides/esferoides de montaje completo en un hidrogel

1. Calentar los siguientes materiales a 37 °C: PFA AL 4%, PBS, S-IF, solución de anticuerpos primarios en S-IF, solución de anticuerpos secundarios en S-IF, tinción nuclear y glicerol (ver Tabla de materiales).
2. Aspirar el medio de cultivo celular y fijar con 200 μL de PFA al 4% durante 15-30 min a 37 °C. Aspirar el fijador y lavar en S-IF 3 veces durante 10 min cada una a 37 °C.
3. Agregue dH₂O al lado que rodea el nicho para proporcionar humedad durante los siguientes pasos.
4. Aspirar el S-IF que rodea la gota de hidrogel e incubar la gota de hidrogel con 100 μL de solución de anticuerpos primarios (ver Tabla de materiales) en S-IF durante 30-60 min a 37 °C.
5. Aspirar la solución de anticuerpos primarios y lavar en S-IF 3 veces durante 10 min cada una a 37 °C.
6. Aspirar el S-IF e incubar con 100 μL de solución de anticuerpos secundarios (ver Tabla de materiales) en S-IF durante 30-60 min a 37 °C en la oscuridad.
7. Aspirar la solución de anticuerpos secundarios y lavar con PBS 3x durante 10 min cada uno a 37 °C en la oscuridad.
8. Aspirar el PBS e incubar con 100 μL de tinción de ADN nuclear que contenga medio de montaje o glicerol a 37 °C en la oscuridad.
9. Llene el nicho con glicerol para evitar que se seque.
10. Opcional: Cubra el nicho con un cubreobjetos. Este paso se puede omitir para evitar apretar los organoides / esferoides.
11. Cierre herméticamente el MD. Las muestras en MD pueden almacenarse a 4 °C en la oscuridad durante al menos 6 meses con una pérdida mínima de fluorescencia.
12. Utilice los siguientes ajustes para el examen microscópico confocal: establezca el valor estenopeico de todos los canales en 20,1, mantenga la constante del maestro de ganancia en 550 para 488 nm, 485 para 550 nm y 450 para 594 nm, mantenga constante la potencia del láser para todos los experimentos y el porcentaje más bajo en 2,0.
    NOTAS: Anticuerpos primarios: Anti-Na-K ATPasa (1:100), Anti-Arginasa (1:50), Antialbúmina (1:50), Anti-Beta-galactosidasa (1:25), Anticuerpo antimitocondrial (1:100), Anticuerpo Anti-Golgi (1:50), Anti-citoqueratina 5 (1:100), Anticuerpo Ov6 (1:100). Anticuerpos secundarios: Cabra anti-Conejo IgG (H+L)- 488, Cabra anti-Conejo IgG (H+L)-550, Cabra anti-Ratón IgG (H+L)-488, Cabra anti-Ratón IgG (H+L)-550, Cabra anti-Pollo IgY(H+L)-647. La dilución para todos los anticuerpos secundarios es 1:100. Además, también se utiliza FITC-faloidina (1:100), un anticuerpo conjugado (ver Tabla de materiales).

5. Etiquetado de la membrana plasmática y el núcleo de organoides y esferoides vivos en un hidrogel

1. Prepare la solución de etiquetado que contenga aglutinina de germen de trigo fluorado de Alexa (5.0 μg / ml) y Hoechst (2 μM) en la solución salina equilibrada de Hank (HBSS), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales), y caliente hasta 37 ° C.
2. Aspirar el medio de cultivo celular y añadir 100 μL de solución de etiquetado para cubrir la gota de hidrogel. Incubar durante 15-30 min a 37 °C.
3. Retire la solución de etiquetado y lave dos veces en PBS 2 veces durante 10 minutos cada una a 37 °C. Opcional: Fijar con 200 μL de formaldehído al 4% durante 15 min a 37 °C.
4. Cubra la gota de hidrogel con glicerol como medio de montaje. Opcional: Monte el nicho con una cubierta de vidrio.
5. Cierre bien la tapa del MD y manténgalo refrigerado en la oscuridad hasta el examen microscópico fluorescente/confocal. Es estable durante al menos 6 meses.

6. Congelación y descongelación de organoides/esferoides de montaje entero en un hidrogel

1. Congele los organoides siguiendo los pasos a continuación.
   1. Calentar la solución de congelación obtenida comercialmente (FS; ver Tabla de materiales) a 37 °C.
   2. Aspire suavemente los medios de cultivo celular que rodean la cúpula de hidrogel.
   3. Añadir 200 μL de FS suavemente. Incubar la muestra con FS a 37 °C durante 1 h.
   4. Cierre bien la tapa del dispositivo y colóquelo en una caja de espuma. Coloque esta caja de espuma en otra caja de espuma, como se muestra en la Figura complementaria 3. Cierre ambas cajas de espuma herméticamente. Dos cajas de espuma una dentro de la otra proporcionan un rango de gradiente de enfriamiento de temperatura de 1 a 2 ° C / min de la muestra en un congelador de -20 ° C.
   5. Colocar la caja a -20 °C durante 2 h. Transfiera la caja a un congelador a -80 °C y déjela toda la noche.
   6. Saque la muestra de las cajas. La muestra en el MD puede conservarse en el congelador de -80 °C durante 6 meses.
   7. Transfiera el MD que contiene la muestra al tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
2. Descongela los organoides siguiendo los pasos a continuación.
   1. Saque la MD que contiene la muestra del congelador/tanque de nitrógeno y colóquela directamente en una incubadora a 37 °C. Incubar durante 1 h a 37 °C.
   2. Añadir 200 μL de medio de cultivo caliente al nicho (la proporción de FS a medio de cultivo celular es de 1:1) e incubar durante 30 min a 37 °C.
   3. Añadir más medio de cultivo caliente al nicho (la proporción de FS a medio de cultivo celular es de 1:2) e incubar durante 30 min a 37 °C.
   4. Aspirar suavemente el medio y la mezcla de FS. Proceda a la microscopía electrónica de barrido (paso 7) y la microscopía electrónica de transmisión (paso 8) de los organoides/esferoides de montaje completo en el hidrogel.

7. Microscopía electrónica de barrido de organoides/esferoides de montaje completo

1. Caliente la solución fijadora y postfijadora de Karnovsky (consulte la Tabla de materiales) a temperatura ambiente (RT).
2. Aspirar el medio de cultivo celular que rodea el hidrogel en la DM. Coloque la muestra en el MD sobre hielo en la campana de flujo laminar durante 15 min.
3. Aspirar el hidrogel licuado que rodea los organoides/esferoides muy suavemente. Una cantidad limitada de matrigel puede permanecer en el nicho para evitar dañar y perder la muestra.
4. Fijar con fijador de Karnovsky (2% PFA, 2,5% glutaraldehído en 0,15 M de tampón de cacodilato, y 2 mM CaCl₂; ver Tabla de materiales) en RT durante 1 h.
5. Aspirar el fijador suavemente y lavar con agua destilada (dH₂O) 3 veces durante 15 min cada una.
6. Aspirar suavemente el_dH2Oy fijar con solución postfijadora (tetróxido de osmio acuoso al 1% [OsO₄]; ver Tabla de materiales) a RT durante 1 h.
7. Aspirar suavemente el postfijador y lavar con agua destilada (_dH2O) 3x durante 15 min cada uno.
8. Deshidratar en una serie graduada de etanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), mezcla de etanol/acetona (1:1; 1:2) y acetona absoluta a RT durante 15 min cada una.
9. Secar con un secador de punto crítico.
10. Cubra la muestra en el dispositivo con oro/paladio de 6 nm usando un recubridor de pulverización catódica (consulte la Tabla de materiales) durante 90 s.
11. Observe bajo un microscopio electrónico de barrido con un detector de electrones secundario en la lente a 2-3 kV en modo vacío (5 x ^10-6 mA). Tome imágenes con una distancia de trabajo de 8.1-8.2 mm y con aumentos de 675x, 1050x y 1570x.
    NOTAS: Todos los pasos se realizan en el MD. Use 200-250 μL de solución para cada paso.

8. Microscopía electrónica de transmisión de organoides/esferoides de montaje completo en un hidrogel

1. Calentar el fijador de Karnovsky a 37 °C. Aspirar el medio de cultivo celular que rodea el hidrogel en la DM.
2. Fijar la muestra con el fijador de Karnovsky en RT durante 1 h. Lavar con dH₂O 3x durante 15 min cada uno.
3. Post-fijación con_OsO4 acuoso al 2% y ferrocianuro de potasio al 2,5% a RT durante 45 min. Lavar con dH₂O 3x durante 10 min cada uno.
4. Incubar en tiocarbohidrazida al 0,5% (TCH; ver Tabla de materiales) a RT durante 30 min. Lavar con dH₂O 3x durante 10 min cada uno.
5. Incubar en_OsO4 acuoso al 2% a RT durante 30 min. Lavar con dH₂O 3x durante 10 min cada uno.
6. Incubar en solución de acetato de uranilo al 2% (ver Tabla de materiales) a RT durante 1 h.
   NOTA: En este paso, los esferoides se pueden mantener a 4 °C durante la noche.
7. Incubar en solución de aspartato de plomo (ver Tabla de materiales) a 60 °C durante 45 min. Lavar con dH₂O 3x durante 10 min cada uno.
8. Deshidratar en una serie graduada de etanol (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) y acetona absoluta a RT durante 15 min cada uno.
9. Tratar con una mezcla de (1:1; 1:2) acetona/resina Epon y resina Epon pura (ver Tabla de materiales) en RT durante 2 h cada uno.
10. Polimerizar la resina a 60 °C durante la noche (mínimo de 16 h). Después de la polimerización, retire el bloque de resina del MD, como se muestra en la Figura complementaria 4.
11. Fije el bloque de resina a uno más grande con un pegamento de resina. Recorta el bloque y alcanza la ubicación de organoides o esferoides.
12. Obtenga secciones semidelgadas (1,000 nm) y ultradelgadas (60 nm) usando un ultramicrotomo (consulte la Tabla de materiales).
13. Coloque las secciones ultrafinas en rejillas de cobre de malla 100 y observe bajo un microscopio electrónico de barrido con un detector STEM a un voltaje de aceleración de 30 kV. Capture imágenes con una distancia de trabajo de 44 mm y con aumentos de 2580x, 5020x y 6060x.
    NOTAS: Utilice 200-250 μL de solución para cada paso. Los pasos 8.1-8.10 se realizan en el MD.

El presente artículo representa un dispositivo multipropósito (MD) y metodologías complementarias para el cultivo, la congelación, la descongelación, la tinción histológica, la tinción inmunohistoquímica, el etiquetado de inmunofluorescencia, el recubrimiento y el procesamiento de organoides o esferoides completos mientras aún se encuentran en un hidrogel en un solo entorno de diseño único. El estudio actual fue diseñado para preparar esferoides de cáncer de hígado HepG2 en 35 gotas de hidrogel en 35 DM. Los experimentos se realizaron por triplicado para garantizar la precisión. Además, los organoides pulmonares en DM fueron inmunofluorescentes marcados como un ejemplo para demostrar los resultados de las metodologías actuales para estudios de organoides.

La figura 1 muestra una mirada cercana al dispositivo que contiene una cúpula de hidrogel. El tamaño y la forma del nicho están diseñados para proporcionar un entorno protector para el hidrogel que contiene los organoides / esferoides y guardar los reactivos utilizados durante diversos procesos. Además, la parte lateral del dispositivo que rodea el nicho se puede utilizar como cámara de humedad durante los experimentos de inmunotinción. El medio para alimentar la muestra puede variar entre 100-200 μL, dependiendo de la altura de la gota de hidrogel. El estudio actual se centra en el método basado en domo, ya que muchos hidrogeles, componentes comerciales de matriz extracelular y extractos de membrana basal permiten al usuario preparar gotas. Sin embargo, también es posible llenar el nicho de la DM con el hidrogel y luego sembrar las células dentro de él para generar organoides / esferoides. Ese método podría ser preferido si la viscosidad de la matriz no permite la preparación de cúpulas o si el experimento incluye grandes volúmenes de organoides. El tipo de hidrogel y la relación hidrogel/medio para la preparación de gotas pueden variar según el tipo de célula, el diseño experimental y el medio. Figura 1  También representa el diseño del dispositivo que permite investigar los organoides / esferoides bajo microscopios de campo claro, confocales y electrónicos de barrido, mientras que los organoides / esferoides todavía están en su entorno nativo in vitro .

La Figura 2 presenta cómo sembrar células en un hidrogel y examinar el desarrollo de esferoides u organoides. El diseño y las dimensiones del dispositivo multipropósito también se han presentado en esa figura. El video 1 muestra la ubicación de los esferoides en crecimiento 3D en un hidrogel. La Figura 3 representa imágenes en vivo de esferoides en crecimiento desde el día 3 hasta el día 21. El tiempo para la formación de esferoides y organoides puede variar según la naturaleza de la muestra. Por ejemplo, los esferoides de las células HepG2 y las células HEK se formaron en 3 días, mientras que la formación de organoides hepáticos y biliares duró 2 semanas durante los experimentos.

Los esferoides teñidos con hematoxilina y eosina se ven en la Figura 4. La imagen representa esferoides bien conservados y teñidos homogéneamente en diferentes tamaños y fusiones de esferoides. Las células vivas en el centro de los esferoides son dignas de mención. La imagen también demuestra las delicadas conexiones entre las células de diferentes esferoides. Estas conexiones frágiles no se podían visualizar después de los flujos de trabajo tradicionales, ya que la transferencia, el pipeteo o la centrifugación las dañarían. Figura 5  demuestra inmunotinción de esferoides con el anticuerpo específico para Arginasa, uno de los marcadores más comunes para el diagnóstico y pronóstico del carcinoma hepatocelular42,43. Las micrografías revelan células de cáncer de hígado diferenciadas e indiferenciadas en los mismos esferoides. Esta figura contiene imágenes con y sin contratinción con Hematoxilina. Los investigadores podrían optar por omitir la contratinción con hematoxilina en los casos en que sería difícil diferenciar las áreas etiquetadas en una estructura 3D.

La Figura 6 representa otro protocolo sencillo para la visualización de montaje completo de organoides/esferoides vivos en un hidrogel: tinción de membrana celular viva y núcleo. La metodología permite la misma densidad de etiquetado en la periferia y el centro, mostrando una penetración completa del reactivo. La Figura 7, la Figura 8 y la Figura 9 muestran imágenes representativas de esferoides marcados con uno, dos o tres anticuerpos, respectivamente. De uno a tres anticuerpos primarios se diluyen en S-IF simultáneamente. Del mismo modo, de uno a tres anticuerpos secundarios coincidentes adecuados para el experimento se diluyen simultáneamente en S-IF. El protocolo de inmunoetiquetado permite a los investigadores marcar las estructuras 3D en 4-6 h sin perderlas ni dañarlas. El fondo es transparente y la tecnología utilizada aquí no requiere limpieza adicional, recuperación de antígenos o métodos / soluciones de bloqueo. El método también permite a los investigadores etiquetar la muestra con múltiples anticuerpos en un solo paso. En otras palabras, el usuario prepara una solución que contiene de uno a tres anticuerpos primarios y otra solución compatible con uno a tres anticuerpos secundarios. El protocolo descrito aquí elimina los pasos de etiquetado secuencial con diferentes anticuerpos en metodologías convencionales.

La figura 10 representa imágenes microscópicas electrónicas de barrido y transmisión de los esferoides. La primera fila muestra imágenes de esferoides enteros en el MD bajo un microscopio electrónico de barrido. La segunda fila contiene imágenes microscópicas electrónicas de transmisión de esferoides después de la preparación de los bloques de resina que contienen esferoides de montaje completo en el MD, así como imágenes de esferoides seccionados y teñidos. Los orgánulos citoplasmáticos bien conservados y otras características ultraestructurales de las células demuestran la eficacia de este protocolo sencillo, que protege la estructura 3D de toda la muestra. El MD también permite a los investigadores congelar y descongelar las muestras de montaje completo en un hidrogel. Figura 11  Demuestra domos de hidrogel y los esferoides a un aumento más alto antes y después de la congelación. La irregularidad en los límites de la cúpula de hidrogel es notable. Sin embargo, la redondez de los esferoides criopreservados es casi estable después de la descongelación en comparación con los esferoides antes de la congelación. Los métodos de etiquetado de membrana y núcleo de células vivas también se aplican 48 h después de la descongelación para demostrar cómo el procedimiento de congelación / descongelación afectó la arquitectura 3D, la membrana celular y la viabilidad celular. La solución de congelación tradicional que contiene dimetilsulfóxido y la solución actual recién formulada, SF, demuestran resultados similares. Más del 75% de las estructuras 3D podrían sobrevivir en este protocolo. Sin embargo, se necesitan más experimentos para revelar los efectos secundarios a largo plazo de cada formulación en organoides y esferoides.

La Tabla 1 y la Tabla 2 comparan los flujos de trabajo tradicionales con los descritos aquí en función del número de pasos, la duración y la producción de residuos (es decir, el número total de guantes de plástico, puntas de pipeta, pipetas serológicas, tubos de centrífuga, tubos de microcentrífuga, recipientes de cultivo celular, crioviales, etc. para cada flujo de trabajo).

La Figura complementaria 1 representa pasos secuenciales que se pueden realizar en un solo MD esquemáticamente. La Figura complementaria 2 muestra los resultados de los experimentos diseñados para comparar la viabilidad celular, la toxicidad y las tasas de proliferación de las células HepG2 en una MD o un plato tradicional con fondo de vidrio. La Figura complementaria 3 muestra las cajas de espuma que se han utilizado para congelar las muestras en MD. La Figura complementaria 4 resume los pasos para sacar un bloque de resina de un MD. La Figura complementaria 5 incluye imágenes de organoides de las vías respiratorias que fueron marcados con inmunofluorescencia y luego visualizados mientras aún estaban en MD. Del mismo modo, el video 2 demuestra dos organoides de las vías respiratorias marcados con inmunofluorescencia en un MD. Finalmente, la Figura Suplementaria 6 es un gráfico que compara la intensidad media de la intensidad del etiquetado de la membrana celular en esferoides vivos antes y después de la congelación utilizando el flujo de trabajo tradicional y el flujo de trabajo descrito aquí. El software Image J se ha utilizado para el análisis.

Figura 1: El dispositivo de cultivo celular multipropósito (DM). (A) El nicho (N), la parte central del dispositivo, está diseñado para crear un entorno protector para los organoides / esferoides cultivados en una gota de hidrogel (D) durante los procesos secuenciales. El lado (S), la parte circundante del nicho, se puede usar como cámara humidificadora durante experimentos de inmunotinción. (B) El centro transparente en la tapa permite al usuario observar los organoides / esferoides cuando el dispositivo está cerrado. (C) La cúpula de hidrogel que contiene organoides en el MD puede teñirse o incrustarse en un bloque de resina para microscopía electrónica de transmisión. La tapa también incluye el nicho (N) para la metodología de gota colgante. El tamaño y el diseño del dispositivo permiten al usuario examinar los organoides / esferoides bajo (D) campo claro, (E) confocales y (F) microscopios electrónicos de barrido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Células de siembra dentro de un hidrogel. (A) El pellet de celda en la pipeta se inserta en la parte superior de la cúpula. Después de 3-5 días, los esferoides se hacen visibles en la cúpula, especialmente en la periferia de la gota. (B) Se capturaron y fusionaron cuatro imágenes en vivo de esferoides en crecimiento de cada cuarto en una cúpula. Barra de escala = 200 μm. (C)El diseño y las dimensiones (en centímetros) del dispositivo multipropósito (MD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Desarrollo de esferoides en una gota de hidrogel desde el día 3 hasta el día 21. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Esferoides de montaje entero teñidos con hematoxilina y eosina dentro de la DM. Visualización de las conexiones entre las células situadas en los esferoides adyacentes o en fusión. Los delicados procesos entre las células (flechas) son visibles ya que la muestra de montaje completo en el hidrogel se fija, se tiñe y se examina sin dañar las estructuras de crecimiento 3D. Barra de escala: día 3, día 9 = 50 μm; Día 7, Día 17 = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Tinción inmunohistoquímica de esferoides de montaje completo en el hidrogel dentro de la DM. Las muestras fueron inmunoteñidas con un anticuerpo específico para arginasa. Las células positivas de arginasa (flechas rojas) y negativas (flechas negras) se observan en los esferoides. Las imágenes son de dos experimentos: (A-C) sin y (D-F) con contratinción con hematoxilina. Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Imagen confocal de un organoide vivo en el hidrogel. Los organoides vivos fueron etiquetados con la membrana celular viva (WGA) y tinciones de núcleo (Hoechst). Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Marcaje de inmunofluorescencia de esferoides de montaje completo en un hidrogel con un anticuerpo y una tinción nuclear (Hoechst). (A-C) El panel superior muestra un esferoide marcado con un anticuerpo específico para Na-K ATPasa en la membrana celular. (D-F) El panel inferior muestra la ubicación de otro anticuerpo específico para la arginasa, una proteína citosólica específica para el carcinoma hepatocelular, en los esferoides del cáncer de hígado. Duración del protocolo de tinción: 6 h. Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Etiquetado por inmunofluorescencia de esferoides de montaje completo en un hidrogel con dos anticuerpos y una tinción nuclear (Hoechst). (A-C) El panel superior muestra un esferoide marcado con dos anticuerpos específicos para albúmina y Ov6. Barra de escala = 5 μm. (D-F) El panel inferior muestra la ubicación de la proteína alfa feto y Ov6 en los esferoides del cáncer de hígado. Barra de escala = 20 μm. Duración del protocolo de tinción: 6 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Marcaje de inmunofluorescencia de esferoides de montaje completo en un hidrogel con tres anticuerpos y una tinción nuclear (Hoechst). (A-E) El esferoide en el panel superior está marcado con anticuerpos específicos para arginasa, Na-K ATPasa y beta-galactosidasa. Barra de escala = 10 μm. (F-J) El panel central muestra un esferoide marcado con Ov6, beta-galactosidasa y proteína alfa-feto. Barra de escala = 20 μm. (K-O) El esferoide en el panel inferior ha sido marcado con FITC-faloidina, anticuerpo antimitocondrial y anticuerpo anti-Golgi. Barra de escala = 20 μm. Tenga en cuenta la alta especificidad del etiquetado y el fondo reducido. Duración del protocolo de tinción: 6 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Imágenes de microscopía electrónica. (A-C) Imágenes microscópicas electrónicas de barrido de esferoides enteros en el hidrogel en el MD. Barra de escala = 10 μm. (D-F) Las características ultraestructurales de las células en un esferoide también se han visualizado bajo un microscopio electrónico de transmisión. Barras de escala: (D) = 4 μm; (E,F) = 2 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: Imágenes en vivo de esferoides antes y después de la congelación. (A-F) La irregularidad de los bordes de las cúpulas de hidrogel es evidente después de la congelación. Sin embargo, el tamaño y la redondez de los esferoides siguen siendo similares. (F) La migración celular en la superficie del cultivo se puede ver después de la descongelación. (G-L) La membrana celular viva (WGA) y la tinción del núcleo (Hoechst) demuestran una viabilidad celular similar y membranas celulares intactas antes y después de congelar todos los esferoides en un hidrogel en la DM. Basr de escala: (A,B,D,E) = 200 μm; (C,F,G-L) = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Comparación del número de pasos, el tiempo y la producción de residuos entre los flujos de trabajo tradicionales y nuevos durante un experimento a corto plazo.

Tabla 2: Comparación del inmunomarcaje convencional y el nuevo protocolo de inmunomarcaje.

Video 1: Series temporales de imágenes a diferentes niveles de un hidrogel que contiene esferoides bajo un microscopio de contraste de fase invertida. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: Estructura 3D de dos organoides de las vías respiratorias marcados con anticuerpos para citoqueratina 5 y DAPI. Haga clic aquí para descargar este video.

Figura complementaria 1: Visión general del experimento. Este esquema muestra los pasos experimentales secuenciales para cultivar y examinar organoides de montaje completo en un hidrogel. La tecnología descrita aquí permite cultivar, congelar, descongelar, etiquetar y examinar los organoides bajo diferentes microscopios. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Comparación de la viabilidad celular, toxicidad y tasas de proliferación de células HepG2 en un plato tradicional con fondo de vidrio o una DM. Las células HepG2 se cultivaron en (A) un plato tradicional de cultivo celular con fondo de vidrio o (B) en un MD para comparar la viabilidad celular y la toxicidad. (C) Se utilizó la prueba de exclusión del azul de tripano para demostrar la viabilidad. Barra de escala = 20 μm. Los resultados se compararon utilizando citotoxicidad (D-E) CCK8 y (F) ensayos de proliferación celular. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Disposición de las dos cajas de espuma. Una caja de espuma se coloca dentro de la otra durante el proceso de congelación lenta de todos los organoides o esferoides en el MD. *denota las dos casillas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 4: Pasos que demuestran cómo eliminar el bloque de resina del MD después de la polimerización de la resina. (A) El bloque de resina que rodea los esferoides u organoides se prepara dentro del nicho MD y luego se polimeriza. (B-D) Luego, con una varilla delgada apropiada, se empuja el bloque de resina para eliminarlo del nicho. (E) A continuación, se retira el bloque de resina, con el plástico debajo. (F-G) Finalmente, se usa un par de pinzas para separarlas si el bloque todavía está unido al plástico. (H) El bloque está listo para el seccionamiento fino. Los organoides o esferoides de montaje completo en el bloque de resina (*) están listos para seccionar para microscopía electrónica de transmisión. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 5: Organoides de las vías respiratorias marcados con inmunofluorescencia y luego visualizados mientras aún estaban en DM. (A-C) El panel superior muestra organoides circulares de las vías respiratorias con una luz central. El verde representa las células progenitoras de las vías respiratorias que expresan citoqueratina 5 en el anillo más externo del organoide, y el azul representa los núcleos. Barra de escala = 50 μm. (D-F) El panel inferior muestra la imagen tridimensional de los dos organoides uno al lado del otro en los filtros (D) DAPI y (E) Alexa 488, así como la imagen combinada (F). Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 6: Comparación de la densidad de etiquetado en las membranas celulares vivas de las células. El gráfico compara los esferoides antes y después de la congelación utilizando el flujo de trabajo tradicional y adoptado actualmente. El análisis se realizó utilizando el software de análisis de imágenes Image J. Abreviaturas: IntDen = Densidad integrada (intensidad de fluorescencia en los esferoides seleccionados). CTCF = Fluorescencia celular total corregida. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Ranan Gulhan Aktas posee solicitudes de patentes MD, S-IHC, S-IF y FS. Olgu Enis Tok participó en el desarrollo de estos productos. Olgu Enis Tok y Gamze Demirel son miembros del equipo de investigación y desarrollo de la compañía llamada Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut y Ozgecan Kayalar no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.