Artículo de método

Cultivo, congelación, procesamiento e imágenes de organoides y esferoides completos mientras aún están en un hidrogel

DOI:

10.3791/64563

⸱

23 de diciembre de 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Institute for Health Sciences and Technologies (SABITA), Istanbul Medipol University, 2Cellorama, 3Cancer and Stem Cell Research Center, Maltepe University, 4Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Maltepe University, 5Department of Medical Biology, School of Medicine, Maltepe University, 6School of Medicine, Koc University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente estudio describe metodologías para cultivar, congelar, descongelar, procesar, teñir, etiquetar y examinar esferoides y organoides completos bajo varios microscopios, mientras permanecen intactos en un hidrogel dentro de un dispositivo multipropósito.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los organoides y esferoides, estructuras de cultivo tridimensionales en los laboratorios de cultivo celular, son cada vez más reconocidos como modelos superiores en comparación con los modelos de cultivo bidimensionales, ya que imitan mejor el cuerpo humano y tienen ventajas sobre los estudios en animales. Sin embargo, estos estudios comúnmente enfrentan problemas con la reproducibilidad y la consistencia. Durante los largos procesos experimentales, con transferencias de organoides y esferoides entre diferentes recipientes de cultivo celular, pipeteo y centrifugación, estas estructuras de crecimiento 3D susceptibles y frágiles a menudo se dañan o se pierden. En última instancia, los resultados se ven afectados significativamente, ya que las estructuras 3D no pueden mantener las mismas características y calidad. Los métodos descritos aquí minimizan estos pasos estresantes y garantizan un entorno seguro y consistente para organoides y esferoides a lo largo de la secuencia de procesamiento mientras todavía están en un hidrogel en un dispositivo multipropósito. Los investigadores pueden cultivar, congelar, descongelar, procesar, teñir, etiquetar y luego examinar la estructura de organoides o esferoides bajo varios instrumentos de alta tecnología, desde microscopios confocales hasta microscopios electrónicos, utilizando un solo dispositivo multipropósito. Esta tecnología mejora la reproducibilidad, fiabilidad y validez de los estudios, al tiempo que mantiene un entorno estable y protector para las estructuras de cultivo 3D durante el procesamiento. Además, eliminar pasos estresantes minimiza los errores de manejo, reduce el tiempo necesario y disminuye el riesgo de contaminación.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El futuro de la investigación y terapia celular está dentro de los cultivos celulares 3D 1,2,3. Los modelos organoides y esferoides cierran la brecha entre los experimentos in vitro y los modelos animales al crear mejores modelos que imitan el desarrollo del cuerpo humano, la fisiología y las enfermedades 4,5,6,7,8,9. Sin embargo, la reproducibilidad y repetibilidad de estos modelos siguen siendo un desafío. Además, el manejo, la cosecha, la transferencia y la centrifugación de estas estructuras con las tecnologías actuales resultan en la pérdida o daño de los organoides y esferoides en muchas condiciones, lo que afecta significativamente los resultados.

A pesar de muchos protocolos para la tinción histológica, la tinción inmunohistoquímica, el etiquetado de inmunofluorescencia y la criopreservación, no existe un enfoque universal relacionado con la estandarización de las condiciones experimentales, el manejo y el procesamiento de estas delicadas estructuras sin perderlas o dañarlas. Los protocolos actuales también son increíblemente largos, alternando desde unos pocos días hasta varias semanas, e incluyen procedimientos complejos con varios reactivos 10,11,12,13,14. Además, la recolección, el pipeteo, la centrifugación y la transferencia de estructuras de cultivo 3D entre los vasos de cultivo celular y los crioviales causan cambios en el posicionamiento de las estructuras y las fuerzas mecánicas y, en última instancia, afectan la diferenciación y maduración de los organoides y esferoides. Se ha reportado que la topología tisular, el posicionamiento de las células y las fuerzas mecánicas impactan significativamente la diferenciación y maduración celular 6,15,16,17.

Por lo tanto, es deseable mejorar las tecnologías convencionales actuales para generar organoides y esferoides con calidad estable. Un método / dispositivo que omita la centrifugación y otros pasos descritos anteriormente y proporcione el material en un solo entorno seguro desde el principio hasta el final de los múltiples procesos sería beneficioso para alcanzar los datos más consistentes y confiables. Además, esto reducirá las limitaciones de tiempo, mano de obra y costos.

El dispositivo multipropósito (MD) descrito aquí proporciona un único entorno seguro para múltiples procesos de organoides y esferoides (Figura complementaria 1). Este dispositivo y los protocolos complementarios eliminan los pasos de recolección, pipeteo, transferencia y centrifugación. Los organoides y esferoides permanecen en su ambiente in vitro durante los procesos secuenciales. Este entorno comprende principalmente componentes naturales o sintéticos de la matriz extracelular, como los hidrogeles disponibles comercialmente. En otras palabras, los métodos descritos aquí permiten procesar, examinar y congelar una muestra completa de organoides/esferoides mientras aún están en una gota de hidrogel.

El dispositivo biocompatible es resistente a temperaturas entre 60 °C y -160 °C, lo que hace posible restaurar los organoides/esteroides en un tanque de nitrógeno líquido a -160 °C o preparar bloques de resina para microscopía electrónica a 60 °C. El nicho en el dispositivo ha sido diseñado para definir un espacio limitado para estructuras de cultivo 3D y estimular la formación de esferoides u organoides basados en los estudios previos 18,19,20,21,22,23. Esa parte del dispositivo es transparente y contiene un plástico específico que proporciona una alta calidad óptica (índice de refracción: 1.43; valor abbe: 58; espesor: 7.8 mil [0.0078 in o 198 μm]). Tanto el nicho como la parte "lateral" circundante causan autofluorescencia. El nicho transparente en el centro tiene un área de80 mm 2, mientras que la parte lateral es de 600 mm2. La profundidad del contenedor es de 15 mm y el grosor es de 1,5 mm. Estas características, además del tamaño y el diseño del dispositivo, permiten realizar observaciones bajo diferentes tipos de microscopio de alta tecnología y preparar las muestras para exámenes microscópicos electrónicos (Figura 2). El sistema de cierre del dispositivo proporciona dos posiciones, una sellada en el congelador y la otra que permite el flujo de gas en la incubadora. Los ensayos de proliferación y citotoxicidad de CCK8 demuestran efectos similares en las células en comparación con las placas de cultivo celular tradicionales (Figura complementaria 2). La prueba de exclusión de azul de tripano demuestra una alta viabilidad celular (94%) durante el cultivo celular en la DM (Figura 3).

Los procesos que se pueden realizar para una muestra en el dispositivo único comprenden (1) cultivo, (2) tinción histológica, (3) inmunotinción, incluido el etiquetado inmunohistoquímico e inmunofluorescente, (4) congelación, (5) descongelación, (6) examen bajo microscopios ópticos, como microscopios de campo claro, campo oscuro, fluorescencia, confocales y de súper resolución, (7) recubrimiento y examen directamente bajo un microscopio electrónico de barrido, o (8) preparación para microscopía electrónica de transmisión ( Figura 2).

Existen diferentes metodologías para la tinción histológica, el marcaje inmunohistoquímico o el marcado fluorescente de organoides y esferoides 10,11,12,13,14,24,25. Cosecharlos del hidrogel es el primer y principal paso de la tecnología actual. Después de este paso, algunos métodos permiten el inmunoetiquetado de montaje completo. Los organoides cosechados se incrustan en parafina, se seccionan y se etiquetan para teñir e inmunotinción en otros. Sin embargo, las secciones pueden no presentar toda la muestra y proporcionar solo datos limitados relacionados con la arquitectura 3D de la estructura. Además, el daño a estas estructuras 3D y la pérdida de antigenicidad son efectos secundarios bien conocidos de estas tecnologías.

Los nuevos protocolos complementarios para exámenes microscópicos en este artículo permiten un análisis de muestras de montaje completo aún en un hidrogel. Los protocolos descritos aquí incluyen dos formulaciones recientemente desarrolladas: solución para inmunohistoquímica (S-IHC) y solución para etiquetado de inmunofluorescencia (S-IF). Los métodos con estas soluciones permiten a los investigadores obtener datos más precisos, ya que no hay efectos nocivos de los flujos de trabajo tradicionales, como la centrifugación, el pipeteo y la transferencia de las estructuras delicadas. El protocolo descrito aquí también elimina la necesidad de recolección, bloqueo, limpieza y pasos de recuperación de antígenos, y acorta todo el procedimiento a 6-8 h. Además, la metodología permite agregar simultáneamente de uno a tres anticuerpos al mismo S-IF. Por lo tanto, es posible obtener los resultados el mismo día incluso después de los múltiples experimentos de etiquetado, que es otra ventaja del protocolo descrito aquí; Los protocolos tradicionales de etiquetado de inmunofluorescencia de montaje completo suelen tardar entre 3 días y varias semanas 10,11,12,13,14.

También se omite la incorporación de parafina, otro paso dañino que reduce la antigenicidad. La estructura 3D permanece en su entorno in vitro desde el principio hasta el final del examen microscópico. Dado que la estructura 3D permanece en sus condiciones de crecimiento, la expresión de proteínas y los datos de localización imitan mejor las condiciones in vivo. Se esperan resultados más precisos, ya que la metodología elimina los pasos que afectan la expresión del antígeno de la muestra. La Tabla 1 y la Tabla 2 demuestran cómo estos nuevos protocolos eliminan pasos, ahorran tiempo y mano de obra en el laboratorio y reducen los costos y los productos de desecho en comparación con los flujos de trabajo tradicionales.

Además de los pasos cruciales descritos anteriormente, otro problema es proporcionar un medio de criopreservación y un método para preservar la estructura 3D de la muestra con mayores tasas de viabilidad celular 26,27,28,29,30,31. La criopreservación es esencial para crear un sistema modelo estable y permitir el biobanco de organoides y esferoides32,33. Biobanco toda la estructura 3D original permitirá una recapitulación más fiel del estado natural de salud o enfermedad. Las consideraciones clave son la conveniencia y confiabilidad de la criopreservación y la descongelación de organoides / esferoides. La recuperación de organoides post-deshielo es muy baja en la mayoría de las tecnologías actuales, a menudo menos del 50%. Sin embargo, estudios recientes han mostrado resultados prometedores con mejores tasas de supervivencia26,27,28,29. Lee et al. demostraron que el 78% de las células esferoides sobrevivieron después de la criopreservación cuando utilizaron la solución de la Universidad de Wisconsin que contenía 15% de DMSO28. La razón de supervivencia celular aumentó al 83% en el estudio de Arai et al.29. Sin embargo, los resultados después de la criopreservación se ven afectados significativamente ya que las estructuras 3D no pueden mantener las mismas características y calidad. Además, se requieren reactivos sin suero para las buenas prácticas de fabricación en entornos farmacéuticos y de diagnóstico. Los flujos de trabajo tradicionales utilizan un medio que contiene suero bovino fetal (FBS) y dimetilsulfóxido (DMSO) para el método de congelación lenta, ambos asociados con discapacidades. FBS es un producto derivado de animales y puede tener variaciones de lotes. El DMSO es un crioprotector muy exitoso, pero la exposición a largo plazo, especialmente durante la descongelación, puede causar efectos citotóxicos30,31.

Este artículo también describe la metodología de congelación/descongelación de organoides o esferoides enteros mientras aún están en un hidrogel. En el estudio se utilizan dos fórmulas para congelar organoides y esferoides: (1) DMSO al 10% que contiene solución de congelación tradicional (FS) y (2) un medio de criopreservación libre de suero y DMSO. Este medio de criopreservación contiene componentes de matriz extracelular, que son diferentes de las fórmulas actuales. La matriz extracelular comprende dos clases principales de macromoléculas, proteoglicanos y proteínas fibrosas, que son esenciales para el andamiaje físico de los constituyentes celulares, pero también inician procesos necesarios para la morfogénesis, diferenciación y homeostasis tisulares 34,35,36,37,38,39,40 . Los colágenos proporcionan resistencia a la tracción, regulan la adhesión celular, apoyan la quimiotaxis y la migración, y dirigen el desarrollo de los tejidos37. Además, las fibras de elastina proporcionan retroceso a los tejidos que sufren estiramientos repetidos38. Una tercera proteína fibrosa, la fibronectina, dirige la organización de la matriz extracelular intersticial y tiene un papel crucial en la mediación de la unión celular y funciona como un mecano-regulador extracelular39. Du et al. han demostrado el efecto crioprotector del hidrolizado de colágeno de pollo sobre el sistema modelo de actomiosina natural41. Sus resultados sugieren que el hidrolizado de colágeno puede inhibir el crecimiento de cristales de hielo, reducir la desnaturalización por congelación de proteínas y la oxidación de manera similar a los crioprotectores comerciales, y proporcionar una mejor estructura de gel después de los ciclos de congelación y descongelación. Por lo tanto, la adición de componentes de matriz extracelular a los medios de criopreservación proporciona un entorno más seguro y protector para la muestra y ayuda a las estructuras vivas a sanar después de la congelación-descongelación.

Además, el presente estudio describe un protocolo sencillo para etiquetar las membranas citoplasmáticas y los núcleos de organoides y esferoides vivos mientras aún están en el hidrogel.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cultivo de organoides y esferoides

  1. Coloque el hidrogel en hielo durante la noche (en un refrigerador o en una cámara frigorífica) para descongelar.
  2. Coloque el dispositivo multipropósito disponible comercialmente (MD; consulte la Tabla de materiales) en la incubadora 1 día antes del experimento (37 °C, 5% deCO2) para calentarlo.
  3. Introduzca las puntas de pipeta estériles de extremo ancho en la nevera a 4 °C.
    NOTA: Los pasos 1.1-1.3 deben realizarse el día 0 y los pasos 1.4-1.11 deben realizarse el día 1.
  4. Coloque el hidrogel sobre hielo en una campana de flujo laminar durante 15 min.
    1. Opcional: Diluir el hidrogel en medio de cultivo de células frías de acuerdo con la recomendación del fabricante.
  5. Coloque el tubo que contiene una bolita de células HepG2 (línea celular de carcinoma hepatocelular obtenida comercialmente; consulte la Tabla de materiales) en hielo.
  6. Placa 30-35 μL de hidrogel 100% dentro del nicho del dispositivo precalentado para crear una gota de gel.
  7. Coloque 10.000 células HepG2 en el centro de la parte superior de cada gota de hidrogel (Figura 2) e incube durante 15 minutos a 37 °C.
  8. Cubra la gota de hidrogel con 200 μL de Medio de Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco con 10% de Suero Bovino Fetal.
  9. Cubra la tapa del MD en la posición correcta para permitir el flujo de gas y coloque el dispositivo en la incubadora.
  10. Alimente las células con 200 μL de DMEM con 10% de FBS cada dos días.
  11. Comprobar el crecimiento de los esferoides bajo un microscopio invertido (Figura 3). La formación de esferoides comienza después del3er día. El video 1 muestra la ubicación de los esferoides en diferentes niveles en una cúpula de hidrogel.
    NOTAS: Se recomienda encarecidamente aspirar suavemente el líquido que rodea el hidrogel y agregar lentamente el nuevo líquido al ambiente para evitar dañar las gotas de hidrogel.

2. Tinción de hematoxilina y eosina de organoides/esferoides de montaje entero en un hidrogel

  1. Calentar el fijador (4% paraformaldehído; PFA), PBS y hematoxilina (ver Tabla de Materiales) hasta 37 °C.
  2. Aspirar el medio que rodea la gota de hidrogel con una pipeta, añadir 100-200 μL de PFA al 4% para fijar e incubar durante 15-20 min a 37 °C.
  3. Aspirar el PFA al 4% y añadir 200 μL de PBS para lavar 3 veces durante 5 min cada una a 37 °C. A continuación, aspirar el PBS e incubar con 200 μL de solución de hematoxilina durante 15-20 min a 37 °C.
  4. Aspirar la hematoxilina y añadir 200 μL dedH2Opara lavar 3 veces durante 10 min cada una a 37 °C. Aspirar eldH2Oe incubar con 200 μL de etanol durante 5-10 min a 37 °C.
  5. Aspirar el etanol e incubar con 200 μL de eosina (ver Tabla de materiales) durante 10 min a 37 °C. Aspirar la eosina y añadir 200 μL dedH2Opara lavar durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
  6. Aspirar eldH2Oy añadir 100 μL de glicerol para cubrir la gota de hidrogel como medio de montaje.
  7. Opcional: Monte el nicho con un cubreobjetos. Este paso se puede omitir para evitar apretar organoides/esferoides de tamaño considerable.
  8. Cierre firmemente la tapa de MD para evitar que se seque hasta el examen. La muestra es estable para su examen durante al menos 6 meses.

3. Inmunohistoquímica de organoides/esferoides de montaje completo en un hidrogel

  1. Calentar la solución obtenida comercialmente para inmunohistoquímica (S-IHC; ver Tabla de materiales) a 37 °C.
  2. Incubar los organoides o esferoides en el hidrogel con peróxido de hidrógeno al 3% (H2O2) en 200 μL dedH2O durante5 min a 37 °C.
  3. Aspirar la solución de peróxido de hidrógeno y lavar endH2Odurante 5 min a 37 °C. Aspirar eldH2Oe incubar dos veces con 100 μL de S-IHC a 37 °C durante 10 min cada una.
  4. Aspirar la S-IHC e incubar con 100 μL de anticuerpo primario (ver Tabla de materiales) diluido en S-IHC durante 1-2 h a 37 °C (siguiendo las recomendaciones del fabricante con respecto a la dilución de trabajo).
  5. Aspirar la solución de anticuerpos primarios e incubar con 100 μL de S-IHC 3x durante 5 min cada uno a 37 °C.
  6. Aspirar 100 μL de S-IHC e incubar con un anticuerpo secundario biotinilado (ver Tabla de materiales) durante 10 min a 37 °C.
  7. Aspirar la solución de anticuerpos secundarios e incubar con 100 μL de S-IHC 3x durante 5 min cada uno a 37 °C. Aspirar la S-IHC e incubar con 100 μL de peroxidasa de rábano picante (HRP) marcada con estreptavidina (ver Tabla de materiales) durante 10 min a 37 °C.
  8. Aspirar la estreptavidina marcada con HRP e incubar con 100 μL de S-IHC 3x durante 5 min cada uno a 37 °C.
  9. Aspirar la S-IHC e incubar con 100 μL de mezcla de solución de cromógeno DAB/AEC (ver Tabla de materiales) durante 5-10 min a 37 °C.
  10. Controle la intensidad de la tinción bajo un microscopio óptico.
  11. Lavar con dH 2 O 3x durante2min cada uno.
  12. Opcional: Incubar con 100 μL de hematoxilina (ver Tabla de Materiales) para la contratinción nuclear durante 5 min a 37 °C.
  13. Aspirar la Hematoxilina y lavar endH2Odurante 5 min.
  14. Aspirar eldH2Oy cubrir la gota de hidrogel con 100 μL de glicerol como medio de montaje.
  15. Cierre firmemente la tapa del MD hasta el examen microscópico.
    NOTAS: Los pasos de recuperación de antígenos y bloqueo de proteínas se omiten en este protocolo ya que S-IHC elimina estos pasos.

4. Etiquetado por inmunofluorescencia de organoides/esferoides de montaje completo en un hidrogel

  1. Calentar los siguientes materiales a 37 °C: PFA AL 4%, PBS, S-IF, solución de anticuerpos primarios en S-IF, solución de anticuerpos secundarios en S-IF, tinción nuclear y glicerol (ver Tabla de materiales).
  2. Aspirar el medio de cultivo celular y fijar con 200 μL de PFA al 4% durante 15-30 min a 37 °C. Aspirar el fijador y lavar en S-IF 3 veces durante 10 min cada una a 37 °C.
  3. Agregue dH2O al lado que rodea el nicho para proporcionar humedad durante los siguientes pasos.
  4. Aspirar el S-IF que rodea la gota de hidrogel e incubar la gota de hidrogel con 100 μL de solución de anticuerpos primarios (ver Tabla de materiales) en S-IF durante 30-60 min a 37 °C.
  5. Aspirar la solución de anticuerpos primarios y lavar en S-IF 3 veces durante 10 min cada una a 37 °C.
  6. Aspirar el S-IF e incubar con 100 μL de solución de anticuerpos secundarios (ver Tabla de materiales) en S-IF durante 30-60 min a 37 °C en la oscuridad.
  7. Aspirar la solución de anticuerpos secundarios y lavar con PBS 3x durante 10 min cada uno a 37 °C en la oscuridad.
  8. Aspirar el PBS e incubar con 100 μL de tinción de ADN nuclear que contenga medio de montaje o glicerol a 37 °C en la oscuridad.
  9. Llene el nicho con glicerol para evitar que se seque.
  10. Opcional: Cubra el nicho con un cubreobjetos. Este paso se puede omitir para evitar apretar los organoides / esferoides.
  11. Cierre herméticamente el MD. Las muestras en MD pueden almacenarse a 4 °C en la oscuridad durante al menos 6 meses con una pérdida mínima de fluorescencia.
  12. Utilice los siguientes ajustes para el examen microscópico confocal: establezca el valor estenopeico de todos los canales en 20,1, mantenga la constante del maestro de ganancia en 550 para 488 nm, 485 para 550 nm y 450 para 594 nm, mantenga constante la potencia del láser para todos los experimentos y el porcentaje más bajo en 2,0.
    NOTAS: Anticuerpos primarios: Anti-Na-K ATPasa (1:100), Anti-Arginasa (1:50), Antialbúmina (1:50), Anti-Beta-galactosidasa (1:25), Anticuerpo antimitocondrial (1:100), Anticuerpo Anti-Golgi (1:50), Anti-citoqueratina 5 (1:100), Anticuerpo Ov6 (1:100). Anticuerpos secundarios: Cabra anti-Conejo IgG (H+L)- 488, Cabra anti-Conejo IgG (H+L)-550, Cabra anti-Ratón IgG (H+L)-488, Cabra anti-Ratón IgG (H+L)-550, Cabra anti-Pollo IgY(H+L)-647. La dilución para todos los anticuerpos secundarios es 1:100. Además, también se utiliza FITC-faloidina (1:100), un anticuerpo conjugado (ver Tabla de materiales).

5. Etiquetado de la membrana plasmática y el núcleo de organoides y esferoides vivos en un hidrogel

  1. Prepare la solución de etiquetado que contenga aglutinina de germen de trigo fluorado de Alexa (5.0 μg / ml) y Hoechst (2 μM) en la solución salina equilibrada de Hank (HBSS), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales), y caliente hasta 37 ° C.
  2. Aspirar el medio de cultivo celular y añadir 100 μL de solución de etiquetado para cubrir la gota de hidrogel. Incubar durante 15-30 min a 37 °C.
  3. Retire la solución de etiquetado y lave dos veces en PBS 2 veces durante 10 minutos cada una a 37 °C. Opcional: Fijar con 200 μL de formaldehído al 4% durante 15 min a 37 °C.
  4. Cubra la gota de hidrogel con glicerol como medio de montaje. Opcional: Monte el nicho con una cubierta de vidrio.
  5. Cierre bien la tapa del MD y manténgalo refrigerado en la oscuridad hasta el examen microscópico fluorescente/confocal. Es estable durante al menos 6 meses.

6. Congelación y descongelación de organoides/esferoides de montaje entero en un hidrogel

  1. Congele los organoides siguiendo los pasos a continuación.
    1. Calentar la solución de congelación obtenida comercialmente (FS; ver Tabla de materiales) a 37 °C.
    2. Aspire suavemente los medios de cultivo celular que rodean la cúpula de hidrogel.
    3. Añadir 200 μL de FS suavemente. Incubar la muestra con FS a 37 °C durante 1 h.
    4. Cierre bien la tapa del dispositivo y colóquelo en una caja de espuma. Coloque esta caja de espuma en otra caja de espuma, como se muestra en la Figura complementaria 3. Cierre ambas cajas de espuma herméticamente. Dos cajas de espuma una dentro de la otra proporcionan un rango de gradiente de enfriamiento de temperatura de 1 a 2 ° C / min de la muestra en un congelador de -20 ° C.
    5. Colocar la caja a -20 °C durante 2 h. Transfiera la caja a un congelador a -80 °C y déjela toda la noche.
    6. Saque la muestra de las cajas. La muestra en el MD puede conservarse en el congelador de -80 °C durante 6 meses.
    7. Transfiera el MD que contiene la muestra al tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
  2. Descongela los organoides siguiendo los pasos a continuación.
    1. Saque la MD que contiene la muestra del congelador/tanque de nitrógeno y colóquela directamente en una incubadora a 37 °C. Incubar durante 1 h a 37 °C.
    2. Añadir 200 μL de medio de cultivo caliente al nicho (la proporción de FS a medio de cultivo celular es de 1:1) e incubar durante 30 min a 37 °C.
    3. Añadir más medio de cultivo caliente al nicho (la proporción de FS a medio de cultivo celular es de 1:2) e incubar durante 30 min a 37 °C.
    4. Aspirar suavemente el medio y la mezcla de FS. Proceda a la microscopía electrónica de barrido (paso 7) y la microscopía electrónica de transmisión (paso 8) de los organoides/esferoides de montaje completo en el hidrogel.

7. Microscopía electrónica de barrido de organoides/esferoides de montaje completo

  1. Caliente la solución fijadora y postfijadora de Karnovsky (consulte la Tabla de materiales) a temperatura ambiente (RT).
  2. Aspirar el medio de cultivo celular que rodea el hidrogel en la DM. Coloque la muestra en el MD sobre hielo en la campana de flujo laminar durante 15 min.
  3. Aspirar el hidrogel licuado que rodea los organoides/esferoides muy suavemente. Una cantidad limitada de matrigel puede permanecer en el nicho para evitar dañar y perder la muestra.
  4. Fijar con fijador de Karnovsky (2% PFA, 2,5% glutaraldehído en 0,15 M de tampón de cacodilato, y 2 mM CaCl2; ver Tabla de materiales) en RT durante 1 h.
  5. Aspirar el fijador suavemente y lavar con agua destilada (dH2O) 3 veces durante 15 min cada una.
  6. Aspirar suavemente eldH2Oy fijar con solución postfijadora (tetróxido de osmio acuoso al 1% [OsO4]; ver Tabla de materiales) a RT durante 1 h.
  7. Aspirar suavemente el postfijador y lavar con agua destilada (dH2O) 3x durante 15 min cada uno.
  8. Deshidratar en una serie graduada de etanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), mezcla de etanol/acetona (1:1; 1:2) y acetona absoluta a RT durante 15 min cada una.
  9. Secar con un secador de punto crítico.
  10. Cubra la muestra en el dispositivo con oro/paladio de 6 nm usando un recubridor de pulverización catódica (consulte la Tabla de materiales) durante 90 s.
  11. Observe bajo un microscopio electrónico de barrido con un detector de electrones secundario en la lente a 2-3 kV en modo vacío (5 x 10-6 mA). Tome imágenes con una distancia de trabajo de 8.1-8.2 mm y con aumentos de 675x, 1050x y 1570x.
    NOTAS: Todos los pasos se realizan en el MD. Use 200-250 μL de solución para cada paso.

8. Microscopía electrónica de transmisión de organoides/esferoides de montaje completo en un hidrogel

  1. Calentar el fijador de Karnovsky a 37 °C. Aspirar el medio de cultivo celular que rodea el hidrogel en la DM.
  2. Fijar la muestra con el fijador de Karnovsky en RT durante 1 h. Lavar con dH2O 3x durante 15 min cada uno.
  3. Post-fijación conOsO4 acuoso al 2% y ferrocianuro de potasio al 2,5% a RT durante 45 min. Lavar con dH2O 3x durante 10 min cada uno.
  4. Incubar en tiocarbohidrazida al 0,5% (TCH; ver Tabla de materiales) a RT durante 30 min. Lavar con dH2O 3x durante 10 min cada uno.
  5. Incubar enOsO4 acuoso al 2% a RT durante 30 min. Lavar con dH2O 3x durante 10 min cada uno.
  6. Incubar en solución de acetato de uranilo al 2% (ver Tabla de materiales) a RT durante 1 h.
    NOTA: En este paso, los esferoides se pueden mantener a 4 °C durante la noche.
  7. Incubar en solución de aspartato de plomo (ver Tabla de materiales) a 60 °C durante 45 min. Lavar con dH2O 3x durante 10 min cada uno.
  8. Deshidratar en una serie graduada de etanol (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) y acetona absoluta a RT durante 15 min cada uno.
  9. Tratar con una mezcla de (1:1; 1:2) acetona/resina Epon y resina Epon pura (ver Tabla de materiales) en RT durante 2 h cada uno.
  10. Polimerizar la resina a 60 °C durante la noche (mínimo de 16 h). Después de la polimerización, retire el bloque de resina del MD, como se muestra en la Figura complementaria 4.
  11. Fije el bloque de resina a uno más grande con un pegamento de resina. Recorta el bloque y alcanza la ubicación de organoides o esferoides.
  12. Obtenga secciones semidelgadas (1,000 nm) y ultradelgadas (60 nm) usando un ultramicrotomo (consulte la Tabla de materiales).
  13. Coloque las secciones ultrafinas en rejillas de cobre de malla 100 y observe bajo un microscopio electrónico de barrido con un detector STEM a un voltaje de aceleración de 30 kV. Capture imágenes con una distancia de trabajo de 44 mm y con aumentos de 2580x, 5020x y 6060x.
    NOTAS: Utilice 200-250 μL de solución para cada paso. Los pasos 8.1-8.10 se realizan en el MD.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente artículo representa un dispositivo multipropósito (MD) y metodologías complementarias para el cultivo, la congelación, la descongelación, la tinción histológica, la tinción inmunohistoquímica, el etiquetado de inmunofluorescencia, el recubrimiento y el procesamiento de organoides o esferoides completos mientras aún se encuentran en un hidrogel en un solo entorno de diseño único. El estudio actual fue diseñado para preparar esferoides de cáncer de hígado HepG2 en 35 gotas de hidrogel en 35 DM. Los experimentos...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El MD, complementando las formulaciones y protocolos descritos aquí, facilita el crecimiento 3D rápido y espontáneo de organoides y esferoides en un entorno más controlado y continúa el experimento en las mismas condiciones. El espécimen permanece en el mismo entorno durante todo el proceso, y casi el 100% de las arquitecturas de cultivo 3D permanecen intactas en el contenedor. Esto mejora la homogeneidad durante los experimentos secuenciales y permite un período de cultivo prolongado. Además, el número de pasos durante ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ranan Gulhan Aktas posee solicitudes de patentes MD, S-IHC, S-IF y FS. Olgu Enis Tok participó en el desarrollo de estos productos. Olgu Enis Tok y Gamze Demirel son miembros del equipo de investigación y desarrollo de la compañía llamada Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut y Ozgecan Kayalar no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Dale Mertes de la Universidad de Chicago por la preparación de diagramas, al Dr. Mehmet Serif Aydin por su apoyo técnico en el Instituto de Investigación de Ciencias y Tecnologías de la Salud de la Universidad Medipol de Estambul, y al Dr. Rana Kazemi de la Universidad de Maltepe por editar el manuscrito.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Etanol absoluto (EtOH)Merck8187602500diluir en dH2O para hacer una solución al 30%, 50%, 70%, 80%, 90% y 96% y almacenar en RT
AcetonaMerck8222512500Tienda en RT
Alexa aglutinina de germen de trigo flúor y Hoechst  en la solución salina equilibrada de Hank (HBSS)  InvitrogenI34406Image-IT LIVE Kit de etiquetado nuclear y membrana plasmática, almacenar a -20 & grados; C
Alfa-1-Fetoproteína (AFP) Anticuerpo policlonal concentrado y prediluidoBiocare MedicalCP 028 A Almacenaren +4 ° C
Anticuerpo antialbúminaAbcamEPR20195Store en +4 ° C, Dilución: 1:50
Anticuerpo anti-beta galactosidasa,Abcam134435Almacenar a +4 & grados; C, Dilución: 1:25
Anti-citoqueratina 5Abcam53121Almacenar en +4 ° C, dilución: 1:100
Arginasa-1 Anticuerpo monoclonal de conejo concentrado y prediluidoBiocare MedicalACI 3058 A, BAlmacenar a +4 ° C, Dilución: 1:50
Cloruro de calcio (CaCl2)SigmaC1016-500GDisolver en el fijador de Karnovsky para hacer 2 mM de CaCl2; almacene en RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)Abcamab228554
Tubos de centrífuga, 15 mL Tubos
, 50 mL Nest602052
Clase II Cabina de seguridad microbiológica Bio II Advance PlusTelstarEN12469
Incubadora de CO2PanasonicKM-CC17RU2
Rejillas de cobreCiencias de la Microscopía ElectrónicaG100-CuSecciones ultrafinas colocadas en las rejillas; Malla cuadrada de 100 líneas/pulgada
Secador de puntos críticosLeicaEM CPD300Para el secado de muestras biológicas para aplicaciones SEM en acetona absoluta
DAB/AEC mezcla de solución de cromógeno  Tienda Sigma AldrichAEC101en +4 ° C
Cuchillo de diamanteDiatomeUltra 45°, 40-USUso para secciones ultrafinas para TEM
Dimethyl sulfoxide para biología molecularBiofroxx67-68-5
Plástico Desechable Pasteur Pippettes Nest
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco41966-029Tienda en +4 ° C
Eosina Y Solución AlcohólicaBrillante Slide2.BS01-105-1000
Resina Epon Sigma45359-1EA-F Kit demedio de incrustación epoxi, almacenar en +4 ° C
Suero Fetal Bovino con Aditivo FortificantePan BiotechP30-3304Tienda en +4 ° C
Solución de congelación (FS)CelloramaCellO-FAlmacene a +4 ° C
Fabricante de cuchillos de vidrioLeicaEM KMR3Para fabricar cuchillos de vidrio de 8 mm de espesor
Tiras de cuchillos de vidrio (Tamaño 8 mm x 25,4 mm x 400 mm)Leica7890-08Uso para secciones ultra o semifinas para TEM
Solución acuosa de glutaraldehído, grado EM, 25% Electrónica Microscopy Sciences16210Diluir en dH2O para hacer una solución al 2,5% y almacenar a +4 & grados; C
Solución de glicerolSigma Aldrich56-81-5Almacenar a -20 C, Dilución: 1:100
Anticuerpo secundario IgY (H+L) anti-pollo de cabra, Alexa, 647InvitrogenA32933Almacenar en RT
Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón de cabra, DyLight, 488Invitrogen35502Almacenar en +4 ° C,  Dilución :1:50
Anticuerpo secundario anti-ratón IgG (H+L) de cabra, DyLight, 550Invitrogen84540Almacenar en +4 ° C,  Dilución :1:50
Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-conejo de cabra, DyLight, 488Invitrogen35552Almacenar en +4 ° C,  Dilución :1:50
Anticuerpo secundario anti-conejo IgG (H+L) de cabra, DyLight, 550Invitrogen84541Almacenar en +4 ° C
Hematoxilina Harris  Diapositiva brillante2.BS01-104-1000
Células HepG2ATCCHB-8065Almacenar en tanque de nitrógeno
Humano/Rata Anticuerpo OV-6 Ratón monoclonal IgG1 clon # OV-6R& D SystemsMAB2020Tienda a -20 ° C
HidrogelCorning 354248Matrigel, Matriz de Membrana Basal de Alta Concentración (HC), sin LDEV, 10 mL, Almacenar a -20 & grados; C
HidrogelCorning 354234Matrigel, Matriz de Membrana Basal, sin LDEV, 10 mL, almacenar a -20 ° C
HidrogelThermoFischer Scientific A1413201Geltrex, Factor de crecimiento reducido sin LDEV Hidrogel de matriz de membrana basal
Biotechne, R& D SystemsBME001-01Cultrex Ultramatrix RGF BME, Tienda en -20 ° C
de Karnovsky%2 PFA, %2.5 Glutaraldehído en tampón de cacodilato de 0.15 M, 2 mM de CaCl2; preparar fresco; uso para TEM & Muestras SEM
de ácido L-aspárticoSigma11189-100GAlmacenar en RT
aspartato de plomoDisuelva 40 mg de ácido aspártico en 10 mL ddH2O y agregue 66 mg de nitrato de plomo. La solución se estabiliza a 60 & grados; C y ajustar el pH a 5; Tienda
Nitrato Electrónico de Nitrato de Plomo17900en RT
Microscopio Confocal Leica Microscopio ConfocalLeicaDMi8
LSM 700 LectorZeiss
DispositivoBiotek Synergy
(MD)CelloramaCellO-M
Tinción de ADN nuclearInvitrogenH3569Hoechst 33258, Pentahidrato (bis-Benzimida) - 10 mg/mL Solución en agua, almacenar a +4 & deg; C
Tinción de ADN nuclearThermoFischer Scientific62248DAPI solución, almacenar a +4 °
C Tetróxido de osmio (OsO4), 4%Ciencias de la Microscopía Electrónica19190Diluir en dH2O para hacer una solución al 2%; almacenar a +4 & deg; C y en recipiente hermético; proteger la luz
anticuerpo Ov6R& D systemsMAB2020Almacenar en +4 ° C
Solución de paraformaldehído (PFA), 4% Sigma1.04005.1000Disolver PFA al 4% en dH2O y hervir, enfriar y alícuota; almacenar a -20 & grados; C
Solución de paraformaldehído al 4% en PBS, 1 LSanta Cruz Biotechnologysc-281692Tienda en +4 ° C
Solución salina tamponada con fosfato (PBS), tabletasMP Biomedicals, LLC2810305
solución%2 OsO4, %2.5 Ferrocianuro de potasio en dH2O; preparar
una solución acuosa fresca de ferrocianuro de potasio, 5% Ciencias de la Microscopía Electrónica26603-01Tienda en RT
Primovert - Microscopio de campo claro invertido - ZEISSZeissN.º de artículo: 491206-0001-000
Tubos de microcentrífuga de fondo redondo, 2 mL620611
con accesorio STEMZeissGeminiSEM 500Utilizamos un detector de electrones secundarios (SE) Inlens a 2-3 kV para micrografías electrónicas de barrido y un detector STEM a 30 kV para micrografías electrónicas de transmisión.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab PackScyTek LaboratoriesSHP125Tienda en +4 ° C
Tampón de cacodilato de sodio, 0,4 M, pH 7,2Electrónica Microscopy Sciences11655Diluir en dH2O para hacer 0,2 M y almacenar a +4 ° C
Anticuerpo ATPasa alfa 1 de sodio/potasio [M7-PB-E9]GeneTexGTX22871Almacenar a -20 & grados;
C Solución para el marcaje de inmunofluorescencia (S-IF)CelloramaCellO-IFAlmacenar a +4 °
C Solución para inmunohistoquímica (S-IHC)CelloramaCellO-PStore a +4 ° C
Dispositivo de recorte de muestrasLeicaEM TRIM2Para preparar el bloque de muestras epon a ultramicrótomo
Recubridor de pulverización catódicaLeicaEM ACE200Cubrir las muestras SEM con 6 nm de oro/paladio durante 90 s
Tiocarbohidrazida (TCH)Sigma223220-5GDiluir en dH2O para hacer una solución al 0,5% y filtrar con 0,22 µ Filtro de membrana M; tienda en RT; preparar una solución fresca
de Trypan Blue, 0.4%Gibco15250061
Ultra gel superpegamentoPattexPSG2CPara pegamento Bloque de epón polimerizado con muestra en el soporte Bloque de epón
UltramicrótomoLeicaEM UC7Para preparar secciones ultra o semifinas de alta calidad para microscopía electrónica de transmisión (TEM)
Puntas de pipeta universales, 10 µ LNest171215-1101
Puntas de pipeta universales, 1000 µ LIsolabL-002
Puntas de pipeta universales, 200 µ L Nest110919HA01
Acetato de uraniloCiencias de la microscopía electrónica22400Diluir en dH2O para hacer una solución al 2% y filtrar con 0.22 µ Filtro de membrana M; mantenga el recipiente herméticamente cerrado, almacene en RT
policlonal de pollo de centrífuga Nest 601051Fijador Solución dede Sciences de Barrido Láser de microplacas multipropósito posfijadora Microscopía electrónica de barrido Nest

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  3. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  4. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
  5. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  6. Hautefort, I., Poletti, M., Papp, D., Korcsmaros, T. Everything you always wanted to know about organoid-based models (and never dared to ask). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 14 (2), 311-331 (2022).
  7. Kakni, P., Truckenmüller, R., Habibović, P., Giselbrecht, S. Challenges to, and prospects for, reverse engineering the gastrointestinal tract using organoids. Trends in Biotechnology. 40 (8), 932-944 (2022).
  8. Eglen, R. M., Reisine, T. Human iPS cell-derived patient tissues and 3D cell culture part 2: spheroids, organoids, and disease modeling. SLAS Technology: Translating Life Sciences Innovation. 24 (1), 18-27 (2019).
  9. Chatzinikolaidou, M. Cell spheroids: the new frontiers in in vitro models for cancer drug validation. Drug Discovery Today: Technologies. 21 (9), 1553-1560 (2016).
  10. Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
  11. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared Organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  12. Renner, H., Otto, M., Grabos, M., Schöler, H. R., Bruder, J. M. Fluorescence-based single-cell analysis of whole-mount-stained and cleared microtissues and organoids for high throughput screening. Bio-protocol. 11 (12), (2021).
  13. Edwards, S. J., et al. High-resolution imaging of tumor spheroids and organoids enabled by expansion microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 208(2020).
  14. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578(2021).
  15. Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122 (5), 1611-1620 (1996).
  16. Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Developmental Dynamics. 236 (8), 2039-2049 (2007).
  17. Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
  18. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  19. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  20. Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 45 (9), 523-534 (2009).
  21. Napolitano, A. P., et al. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43 (4), 494-500 (2007).
  22. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models-Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  23. Kim, S., et al. Spatially arranged encapsulation of stem cell spheroids within hydrogels for the regulation of spheroid fusion and cell migration. Acta Biomaterialia. 142, 60-72 (2022).
  24. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 5 (5), 633-640 (2002).
  25. Sargenti, A., et al. A new method for the study of biophysical and morphological parameters in 3D cell cultures: Evaluation in LoVo spheroids treated with crizotinib. PLoS One. 16 (6), 0252907(2021).
  26. Jeong, Y., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45-54 (2020).
  27. Lee, J. H., Jung, D. H., Lee, D. H., Park, J. K., Lee, S. K. Effect of spheroid aggregation on susceptibility of primary pig hepatocytes to cryopreservation. Transplantation Proceedings. 44 (4), Elsevier. 1015-1017 (2012).
  28. Lee, B. E., et al. A simple and efficient cryopreservation method for mouse small intestinal and colon organoids for regenerative medicine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 595, 14-21 (2022).
  29. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids andfabrication of scaffold-free tubular constructs. PLoS One. 15 (4), (2020).
  30. Awan, M., et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity. Regenerative Medicine. 15 (3), 1463-1491 (2020).
  31. Erol, O. D., Pervin, B., Seker, M. E., Aertes-Kaya, F. Effects of storage media, supplements and cryopreservation methods on quality of stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (9), 1197-1214 (2021).
  32. De Angelis, M. L., et al. Colorectal cancer spheroid biobanks: multi-level approaches to drug sensitivity studies. Cell Biology and Toxicology. 34 (6), 459-469 (2018).
  33. Botti, G., Di Bonito, M., Cantile, M. Organoid biobanks as a new tool for pre-clinical validation of candidate drug efficacy and safety. International Journal of Physiology Pathophysiology and Pharmacology. 13 (1), 17-21 (2021).
  34. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacological Reviews. 61 (2), 198-223 (2009).
  35. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 287-309 (2006).
  36. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell and Tissue Research. 339 (1), 237-246 (2010).
  37. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Developmental Biology. 341 (1), 126-140 (2010).
  38. Wise, S. G., Weiss, A. S. Tropoelastin. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (3), 494-497 (2009).
  39. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), (2007).
  40. Carvallo, M. P., Costa, E. C., Miguel, S. P., Correia, I. J. Tumor spheroid assembly on hyaluronic acid-based structures: A review. Carbohydrate Polymers. 150, 139-148 (2016).
  41. Du, L., Betti, M. Chicken collagen hydrolysate cryoprotection of natural actomyosin: Mechanism studies during freeze-thaw cycles and simulated digestion. Food Chemistry. 211, 791-802 (2016).
  42. Wang, X., et al. The significance of arginase-1 expression in the diagnosis of liver cancer: A protocol for a systematic review. Medicine. 99 (9), 19159(2020).
  43. Radwan, N. A., Ahmed, N. S. The diagnostic value of arginase-1 immunostaining in differentiating hepatocellular carcinoma from metastatic carcinoma and cholangiocarcinoma as compared to HepPar-1. Diagnostic Pathology. 7, 149(2012).
  44. Chen, A., Guo, Z., Fang, L., Blan, S. Application of fused organoid models to study human brain development and neural disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 133(2020).
  45. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).
  46. Kosheleva, N. V., et al. Cell spheroid fusion: beyond liquid drops model. Scientific Reports. 10 (1), 12614(2020).
  47. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids and fabrication of scaffold-free tubular constructs. PloS One. 15 (4), 0243248(2020).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Cultivo de organoidesCultivo de esferoidesProcesamiento de hidrogelesDispositivo multiprop sitoMarcaje por inmunofluorescenciaMicroscop a confocalMicroscop a electr nicaImagen completa de la muestraModelos celulares 3DProtocolo de criopreservaci n

Artículos relacionados