El presente protocolo describe la generación de modelos de cultivo tumoral 3D a partir de células cancerosas primarias y la evaluación de su sensibilidad a los fármacos mediante ensayos de viabilidad celular y exámenes microscópicos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos
En este artículo
Resumen
Resumen
A pesar de los notables avances en la comprensión de la biología tumoral, la gran mayoría de los candidatos a fármacos oncológicos que ingresan a los ensayos clínicos fracasan, a menudo debido a la falta de eficacia clínica. Esta alta tasa de fracaso ilumina la incapacidad de los modelos preclínicos actuales para predecir la eficacia clínica, principalmente debido a su insuficiencia para reflejar la heterogeneidad tumoral y el microambiente tumoral. Estas limitaciones se pueden abordar con modelos de cultivo tridimensionales (3D) (esferoides) establecidos a partir de muestras de tumores humanos derivados de pacientes individuales. Estos cultivos 3D representan la biología del mundo real mejor que las líneas celulares establecidas que no reflejan la heterogeneidad tumoral. Además, los cultivos 3D son mejores que los modelos de cultivo bidimensionales (2D) (estructuras monocapa), ya que replican elementos del entorno tumoral, como hipoxia, necrosis y adhesión celular, y preservan la forma y el crecimiento natural de las células. En el presente estudio, se desarrolló un método para preparar cultivos primarios de células cancerosas de pacientes individuales que son 3D y crecen en esferoides multicelulares. Las células pueden derivarse directamente de tumores de pacientes o xenoinjertos derivados de pacientes. El método es ampliamente aplicable a tumores sólidos (por ejemplo, colon, mama y pulmón) y también es rentable, ya que se puede realizar en su totalidad en un laboratorio típico de investigación / biología celular del cáncer sin depender de equipos especializados. En este documento, se presenta un protocolo para generar modelos de cultivo tumoral 3D (esferoides multicelulares) a partir de células cancerosas primarias y evaluar su sensibilidad a los medicamentos utilizando dos enfoques complementarios: un ensayo de viabilidad celular (MTT) y exámenes microscópicos. Estos esferoides multicelulares se pueden utilizar para evaluar posibles candidatos a fármacos, identificar posibles biomarcadores u objetivos terapéuticos, e investigar los mecanismos de respuesta y resistencia.
Introducción
Los estudios in vitro e in vivo representan enfoques complementarios para desarrollar tratamientos contra el cáncer. Los modelos in vitro permiten el control de la mayoría de las variables experimentales y facilitan los análisis cuantitativos. A menudo sirven como plataformas de detección de bajo costo y también se pueden utilizar para estudios mecanicistas1. Sin embargo, su relevancia biológica es inherentemente limitada, ya que tales modelos sólo reflejan parcialmente el microambiente tumoral1. Por el contrario, los modelos in vivo, como los xenoinjertos derivados del paciente (PDX),....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
La recolección de muestras de tumores humanos utilizados para los cultivos de células tumorales primarias se realizó según los protocolos aprobados por la junta de revisión institucional (IRB) en el Centro Médico Rabin con el consentimiento informado por escrito de los pacientes. Los pacientes elegibles para participar en el estudio incluyeron hombres y mujeres adultos y pacientes pediátricos con cáncer de mama, colon, hígado, pulmón, neuroendocrino, ovario o páncreas no metastásico, cualquier cáncer pediátrico o cualquier cáncer metastásico. El único criterio de exclusión fue la falta de capacidad para dar su consentimiento informado.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Este protocolo presenta procedimientos para generar un cultivo homogéneo de esferoides a partir de células tumorales primarias, evaluar cuantitativamente la eficacia del fármaco en el cultivo de esferoides (ensayo MTT) y determinar el efecto de los fármacos del estudio sobre la morfología del esferoide. Se presentan los datos de los experimentos representativos en esferoides generados a partir de cultivos celulares de cáncer de colon y mama. Se realizaron experimentos similares con otros tipos de tumores, incluidos el co.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El presente protocolo describe un método simple para generar cultivos celulares primarios 3D (esferoides) derivados de muestras de tumores humanos. Estos esferoides se pueden utilizar para diversos análisis, incluida la evaluación de posibles candidatos a fármacos y combinaciones de fármacos, la identificación de posibles biomarcadores u objetivos terapéuticos, y la investigación de los mecanismos de respuesta y resistencia. El protocolo utiliza células tumorales primarias derivadas directamente de muestras de pacientes .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5 Fluorouracilo | TEVA Israel | lote 16c22NA | Fluorouracilo, Adrucil |
| Accutasa | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Disociación |
| Cisplatino | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 Matriz de | membrana basal, tipo 3 |
| DMSO (dimetilsulfóxido) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer Lector ELISA | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Ácido clorhídrico (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | para la solución de parada |
| ImageJ | Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU. | Versión 1.52a | Software de código abierto ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | para solución de parada |
| L-glutamina | Gibco 1843977 | ||
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio |
| Aminoácidos no esenciales | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) * sin |
| – estreptomicina | Invitrogen | 2119399 | |
| Libre de fenol RPMI 1640 | Industrias biológicas, Israel | 01-103-1A | |
| Reservorio de pipeteo | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 medio de cultivo | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basilea, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Solución de azul de tripano al 0,5% | Industrias biológicas, Israel | 03-102-1B | |
| Placa de 96 pocillos de fijación ultrabaja | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
Referencias
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).
- Yoshida, G. J.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
