Artículo de método

Aislamiento, activación y expansión de células T basadas en flotación a partir de muestras de células mononucleares de sangre periférica humana utilizando microburbujas

DOI:

10.3791/64573

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23 de diciembre de 2022

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1Research and Development, Akadeum Life Sciences, 2Akadeum Life Sciences

En este artículo

Resumen

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El objetivo de este estudio es demostrar la viabilidad de la separación basada en flotación para aislar, activar y expandir las células T humanas primarias.

Resumen

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El proceso de aislamiento de células T de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para establecer cultivos ex vivo es crucial para la investigación, las pruebas clínicas y las terapias basadas en células. En este estudio, se presenta un protocolo simple y novedoso para aislar, activar y expandir las células T de PBMC ex vivo . Este estudio utiliza la tecnología de clasificación celular activada por flotabilidad funcionalizada (BACS) para aislar y activar las células T. Brevemente, el protocolo implica la selección positiva de células CD3 + de PBMC derivadas de leukopak, seguida de una coestimulación de 48 h con microburbujas de estreptavidina (SAMB) anti-CD28 unidas a CD28 antes de la transducción en placas de 24 pocillos. Las microburbujas funcionalizadas ofrecen una oportunidad única para activar las células de forma boyante, lo que lleva a fenotipos proliferativos que permiten la expansión con un agotamiento mínimo. Esta técnica ofrece un agotamiento reducido porque las microburbujas coestimuladoras permanecen flotantes y regresan a la parte superior del medio de cultivo, reduciendo así la cantidad de tiempo que las células en expansión están en contacto con los factores coestimuladores. Los resultados indican que las células T aisladas y cultivadas reciben suficiente estimulación para activarse y proliferar, pero no en una medida que conduzca a la sobreactivación, que luego conduce al agotamiento, como lo demuestra la presencia de PD-1 excesiva.

Introducción

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Actualmente se están llevando a cabo más de 500 ensayos clínicos de terapia de células T con receptores de antígenos quiméricos (CAR) en todo el mundo, y cuatro productos de terapia de células CAR-T están disponibles en el mercado1. Sin embargo, todavía existen numerosas necesidades de investigación y fabricación de células CAR-T que deben abordarse para mejorar la eficacia, la escalabilidad y el éxito a largo plazo de estas terapias potencialmente curativas 2,3,4,5. La investigación clínica y la fabricación adoptiva de células CAR-T comienza con el aislamiento de células T de una muestra de sangre periférica y la posterior estimulación, transducción y expansión de las células aisladas. Parámetros como la recuperación de células T, la pureza y las señales de activación/agotamiento requieren una cuidadosa consideración al elegir las técnicas de aislamiento y estimulación celular para la investigación y fabricación de células CAR-T 3,4,6. Es importante destacar que la mejora en la persistencia terapéutica de las terapias de células CAR-T minimizando los impedimentos biológicos que resultan de los procesos de fabricación actuales, como el agotamiento de las células T, es necesaria para mejorar la eficacia terapéutica 6,7.

Como alternativa a los métodos tradicionales de aislamiento celular, como la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y la clasificación celular activada magnéticamente (MACS), aquí se demuestra la clasificación celular activada por flotabilidad (BACS) con microburbujas para el aislamiento de células T. La separación de microburbujas utiliza microesferas huecas flotantes (microburbujas) para unir los objetivos y hacerlos flotar a la superficie de las muestras de fluidos 8,9. Al funcionalizar microburbujas con anticuerpos (es decir, anti-CD3), las poblaciones de células T deseadas pueden seleccionarse positivamente a partir de muestras de sangre periférica. Posteriormente, se demuestra en este trabajo el uso de una población diferente de microburbujas funcionalizadas con anticuerpos (es decir, anti-CD28) para coestimular y activar células T seleccionadas positivamente en suspensión. Las microburbujas ofrecen un flujo de trabajo de aislamiento y activación simple y altamente ajustable que genera células T listas para el cultivo de células suspendidas y aplicaciones posteriores como la modificación genética y la expansión. Críticamente, la activación celular flotante con microburbujas promueve la estimulación celular restringida para prevenir el agotamiento excesivo de las células T7.

Para este estudio, la citometría de flujo fue la principal herramienta utilizada para analizar el éxito del aislamiento, activación y transducción de las microburbujas funcionalizadas, así como para proporcionar información detallada sobre las subpoblaciones específicas presentes durante las fases de crecimiento y expansión después de la transducción. Además de la citometría de flujo, se utilizaron microscopía de campo claro y fluorescencia para confirmar la salud celular, la morfología y el éxito de la transducción. Sobre la base de estos resultados, la tecnología y el protocolo de microburbujas proporcionan una alternativa más sintonizable y suave a los métodos tradicionales de aislamiento y activación actualmente en uso; en particular, las células activadas por microburbujas muestran una expresión notablemente menor de marcadores de agotamiento de células T que la observada típicamente con herramientas y kits estándar de la industria.

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Protocolo

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1. Aislamiento de células T con microburbujas mediante selección positiva

NOTA: Este protocolo detalla un enfoque de selección positiva CD3+ a pequeña escala utilizando SAMB.

  1. Incubar 3 x 108 PBMC obtenidos comercialmente en 2,5 ml de tampón de separación con anticuerpo anti-CD3 biotinilado (OKT3) a una concentración de 25 ng de anticuerpo por 1 millón de células (25 ng/M). Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo, e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
  2. Agregue microburbujas de estreptavidina (SAMB) en una proporción de 0.5 (cantidad de SAMB): 1 (cantidad de células) de acuerdo con la concentración de SAMB informada por el fabricante.
  3. Mezclar utilizando un rotador comercial de extremo a extremo (EOE) a 20 rpm durante 10-15 min a temperatura ambiente. Centrifugar durante 5 min a 400 x g a temperatura ambiente.
  4. Después de la centrifugación, las células seleccionadas positivamente estarán en la parte superior de la suspensión con los SAMB. Las células restantes no seleccionadas estarán en el pellet de células en la parte inferior del tubo. Con una pipeta de vidrio de 9 pulgadas, inserte la punta debajo de la capa de celda de burbuja en el fondo del tubo, aspire el pellet de celda y el subnadante con una pipeta electrónica y transfiéralos a un nuevo tubo.

2. Coestimulación (activación) de las células T seleccionadas positivamente

  1. Resuspenda la capa de células burbuja que queda en el tubo original en 1 ml de medio de células T completo (u otro medio deseado).
  2. Cuente las células en el subnadante con microscopía de campo claro utilizando un contador de células automatizado y reste este valor del número de células iniciales para determinar el número de células capturadas en la capa de células burbuja.
  3. Antes de este paso, mezcle el anticuerpo anti-CD28 biotinilado con SAMB comerciales durante un mínimo de 2 h para crear los SAMB anti-CD28 conjugados. Póngase en contacto con el fabricante de los SAMB para determinar la cantidad de anticuerpo anti-CD28 necesaria para la conjugación. Agregue los SAMB conjugados anti-CD28 a la suspensión de células burbuja resultante del paso 2.1 utilizando una proporción de 1.5 (SAMB anti-CD28):1 (células).
  4. Mezclar usando rotación EOE durante 15 min, y luego ajustar el volumen total a 2 millones de células por ml con medio de células T completo u otro medio deseado de acuerdo con el número de células obtenido en el paso 2.2.

3. Expansión de las células coestimuladas en medio de cultivo celular

  1. Distribuir 1 ml de células activadas a partir del paso 2.4 a una concentración de 2 m/ml por pocillo en una placa de 24 pocillos. Incubar en una incubadora humidificada deCO2 al 5% a 37 °C.
  2. Después de 24 h, agregue 50 U/mL de IL-2 y 25 ng/M de anti-CD3 soluble (OKT3) para estimular aún más la expansión, calculado utilizando el número inicial de células plateadas en el día 0. Vuelva a colocar la placa celular en la incubadora humidificada deCO2 y déjela incubar durante la noche a 37 °C.

4. Opcional: Transducción de células T activadas con lentivirus

NOTA: El enfoque utilizado aquí está adaptado de Prommersberger et al. 10.

  1. Descongele el lentivirus a temperatura ambiente y mezcle brevemente con pipeteo.
  2. Retire suavemente el nadante medio, 600 μL de cada pocillo, sin tocar las células hijas que ahora están en el fondo del pocillo o la capa de burbujas que ha quedado en la superficie de la solución.
  3. Agregue 5 μg / ml de bromuro de hexadimetrina por pocillo para mejorar la transducción viral. Agregue las partículas lentivirales a una multiplicidad de infección (MOI) de 3 (partículas lentivirales por célula).
  4. Centrifugar la placa durante 45 min a 800 x g y 32 °C con una aceleración lenta y sin interrupciones para la desaceleración. Incubar las células durante 4 h en una incubadora humidificada deCO2 a 37 °C.
  5. Después de 4 h, agregue 600 μL de medio de células T completo fresco disponible comercialmente y 50 U/ml de IL-2 a cada pocillo, y vuelva a colocar la placa celular en la incubadora humidificada deCO2 a 37 °C para la expansión de células T.

5. Expansión de las células T (con o sin transducción previa)

  1. Cada 2 días, retire la mitad del medio del mosquito medio, reemplácelo con un medio de células T fresco y completo, y agregue IL-2 a una concentración de 50 U / ml.
  2. Cuente las células T dos veces por semana para evaluar la densidad celular. Cuando la densidad celular exceda 2 x 10 6-2.5 x 106 células/ml, transfiera las células a un recipiente más grande, diluyéndolas a 5 x 105 células/ml.

6. Recolección de las células T y citometría de flujo

  1. Mezclar suavemente el contenido de cada pocillo pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Retire todo el contenido del pozo, incluidas las microburbujas, y transfiéralas a un tubo de 1,5 ml.
  2. Lave cada pocillo con 400 μL de DPBS sin calcio y sin magnesio (-/-), y transfiera la solución a un tubo de 1,5 ml. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  3. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 50 μL de tampón de separación.
  4. Manchar con un anticuerpo de activación y agotamiento/cóctel de tinción, e incubar durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Prepare los cócteles de tinción de la siguiente manera: cóctel de activación: AF700-CD3, PE / Dazzle-CD4, PE / Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; cóctel de agotamiento: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
  5. Agregue 1 ml de tampón de separación y mezcle suavemente. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente para eliminar el exceso de anticuerpos. Aspirar el sobrenadante completamente.
  6. Resuspender el pellet celular en 1 ml de tampón de separación y transferirlo a un recipiente apropiado (por ejemplo, un tubo FACS, una placa de 96 pocillos, etc.) para el análisis de citometría de flujo. El esquema de compuerta de análisis de citometría de flujo recomendado se detalla en la Figura 1.

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Resultados

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Las células T se aislaron de PBMC compradas y se colocaron en placas para su activación como se describe en el protocolo. Las muestras de control negativo (PBMC compradas) no se activaron. Estas muestras de control se incluyeron para demostrar el efecto que el proceso de activación de microburbujas tuvo en las muestras experimentales en comparación con los controles de células T intactas y no estimuladas, asegurando que los marcadores de activación observados fueran el resultado de los factores de activación agregados y ...

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Discusión

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El protocolo descrito permite el aislamiento de células T de muestras de PBMC y la activación de células T suspendidas en medios de cultivo con microburbujas. Este método se basa en microburbujas funcionalizadas cuya flotabilidad inherente ofrece una oportunidad única para introducir señales coestimuladoras a las células y activarlas mientras están suspendidas en un medio de cultivo, reduciendo así la exposición de las células en expansión a la estimulación prolongada; tal sobreestimulación puede resultar en el aumento d...

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Divulgaciones

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Todos los autores, en el momento de la presentación, son empleados de Akadeum Life Sciences, que fabrica y vende productos de separación de microburbujas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-MercaptoetanolGibco21985-023CAS: 60-24-2
Biologix Placas de cultivo multipocillo Placas de 24 pocillosVWR 76081-560
Biotina anti-humano CD28 (28.2)Anticuerpo Biolegend302904
Biotina anti-humano CD3 (OKT3) AnticuerpoBiolegend317320
DPBS, sin calcio, sin magnesioGibco14190-136
GlutaMAX SuplementoThermofisher 35050061
Humano Recombinante IL2 BioVision (vwr)10006-122
Partícula lentiviral rLV.EF1.zsGreen1-9Takara Bio0038VCT
LeukopakBioIVTHUMANLMX100-0001129
PBMC humanos normalesBioIVTHUMANHLPB-0002562
Penicilina/estreptomicina 100X para cultivo de tejidosVWR97063-708CAS: 8025-06-7
Polybrene Reactivo de infección/transfecciónMillipore SigmaTR-1003-GCAS:28728-55-4
Suero AB humano combinado Plasma derivado del calor inactivadoInvestigación innovadoraISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPESGibco72400047
Streptavidin Microbubble Kit (incluye el tampón de separación de Akadeum)Akadeum11110-000

Referencias

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  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
  3. Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223(2019).
  4. Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
  5. Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
  6. Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832(2020).
  7. Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580(2017).
  8. Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).
  9. McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).
  10. Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93(2020).
  11. Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
  12. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104(2010).

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