Method Article

Propagación de virus y cuantificación colorimétrica basada en células

DOI:

10.3791/64578

⸱

April 7th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente protocolo describe la propagación del virus del Zika (ZIKV) en células de riñón de mono verde africano Vero y la cuantificación del ZIKV utilizando métodos de inmunodetección colorimétrica basados en células en formatos de 24 y 96 pocillos (alto rendimiento).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El virus del Zika (ZIKV) es un virus transmitido por mosquitos que pertenece al género Flavivirus. La infección por ZIKV se ha asociado con anomalías cerebrales congénitas y, potencialmente, con el síndrome de Guillain-Barré en adultos. La investigación sobre el ZIKV para comprender los mecanismos de la enfermedad es importante para facilitar el desarrollo de vacunas y tratamientos. El método de cuantificación de virus es crucial y fundamental en el campo de la virología. El ensayo de formación de foco (FFA) es un ensayo de cuantificación de virus que detecta el antígeno viral con anticuerpos e identifica los focos de infección de las células mediante la técnica de inmunotinción de peroxidasa. El presente estudio describe el protocolo de propagación y cuantificación del virus utilizando formatos de 24 y 96 pocillos (alto rendimiento). En comparación con otros estudios similares, este protocolo ha descrito además la optimización del tamaño de los focos, lo que puede servir como guía para ampliar el uso de este ensayo para otros virus. En primer lugar, la propagación del ZIKV se realiza en células Vero durante 3 días. El sobrenadante de cultivo que contiene ZIKV se cosecha y cuantifica utilizando el FFA. Brevemente, el cultivo del virus se inocula en células Vero y se incuba durante 2-3 días. La formación de focos se determina después de procesos de tinción optimizados, incluida la fijación celular, la permeabilización, el bloqueo, la unión de anticuerpos y la incubación con sustrato de peroxidasa. Los focos de virus teñidos se visualizan utilizando un microscopio estereoscópico (recuento manual en formato de 24 pocillos) o un analizador de software (recuento automatizado en formato de 96 pocillos). El FFA proporciona resultados reproducibles y relativamente rápidos (3-4 días) y es adecuado para ser utilizado para diferentes virus, incluidos los virus que no forman placa. Posteriormente, este protocolo es útil para el estudio de la infección por ZIKV y podría utilizarse para detectar otros virus clínicamente importantes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La infección por el virus del Zika (ZIKV) es una enfermedad viral emergente transmitida por mosquitos. El primer aislamiento del ZIKV fue en Uganda en 1947 1,2; Permaneció desatendida desde 1947 hasta 2007, ya que los síntomas clínicos son más comúnmente asintomáticos y se caracterizan por enfermedad febril autolimitada. En 2007, la epidemia de zika comenzó en las islas Yap 3,4, seguida de epidemias más grandes en las regiones del Pacífico (Polinesia Francesa, Isla de Pascua, Islas Cook y Nueva Caledonia) de 2013 a 2014 5,6,7,8, donde se notificó por primera vez la complicación neurológica grave síndrome de Guillain-Barré (SGB) en adultos 9. Durante 2015 y 2016, la primera epidemia generalizada de ZIKV se extendió por las Américas después de la aparición del genotipo asiático de ZIKV en Brasil en 201310. Durante este brote, se notificaron entre 440.000 y 1,3 millones de casos de microcefalia y otros trastornos neurológicos en recién nacidos11. Actualmente no existe una cura o tratamiento específico para la infección por ZIKV; por lo tanto, existe una necesidad médica urgente de vacunas contra el ZIKV capaces de prevenir infecciones, particularmente durante el embarazo.

La cuantificación de virus es un proceso para determinar el número de virus presentes en una muestra. Desempeña un papel importante en la investigación, y los laboratorios académicos abarcan muchos campos, como la medicina y las ciencias de la vida. Este proceso también es importante en sectores comerciales, como la producción de vacunas virales, proteínas recombinantes, antígenos virales o agentes antivirales. Se pueden utilizar muchos métodos o ensayos para la cuantificación del virus12. La elección de los métodos o ensayos normalmente depende de las características del virus, el nivel de precisión deseado y la naturaleza del experimento o investigación. En general, los métodos de cuantificación de virus se pueden dividir en dos categorías: ensayos moleculares que detectan la presencia de ácido nucleico viral (ADN o ARN) y ensayos que miden la infectividad del virus in vitro12. La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR, para el ADN) o la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR, para el ARN)13 y la PCR digital en gotas14 son ejemplos de técnicas moleculares comunes utilizadas para cuantificar el ácido nucleico viral en una muestra determinada15. Sin embargo, estas técnicas moleculares altamente sensibles no pueden diferenciar entre virus viables y no viables15. Por lo tanto, la investigación que requiere información sobre características biológicas, como la infectividad del virus en las células, no puede completarse utilizando las técnicas moleculares antes mencionadas; Se necesitan ensayos que puedan medir y determinar la presencia de virus viables. Los ensayos que miden la infectividad del virus incluyen el ensayo de formación de placa (PFA), la dosis infecciosa de cultivo de tejidos al 50% (TCID50), el ensayo de foco fluorescente y la microscopía electrónica de transmisión (TEM)12.

El PFA, desarrollado por Renato Dulbecco en 1952, es uno de los métodos más utilizados para la titulación de virus, incluido el ZIKV16. Se utiliza para determinar directamente las concentraciones virales de viriones líticos infecciosos. El método se basa en la capacidad de un virus lítico para producir efectos citopáticos (CPEs; zonas de muerte celular o placas, un área de infección rodeada de células no infectadas) en una monocapa celular inoculada después de una infección viral. Sin embargo, existen varios inconvenientes en el ensayo que afectan a su utilidad. El ensayo requiere mucho tiempo (tarda aproximadamente entre 7 y 10 días, dependiendo de los virus), depende de la EPC y es propenso a errores. En el presente estudio, presentamos una técnica inmunocolorimétrica, el ensayo de formación de foco (FFA), para detectar y cuantificar el ZIKV en formatos de placa de 24 pocillos y placa de 96 pocillos.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Propagación de virus

  1. Preparación celular
    1. Cultivar células Vero en un matraz de cultivo celular de75 cm2 que contenga 12 mL de medio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y 2 mM de L-glutamina (ver Tabla de Materiales). Incubar las células en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2.
    2. Monitorear las células bajo un microscopio; una vez que las células alcanzan el 70%-90% de confluencia, están listas para ser utilizadas (Figura 1A).
      NOTA: Las células Vero se duplican aproximadamente cada 24 h17. Las diluciones de 1:10 deben tardar de 3 a 4 días en alcanzar una confluencia del 80%-90% en un matraz de 75cm2 . Monitoree las células diariamente o cada dos días.
  2. Infección de la monocapa celular
    1. Retirar el medio de crecimiento del matraz de cultivo celular con una pipeta serológica de 10 ml. Enjuague el matraz con 3 ml de solución salina tamponada con fosfato (dPBS) de Dulbecco 2 veces con una pipeta serológica de 5 ml.
      NOTA: Se debe preparar un vaso de precipitados con hipoclorito de sodio al 10% para desinfectar cualquier residuo líquido infeccioso desechado de frascos/placas.
    2. Añadir 2 mL de DMEM sin suero (DMEM suplementado con 2 mM de L-glutamina sin FBS) y 20 μL de inóculo de ZIKV en el matraz de cultivo celular. Incubar el matraz con un balanceo suave durante 1 h a temperatura ambiente para permitir la adsorción del virus.
      NOTA: La valoración de la cepa inicial de ZIKV será útil para determinar el volumen de adición de inóculo de ZIKV (paso 2).
      PRECAUCIÓN: El ZIKV está clasificado como un patógeno de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Todos los procedimientos con materiales que contengan ZIKV deben realizarse en un gabinete de bioseguridad certificado y seguir todos los procedimientos operativos estándar (SOP) del laboratorio con el equipo de protección personal adecuado.
  3. Adición del medio de superposición
    1. Después de 1 h de incubación, retire y deseche el inóculo del virus diluido con una pipeta serológica de 5 ml. Enjuague el matraz de cultivo celular con 3 ml de dPBS 2x.
    2. Añadir 12 mL de medio de mantenimiento (DMEM suplementado con FBS al 2%, 2 mM L-glutamina y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina) en el matraz de cultivo celular para mantener las células infectadas.
    3. Incubar las células Vero infectadas durante 3 días en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2.
      NOTA: Monitoree diariamente el CPE de las células Vero infectadas bajo un microscopio.
  4. Recolección de sobrenadante de cultivo celular que contiene ZIKV
    1. En el día 3 después de la infección, se puede observar redondeo y desprendimiento de células (CPE) (Figura 1B-D). Extraer el sobrenadante de cultivo celular que contiene el ZIKV en un tubo de centrífuga de 50 ml utilizando una pipeta serológica de 10 ml.
    2. Utilice un filtro de jeringa de polietersulfona de 0,22 μm (consulte la tabla de materiales) para filtrar el sobrenadante del cultivo celular. Aliquotar 500 μL del sobrenadante de cultivo celular filtrado en tubos de rosca de 2,0 mL y almacenar a -80 °C hasta su uso posterior.
      NOTA: El ZIKV cosechado se puede almacenar a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.
      PRECAUCIÓN: Se deben tomar precauciones adicionales si se usa una aguja de jeringa, ya que la aguja puede perforar la piel. Es necesario establecer procedimientos operativos estándar de laboratorio.

2. Cuantificación del virus

  1. Preparación celular
    1. Siembre células Vero en placas designadas (placa de 24 pocillos: 0,5 ml/pocillo, 7,5 x 104 células/pocillo; placa de 96 pocillos: 0,1 ml/pocillo, 1,5 x 104 células/pocillo) e incube la placa durante la noche en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2.
      NOTA: Hay cinco puntos de tiempo diferentes que se deben analizar (placa de 24 pocillos: 48 h, 60 h, 72 h, 84 h y 96 h después de la infección; placa de 96 pocillos: 24 h, 36 h, 48 h, 60 h y 72 h post-infección); Por lo tanto, prepare un plato para cada punto de tiempo.
    2. Después de las 24 h de incubación y una vez que las células alcanzan el 70%-90% de confluencia (Figura 1E), la placa está lista para la infección. Proceda a preparar el stock de virus diluido (paso 2.2) antes de la infección de la monocapa celular.
  2. Dilución de virus
    1. Para placas de 24 y 96 pocillos, prepare seis tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 ml para cada placa para llevar a cabo una dilución diez veces mayor (10-1 hasta 10-5), incluido un control negativo. Para la configuración del experimento para una placa de 24 pocillos, agregue 450 μL de DMEM sin suero en los seis tubos de microcentrífuga. Para la configuración del experimento para una placa de 96 pocillos, agregue 135 μL de DMEM sin suero en seis tubos.
      NOTA: Etiquete cada tubo claramente para indicar la dilución de su contenido antes de realizar la dilución en serie diez veces.
    2. Para realizar la dilución en serie, para la configuración del experimento de placa de 24 pocillos, agregue 50 μL de caldo de ZIKV que se cosechó en el paso 1 en el tubo 10-1 que contiene 450 μL de DMEM sin suero. Para la configuración del experimento de placa de 96 pocillos, agregue 15 μL de stock de ZIKV en el tubo 10-1 que contiene 135 μL de DMEM sin suero.
    3. Vórtice cada tubo para mezclar el virus y el medio. Esta es la primera dilución diez veces mayor.
      NOTA: Se requiere una mezcla adecuada de virus y medio de cultivo en cada tubo de dilución para garantizar una dilución en serie precisa.
    4. Para la configuración del experimento de la placa de 24 pocillos, utilice una punta de pipeta nueva para resuspender el tubo 10-1 y transfiera 50 μL de ZIKV diluido al tubo 10-2 como una segunda dilución diez veces mayor. Para la configuración del experimento de la placa de 96 pocillos, utilice una punta de pipeta nueva para volver a suspender el tubo 10-1 y transfiera 15 μl de ZIKV diluido al tubo 10-2 como una segunda dilución diez veces.
    5. Repita el paso 2.2.4 cuatro veces hasta el quinto tubo (excluyendo el control negativo).
      NOTA: Utilice una punta de pipeta nueva después de cada paso de pipeteo para evitar la contaminación cruzada.
  3. Infección de la monocapa celular
    1. Retire y deseche el medio acondicionado de cada pocillo (placa de 24 pocillos: 0,5 ml/pocillo; placa de 96 pocillos: 0,1 ml/pocillo).
    2. Enjuague cada pocillo con dPBS 2x (placa de 24 pocillos: 300 μL/pocillo; placa de 96 pocillos: 60 μL/pocillo).
    3. Trabajando de la dilución más alta a la más baja, agregue cada inóculo de virus diluido en serie en el pocillo (placa de 24 pocillos: 200 μL/pocillo; placa de 96 pocillos: 40 μL/pocillo).
      NOTA: La infección de cada dilución se realizará en pocillos duplicados. Mantenga dos pozos no infectados como control negativo. Etiquete la placa y los pocillos claramente para evitar confusiones. Cambie las puntas de pipeta después de cada paso de pipeteo para evitar la contaminación cruzada.
    4. Incubar la placa con un balanceo suave durante 1 h a temperatura ambiente para permitir la adsorción del virus.
  4. Adición del medio de cultivo celular superpuesto
    1. Después de 1 h de incubación, retire y deseche la suspensión del virus desde la concentración más baja hasta la más alta.
    2. Lave las células infectadas con dPBS 2x (placa de 24 pocillos: 300 μL/pocillo; placa de 96 pocillos: 60 μL/pocillo).
    3. Recubra el pocillo con DMEM (suplementado con 2% de FBS, 2 mM de L-glutamina y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina) y 1,5% de carboximetilcelulosa de baja viscosidad (CMC; ver Tabla de Materiales) (placa de 24 pocillos: 1 mL/pocillo; placa de 96 pocillos: 0,2 mL/pocillo).
    4. Incubar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2.
      NOTA: No altere la placa durante este período de incubación.
    5. Saque la placa de la incubadora de cultivo celular para teñirla en diferentes momentos (placa de 24 pocillos: 48 h, 60 h, 72 h, 84 h y 96 h después de la infección; placa de 96 pocillos: 24 h, 36 h, 48 h, 60 h y 72 h postinfección).

3. Tinción

  1. Fijación celular
    1. Después de las horas específicas de incubación (placa de 24 pocillos: 48 h, 60 h, 72 h, 84 h y 96 h post-infección; placa de 96 pocillos: 24 h, 36 h, 48 h, 60 h y 72 h post-infección), retire y deseche el medio de recubrimiento y lave las celdas 3 veces con 1x PBS. Para la placa de 96 pocillos, retire y deseche el medio de recubrimiento y lave las celdas 3 veces con 60 μL/pocillo de 1x PBS con una pipeta multicanal.
    2. Agregue un 4% de paraformaldehído para fijar las células (placa de 24 pocillos: 300 μL/pocillo; placa de 96 pocillos: 60 μL/pocillo). Incubar la placa a temperatura ambiente durante 20 min.
      PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es un formaldehído polimerizado sólido. Es un polvo cristalino blanco, sólido e inflamable que libera gas formaldehído cuando se mezcla con agua o se calienta. Todos los procedimientos que impliquen el uso de paraformaldehído deben llevarse a cabo en una campana extractora química certificada o en recintos de escape aprobados siguiendo los procedimientos normalizados de trabajo de laboratorio específicos para los productos químicos que contienen formaldehído.
    3. Después de 20 minutos, deseche el paraformaldehído y lave las celdas 3 veces con 1 PBS. Realice permeabilización, bloqueo e incubación de anticuerpos siguiendo los pasos 3.2-3.5.
      NOTA: Al desechar el paraformaldehído al 4%, siga el procedimiento de eliminación de desechos de la universidad o instituto.
  2. Permeabilización celular
    1. Añadir un 1% de poli(etilenoxi)etanol de octilfenoxi (ver Tabla de Materiales) para permeabilizar las células (placa de 24 pocillos: 200 μL/pocillo; placa de 96 pocillos: 40 μL/pocillo). Incubar la placa a temperatura ambiente durante 15 min.
    2. Después de 15 minutos, deseche el poli(etilenoxi)etanol de octilfenoxi y lave las celdas 3 veces con 1x PBS.
  3. Bloqueante
    1. Añadir un 3% de leche desnatada para reducir la unión inespecífica en la muestra (placa de 24 pocillos: 500 μL/pocillo; placa de 96 pocillos: 100 μL/pocillo). Incubar la placa a temperatura ambiente durante 2 h.
    2. Después de 2 h, deseche la leche descremada al 3% y lave las celdas 3 veces con 1x PBS.
      NOTA: Este es un punto de parada. Después de añadir leche desnatada al 3%, las placas pueden almacenarse a 4 °C hasta 2 días antes de la inserción del anticuerpo primario.
  4. Incubación primaria de anticuerpos
    1. Añadir anticuerpo monoclonal anti-flavivirus, 4G2 (clon D1-4G2-4-15; anticuerpo primario, ver Tabla de materiales) diluido en leche desnatada al 1% (proporción 1:1.000) (placa de 24 pocillos: 200 μL/pocillo; placa de 96 pocillos: 40 μL/pocillo). Incubar la placa a 37 °C durante 1 h.
    2. Después de 1 h, retire la solución que contiene el anticuerpo monoclonal y lave las células 3 veces con PBS 1x.
  5. Incubación secundaria de anticuerpos
    1. Añadir anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (ver Tabla de Materiales) diluido en leche desnatada al 1% (proporción 1:1.000) (placa de 24 pocillos: 200 μL/pocillo; placa de 96 pocillos: 40 μL/pocillo). Incubar las placas a 37 °C durante 1 h.
    2. Después de 1 h, retire la solución que contiene el anticuerpo secundario y lave las células 3 veces con 1x PBS.
  6. Incubación de sustratos
    1. Añadir sustrato de peroxidasa 3,3'diaminobencidina (DAB) (ver Tabla de materiales) e incubar la placa durante 30 min en la oscuridad (placa de 24 pocillos: 200 μL/pocillo; placa de 96 pocillos: 40 μL/pocillo). Después de 30 minutos, detenga la reacción lavando los pozos con agua.
    2. Seque las placas al aire durante la noche y proceda a la enumeración de focos después de que las placas estén completamente secas.

4. Determinación del título del virus

  1. Proceso de conteo manual de focos (formato de 24 pocillos)
    1. Los focos se pueden visualizar bajo un microscopio estereoscópico. Seleccione la dilución que produzca 50-200 focos.
    2. Cuente los focos para cada réplica de la dilución seleccionada. Calcular el número medio de focos para cada una de las diluciones seleccionadas.
    3. Calcule la unidad de formación de focos por ml (UFF/ml) para cada muestra con la siguiente fórmula: UFF/ml = número medio de focos contados/(dilución x volumen de virus diluido añadido).
  2. Proceso automatizado de recuento de focos (formato de 96 pocillos)
    1. Escanee la placa de 96 pocillos en un analizador de software comercial.
      1. Haga doble clic en el software (consulte la tabla de materiales) para abrirlo.
      2. Haga clic en Cambiar de conjunto y asegúrese de que el conjunto se cambie a cualquiera que sea aplicable (Figura complementaria 1A). Haga clic en Aceptar.
      3. Comience el escaneo haciendo clic en Escanear > escaneo de placa completa (Figura complementaria 1B).
      4. Haga clic en Panel de control para asegurarse de que el formato de captura sea el formato de 96 pocillos (Figura complementaria 2A).
      5. Seleccione el modo de centrado como "Prealineación automática verificada por el usuario" (Figura complementaria 2B).
      6. Haga clic en Expulsar para cargar la placa.
        NOTA: Abra la tapa del plato y colóquelo hacia arriba con la fila A en la parte superior (Figura suplementaria 3A).
      7. Introduzca el nombre de la placa y haga clic en Aceptar. Haga clic en Cargar para cargar la placa.
      8. Haga clic en Iniciar para iniciar el escaneo. Después de eso, calibre las posiciones para A1, A12 y H1 usando los botones "Arriba, Abajo, Izquierda, Derecha" y haga clic en Confirmar (Figura complementaria 3B).
        NOTA: El software comenzará a escanear cada pocillo.
      9. Una vez que se complete el escaneo, aparecerá una imagen general. Haga clic en Cerrar.
      10. Salga del escaneo haciendo clic en Volver a la centralita.
    2. Cuente la placa de 96 pocillos con el software.
      1. Haga clic en Contar > Recuento inteligente.
      2. En el software, se mostrará el "Paso 1 de 5: Seleccionar las placas que se van a contar". Haga clic en Cargar placa(s). Marque toda la carpeta y haga clic en Seleccionar para importar la placa escaneada (Figura complementaria 4A).
      3. En el software, se mostrará el "Paso 2 de 5: Definir los parámetros de conteo". Haga clic en Ajustar parámetros y se mostrarán los parámetros (proceso difuso; pequeño/normal/grande/más grande/más grande +1; separación de puntos; área contada; balance de fondo; eliminación de fibras; compuerta).
        NOTA: Comience con un pozo y verifique hacia adelante y hacia atrás para encontrar la mejor configuración para todos los pozos.
      4. Una vez hecho esto, haga clic en Siguiente (Figura complementaria 4B).
      5. En el software, se mostrará el "Paso 3 de 5: Seleccionar/anular la selección de pozos". Una vez completada la selección del pozo a contar, haga clic en Siguiente para continuar.
        NOTA: Los pozos seleccionados para ser contados aparecerán con una "C" en la esquina superior derecha de cada pozo (Figura Suplementaria 5A).
      6. En el software, mostrará "Paso 4 de 5: Configuración de salida". Haga clic en Ver/Modificar la configuración de salida para verificar si la configuración (como el formato de la imagen) es adecuada. Haga clic en Guardar y salga > siguiente (Figura complementaria 5B).
      7. En el software, se mostrará "Paso 5 de 5: Iniciar AutoCount". Haga clic en Iniciar recuento automático (Figura complementaria 6A).
      8. Una vez completado, haga clic en Salir de AutoCount.
  3. Realice el control de calidad (QC) en el analizador de software comercial.
    1. En la página de la centralita, haga clic en Control de calidad > Agregar placa(s). Marque toda la carpeta para importar la placa contada, haga clic en Seleccionar > Iniciar control de calidad (Figura complementaria 6B).
    2. Haga doble clic en cada pozo para auditar los puntos. Haga clic en Contar para eliminar cualquier mancha. El software empezará a contar.
      NOTA: Asegúrese de que la opción "Manchas: Eliminar" esté marcada. La finalización del recuento puede indicarse mediante el número de focos contados, por ejemplo "30" (Figura complementaria 7A).
    3. Una vez finalizado el conteo (indicado por el número de focos contados, por ejemplo "30"), haga clic en "Sí" para eliminar las manchas (Figura complementaria 7B). Haga triple clic con el botón izquierdo en el lugar que se va a eliminar. Haga clic con el botón derecho para finalizar y, a continuación, haga clic en Sí.
    4. Haga clic en Finalizar placa y vaya a Descripción general del proyecto una vez que se complete el control de calidad.
  4. Realice la obtención de imágenes con el analizador de software.
    1. Verifique la imagen escaneada, contada y de la placa de control de calidad (Figura 2).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El ZIKV se puede cuantificar utilizando el FFA, como se describe esquemáticamente en la Figura 3. Para la placa de 24 pocillos, las células Vero infectadas se fijaron a las 48 h, 60 h, 72 h, 84 h y 96 h después de la infección. Los resultados mostraron que las células permanecieron intactas (no se observó desprendimiento celular) después de 96 h (4 días) después de la infección (Figura 4 y Figura suplementaria 8A-E). La aparición de focos virale...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Existen varios ensayos para determinar el título del virus; la PFA tiene un protocolo de cuantificación del virus similar al de la FFA, en el que el inóculo del virus se diluye para permitir que se distingan placas o focos individuales. Después de la tinción, cada placa o foco indica una sola partícula infecciosa en el inóculo19. El PFA se tiñe con violeta cristalino para visualizar la formación de placa causada por la lisis o muerte celular. Por lo tanto, el PFA requiere más tiempo, ya que requie...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación recibió el apoyo del Ministerio de Educación Superior de Malasia en el marco del Programa de Becas de Investigación a Largo Plazo (LRGS MRUN Fase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) y la financiación del programa del Centro de Excelencia de Instituciones Superiores (HICoE) (MO002-2019). La figura 3 de este estudio, que muestra el flujo de trabajo de tinción para el ensayo de formación de focos, está adaptada de "DAB Immunohistochemistry" de BioRender.com (2022). Recuperado de https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 y micro; m Filtro de jeringa de polietersulfonaSartoriusS6534-FMOSK
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mLNest615601
10 mL pipeta serológica estérilLabserv 14955156
1x Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato (dPBS)Gibco14190-136
2.0 mL Tubo con tapón de rosca AxygenSCT-200-SS-C-S
Placa de 24 pocillosCorning3526
25 mL Pipetas serológicas estérilesLabserv14955157
3,3'Diaminobenzidina (DAB) sustrato de peroxidasaThermo Scientific34065
37 ° Incubadora C con 5% CO2SanyoMCO-18AIC
5 mL pipeta serológicaLabserv14955155
tubo de centrífuga de 50 mLFalconLAB352070
75 cm2 matraz de cultivo de tejidos Corning430725U
Placa de 96 pocillosFalcon353072
Anticuerpo monoclonal anti-flavivirus, 4G2 (clon D1-4G2-4-15)MilliporeSigmaMAB10216
Autoclave 20x Solución salina tamponada con fosfato (PBS)N/AN/A22,8 g de 8 mM Na2HPO4, 4,0 g de 1,5 mM KH2PO4, 160 g de NaCl 0,14 M, 4,0 g de KCl 2,7 mM, 1 L de MilliQ H2O Cabina de
seguridad biológica, Clase IIHoltenHB2448
CTL S6 Analizador universal ELISpot/FluoroSpotImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)CTL-S6UNV12Analizador de software comercial
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco12800-017
Bovino fetal suero (FBS)BovogenSFBS
Anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP)MilliporeSigma12-349
HemacitómetroLaboroptik LTDNeubauer IGEPAL mejorado
CA-630 detergenteSigma-AldrichI8896Octilfenoxi poli(etilenoxi)etanolIGEPAL 
Microscopio invertidoZEISSTELAVAL 31
Balancín de laboratorioFINEPCRCR300
L-GlutaminaGibco25030-081
Carboximetilcelulosa de baja viscosidad (CMC)Sigma-AldrichC5678
Micropipeta multicanal (10 - 100 & L)Micropipeta multicanal Eppendorf3125000036
(30 - 300 y micro; L)Eppendorf3125000052
ParaformaldehídoSigma-AldrichP6148
Penicilina-estreptomicinaGibco15140-122
Pipetas monocanal (10 - 100 y micro; L)Eppendorf3123000047
pipetas monocanal (100 - 1000 y micro; L)Eppendorf3123000063
Pipetas monocanal (20 - 200 y micro; L)Eppendorf3123000055
Leche desnatadaSunlac baja en grasaN/APrepare leche descremada al 3% en 1x PBS para la etapa de bloqueo en la tinción
Hipoclorito de sodioCloroxN/APara desinfectar cualquier residuo líquido infeccioso desechado de frascos/placas
Microscopio estereoscópicoNikonSMZ1000
Jeringa desechable, Luer Lock, 10 mL con aguja de 21 gTerumo
Células de riñón de mono verde africano Vero -ECACC 88020401Recibido de un colaborador. Sin embargo, las celdas Vero obtenidas de otros proveedores deberían poder usarse con cierta optimización.
SS10L21G

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