La cromatina es una estructura dinámica y fluida mantenida por las interacciones proteína-ADN, así como por las interacciones proteína-proteína. Tanto las proteínas histonas como las no histonas están involucradas en el mantenimiento de la estructura de la cromatina. ¿Cómo se median estas interacciones y cómo se altera la estructura de la cromatina durante los procesos que involucran al ADN como sustrato?
Se han desarrollado muchas técnicas para arrojar luz sobre la dinámica de la proteína-ADN, así como las interacciones proteína-proteína. Estos incluyen técnicas biofísicas como la espectroscopia de CD y métodos bioquímicos como la cromatografía de filtración en gel. Esta colección destaca algunas de estas técnicas que se pueden utilizar para explorar la dinámica de la arquitectura de la cromatina.
La integridad del ADN se puede analizar mediante citómetro de flujo (FACS), y Ling et al.1 adaptan este método para detectar defectos funcionales de los espermatozoides humanos. La fisiología de los espermatozoides se puede evaluar mediante el uso de biomarcadores como el daño del ADN, el potencial de membrana mitocondrial y la apoptosis de los espermatozoides. Ling et al. muestran que FACS se puede adaptar fácilmente para monitorear cada uno de estos parámetros para evaluar la fisiología de los espermatozoides, lo que demuestra que la técnica es un conjunto de herramientas prácticas y confiables para el diagnóstico de la infertilidad masculina.
La espectroscopia de CD es posiblemente uno de los métodos más fáciles para investigar la conformación de proteínas y ADN. Cada conformador de ADN tiene un patrón de banda característico. El cambio en el patrón de bandas se puede correlacionar con el cambio en la conformación del ADN y, por lo tanto, el cambio en la arquitectura del ADN se puede monitorear en presencia de proteínas que interactúan mediante el uso de un espectrofotómetro CD. Arya et al.2 utilizan esta técnica para estudiar el cambio en el ADN inducido por la interacción con la proteína de remodelación de la cromatina dependiente de ATP, SMARCAL1, en ausencia y presencia de ATP. Muestran que las alteraciones en la estructura del ADN se pueden correlacionar con la actividad transcripcional de la proteína.
La cromatografía de exclusión por tamaño y los ensayos pull-down se utilizan de forma rutinaria para monitorear las interacciones proteína-proteína. El ensamblaje de nucleosomas se ve facilitado por chaperonas de histonas que se unen a las histonas. Bobde et al.3 describen métodos y ensayos que se pueden utilizar para identificar si una función proteica determinada es una chaperona de histonas o no.
¿Cómo investigamos los mecanismos de ensamblaje de nucleosomas en tiempo real? Se han desarrollado técnicas de imágenes de una sola molécula, como la cortina de ADN, para visualizar el proceso de ensamblaje en tiempo real. La cortina de ADN es una técnica híbrida que combina fluidez lipídica, microfluídica y microscopía de reflexión interna total para obtener imágenes de la interacción proteína-ADN en tiempo real. Kang et al.4 describen la cortina de ADN como una técnica para estudiar el mecanismo subyacente al ensamblaje de la chaperona de histonas, Abo1, de S. pombe. Las técnicas descritas proporcionan una forma de examinar la dinámica de la cromatina, que juega un papel importante tanto en la estabilidad genómica como en la regulación epigenética de los procesos que involucran el material genético.
La inmunoprecipitación de cromatina tradicional (ChIP) requiere anticuerpos específicos contra la proteína de interés. Muchas veces, los anticuerpos no son lo suficientemente específicos, lo que lleva a resultados falsos positivos, especialmente al sondear los sitios de unión de los factores de transcripción. Los anticuerpos tampoco siempre están disponibles para las proteínas en todos los organismos. Candida albicans es uno de esos organismos para los que no se dispone de anticuerpos. El método Cut and Run elude estas limitaciones al fusionar MNasa con el factor de transcripción de interés. Qasim et al.5 describen el uso de este método para determinar los sitios de unión de los factores de transcripción en C. albicans.
Los métodos descritos en esta colección proporcionan una visión de las técnicas disponibles para los investigadores. Todos estos métodos son versátiles y fácilmente adaptables para abordar las preguntas que hacen los investigadores.