Method Article

Evaluación del proceso y cinética de la expresión de la quitina desacetilasa recombinante en células de E. coli Rosetta pLysS mediante una técnica estadística

DOI:

10.3791/64590

⸱

March 10th, 2023

 ,  , 
1Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology, Manipal Academy of Higher Education (MAHE)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En el protocolo actual, se aplicó una técnica estadística, diseño central compuesto (CCD), para optimizar las condiciones de proceso para la expresión de quitina desacetilasa bacteriana recombinante (BaCDA) en células pLysS de E. coli Rosetta. El empleo de CCD resultó en un aumento de ~ 2.39 veces en la expresión y actividad de BaCDA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En los últimos años, ha ganado importancia la ruta más verde de la desacetilación de la quitina a quitosano utilizando la enzima quitina desacetilasa. El quitosano convertido enzimáticamente con características emulantes tiene una amplia gama de aplicaciones, particularmente en el campo biomédico. Se han reportado varias quitina desacetilasas recombinantes de diversas fuentes ambientales, pero no hay estudios sobre la optimización del proceso para la producción de estas quitina desacetilasas recombinantes. El presente estudio utilizó la metodología de diseño compuesto central de superficie de respuesta para maximizar la producción de quitina desacetilasa bacteriana recombinante (BaCDA) en E. coli Rosetta pLysS. Las condiciones de proceso optimizadas fueron 0,061% de concentración de glucosa, 1% de concentración de lactosa, una temperatura de incubación de 22 °C, una velocidad de agitación a 128 rpm y 30 h de fermentación. En condiciones óptimas, la expresión por inducción de lactosa se inició después de 16 h de fermentación. La máxima expresión, biomasa y actividad de BaCDA se registraron 14 h después de la inducción. En la condición optimizada, la actividad de BaCDA de BaCDA expresada se incrementó ~ 2,39 veces. La optimización del proceso redujo el ciclo total de fermentación en 22 h y el tiempo de expresión en 10 h después de la inducción. Este es el primer estudio que reporta la optimización del proceso de la expresión de la quitina desacetilasa recombinante utilizando un diseño compuesto central y su perfil cinético. La adaptación de estas condiciones óptimas de crecimiento podría dar lugar a una producción rentable y a gran escala de la moneran desacetilasa menos explorada, embarcándose en una ruta más ecológica para la producción de quitosano de grado biomédico.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La quitina, un polímero natural ligado a β estructural, 1-4 glucosídico, es el segundo polisacárido más abundante en la naturaleza después de la celulosa. A pesar de este hecho, la quitina tiene aplicaciones industriales limitadas debido a su insolubilidad1. Este cuello de botella se soluciona sometiendo la quitina a la N-desacetilación, que imparte una carga positiva y aumenta la solubilidad del polímero resultante, el quitosano1. La quitina se puede modificar a quitosano a través de dos rutas diferentes: química y enzimática. La aplicación biomédica del quitosano requiere una desacetilación controlada y definida, que está restringida en las rutas químicas 2,3. Esta limitación puede abordarse utilizando las quitina desacetilasas (CDAs), un enfoque enzimático verde para el proceso de desacetilación 4,5.

La quitina desacetilasa pertenece a la familia de los hidratos de carbono esterasa 4 (CE-4), definida en la base de datos de enzimas activas en carbohidratos (CAZY). Las enzimas de la familia CE-4 comparten la homología NodB o dominio de polisacárido desacetilasa como región conservada. El diseño compuesto central (CCD), una herramienta estadística, se utiliza para la optimización de varias enzimas modificadoras de quitina de tipo salvaje 6,7,8,9. Sin embargo, los pasos posteriores en el uso de organismos de tipo silvestre se vuelven tediosos, de ahí el cambio hacia las enzimas recombinantes 10,11,12,13,14,15,16,17. En los últimos años, los CDA halófilos recombinantes de origen marino han ganado importancia debido a su facilidad en la aplicación industrial y la producción de quitosano de grado biomédico18,19.

La producción de enzimas recombinantes en E. coli tiene una limitación en el proceso, y es necesaria la optimización de los medios, ya que su expresión en E. coli varía según el gen y el plásmido utilizado20. Por lo tanto, la detección de un proceso adecuado y los parámetros de nutrientes se vuelve importante. Un factor a la vez (OFAT), el método de optimización comúnmente empleado, requiere enormes recursos y tiempo para realizar experimentos paso a paso. Este método adolece de una falta de información estadística sobre la interacción entre los parámetros 20,21,22,23. Por lo tanto, se adoptó la metodología CCD de superficie de respuesta (RSM) para estudiar el rendimiento de la expresión de la quitina desacetilasa bacteriana halófila (BaCDA) y la actividad de BaCDA en E. coli Rosetta pLysS. Los parámetros considerados para la optimización de la expresión en el huésped de E. coli fueron la concentración de lactosa, la concentración de glucosa, la temperatura de incubación, la velocidad de agitación y el tiempo de incubación. En la mayoría de los estudios de expresión de E. coli, se utilizó Luria Bertani (LB) con isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) como inductor. Esta adición de IPTG requirió un seguimiento regular del crecimiento24. Estas mediaciones recurrentes durante el proceso fermentativo también abren vías para la contaminación. Por lo tanto, los grupos de investigación han cambiado a un caldo excelente (TB) con lactosa como inductor. La inclusión de lactosa en los medios de comunicación en lugar de IPTG aborda esta preocupación; E. coli consume esta lactosa y produce alolactosa como subproducto, lo que resulta en una condición de autoinducción. Este medio autoinductor incluye glicerol, que ha mostrado rendimientos mejorados de proteínarecombinante 25.  Esta sobreexpresión de proteínas recombinantes en medios de TB se mejoró aún más mediante la optimización de los parámetros del proceso. En el presente estudio, se aplicó un diseño compuesto central para optimizar la expresión heteróloga de BaCDA halófilo en células pLysS de E. coli Rosetta. Los parámetros de proceso elegidos fueron la temperatura de incubación, la velocidad de agitación y el tiempo de incubación, y los parámetros de nutrientes evaluados fueron la concentración de glucosa y lactosa. La expresión halófila de BaCDA se evaluó con la condición optimizada predicha y se validó de forma cruzada mediante SDS-PAGE.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Condición de los medios de expresión y la cultura

  1. Transformar el vector pET-22b que contiene el gen BaCDA en células competentes para E. coli Rosetta pLysS utilizando el método de choque térmico, como se describe en15.
    NOTA: Se debe tener cuidado al trabajar con microorganismos. Todos los trabajos microbiológicos deben realizarse dentro de una campana de bioseguridad para evitar la contaminación.
  2. Realizar el estudio preliminar de expresión en medios de TB que contengan 0,05% (p/v) de glucosa y 0,2% (p/v) de lactosa a 16 °C y 180 rpm. Cultive 6.792 x 107 células pLysS de E. coli Rosetta en 100 mL de medio que contenga plásmido clonado con BaCDA hasta que alcance la fase estacionaria. En las condiciones de crecimiento mencionadas, las células pLysS de E. coli Rosetta alcanzan una densidad óptica de 600 (OD600) de 10,85 ± 0,21. 
    NOTA: Composición de los medios de TB (% p/v): triptona, 1,2; extracto de levadura, 2,4; glicerol, 0,6; y 1x sal TB (17 mM KH2PO4 y 74 mM K2HPO4)17.

2. Optimización y diseño experimental

  1. Diseñar los experimentos y ajustar el modelo polinómico de segundo orden en el diseño compuesto central utilizando el software de herramientas estadísticas. El software estadístico utilizado en el presente estudio fue MINITAB 17.0 (versión de prueba).
    1. Para hacer esto, abra el software y haga clic en los siguientes botones: Estadística > DoE > Superficie de respuesta > Crear superficie de respuesta > Diseño de respuesta > Compuesto central. La salida aparece como un cuadro de diálogo.
  2. Alimente los cinco parámetros, temperatura de incubación, velocidad de agitación, tiempo de incubación, concentración de glucosa y concentración de lactosa, en cinco niveles (-2, -1, 0, +1, +2) en el cuadro de diálogo.
    1. Para ello, introduzca los parámetros con los niveles en el cuadro de diálogo, introduzca los detalles de todos los parámetros y pulse OK. Esto genera la matriz de diseño experimental con seis réplicas en el punto central, lo que requiere 32 corridas experimentales. El software genera una tabla que contiene los parámetros y sus niveles en términos codificados y no codificados, utilizados en la optimización del proceso utilizando CCD (Tabla 1).
  3. Realice los 32 experimentos con las condiciones generadas por software. Introduzca los resultados experimentales en la matriz de diseño experimental (generada por el software) que contiene niveles y parámetros en términos de unidades codificadas y no codificadas (Tabla 2).
  4. Analizar la matriz de diseño experimental (Tabla 2) utilizando el software. Para hacer esto, abra el software e introduzca la respuesta en la hoja de datos. Seleccione la columna Respuesta > Estadística > DoE > Superficie de respuesta > Analizar el diseño de la superficie de respuesta > Aceptar. El resultado se analiza para determinar la significación estadística y el software predice un modelo.

Tabla 1: Los parámetros y sus niveles en términos codificados y no codificados utilizados en el diseño experimental para estimar la expresión de quitina desacetilasa recombinante en células pLysS de E. coli Rosetta. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Matriz de diseño experimental con la actividad (expresión) experimental y predicha de BaCDA de la quitina desacetilasa recombinante en células pLysS de E. coli Rosetta. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

3. Validación del modelo

  1. Valide el modelo diseñado utilizando la herramienta de optimización de respuestas disponible en el software.
  2. Repita la fermentación en las condiciones óptimas predichas por el software y compare el valor experimental con el valor predicho por el software.
    1. Para ello, abra el software y seleccione la columna Respuesta > Superficie de estadísticas > DoE > Respuesta > Optimizador de respuesta > Maximizar > OK. El resultado son las condiciones óptimas del proceso y los valores predichos por el software. Repita la fermentación en las condiciones óptimas previstas y compare los valores.

4. Métodos analíticos

  1. Expresión, biomasa y cuantificación de proteínas
    1. Realizar la fermentación en 32 condiciones dadas por el software en la matriz de diseño experimental (Tabla 2). Obtener el pellet después de cada pasada centrifugando el cultivo a 5.405 x g durante 10 min a 4 °C. Pese el pellet de celda para determinar el rendimiento de biomasa.
      NOTA: Toda la manipulación microbiana debe realizarse en condiciones asépticas (es decir, dentro de cabinas de bioseguridad).
    2. Lisar el pellet celular para obtener la proteína periplásmica por sonicación. Añadir 5 mL de tampón de lisis (50 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl, 10 mM de Imidazol) a cada gramo de gránulo de célula e interrumpe sonicando durante 10 ciclos con un pulso de 10 s encendido y 10 s apagado al 60% de amplitud. Recoger el lisado centrifugando a 5.405 x g durante 10 min a 4 °C. Cuantificar la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford26.
      NOTA: Para evitar la desnaturalización de las proteínas, la sonicación debe realizarse en condiciones de frío. Coloque las muestras en hielo mientras realiza la sonicación.
    3. Analice la expresión BaCDA utilizando SDS-PAGE seguido del software ImageJ. Cargue 10 μL de lisado de células solubles (proteína periplásmica) en gel de bis-acrilamida al 12% y ejecute bajo 1x tampón de tris-glicina-SDS (TGS) a una corriente de 100 V durante 2 h. Una vez finalizada la carrera, tiñe el gel con azul Coomassie y detente a eliminar el fondo27.
    4. Capture una imagen utilizando una unidad de documentación de gel. Determine la expresión BaCDA comparando la intensidad de la banda en forma de los valores de píxel utilizando el software ImageJ. Considere la ejecución experimental con la menor actividad de BaCDA y biomasa como el píxel de referencia 28.
      1. Para hacer esto, abra el software y abra el archivo de imagen, luego seleccione cada carril usando el cuadro rectangular. Vaya a Analizar y establezca cada carril como 100%, luego seleccione la banda sobreexpresada en cada carril usando el cuadro rectangular. Vaya a Analizar y determine la intensidad de la banda, repita el proceso en cada carril y exporte el resultado como .xls archivo. Considere la intensidad de banda de la carrera experimental con la menor actividad BaCDA como intensidad de referencia y analice la expresión de cada carril.
  2. Ensayo de actividad enzimática
    1. Determine la actividad de BaCDA utilizando un kit de ensayo de acetato15, utilizando etilenglicol quitina (1 mg/mL; EGC) como sustrato29.
    2. Deje reaccionar 20 μL de BaCDA con 40 μL del sustrato en presencia de 40 μL de tampón Tris-HCl (pH 7) de 50 mM durante 1 h a 30 °C agitando a 800 rpm.
    3. Después de 1 h, centrifugar el reactivo de 100 μL a través de una columna de 3 kDa a 2.111 x g durante 15 min a 4 °C. Deseche el retenido que contiene BaCDA y recoja el filtrado que contiene acetato liberado durante la reacción. Utilice el filtrado para el ensayo de acetato para determinar la actividad de BaCDA.
      NOTA: Una unidad de la enzima se define como la actividad que libera 1 μM de acetato del sustrato por microlitro de enzima por minuto. El ensayo de actividad enzimática se llevó a cabo por triplicado y se calculó la actividad enzimática respectiva en consecuencia.
  3. Cinética de fermentación de la inducción de lactosa
    1. Investigue el perfil de actividad para determinar el punto de inducción de la lactosa y el punto de inicio de la expresión. El perfilado de la actividad se realiza mediante la estimación de la biomasa y la actividad de BaCDA con las condiciones de fermentación optimizadas.
    2. Determine la concentración de glucosa en los medios utilizando un kit de estimación de glucosa. Trazar el perfil de actividad utilizando la biomasa, la concentración de glucosa y la actividad de BaCDA frente al tiempo de fermentación.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optimización del proceso de expresión de la enzima recombinante periplásmica quitina desacetilasa en E. coli mediante diseño compuesto central (CCD)
El constructo pET22b-Ba CDA, cuando se cultivó en condiciones no optimizadas, dio un rendimiento máximo de biomasa y una actividad de BaCDA de 22.26 ± 0.98 g/L y 84.67 ± 0.56 U/L, respectivamente15. En el presente estudio, se adoptó un enfoque estadístico CCD para encontrar las condiciones óptimas de proc...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La quitina desacetilada, quitosano, tiene muchas aplicaciones, especialmente en el campo biomédico30. Sin embargo, la reproducibilidad del quitosano en cuanto a su grado de acetilación (DA) y patrón de acetilación (PA) es una preocupación importante, además de otras aprensiones ambientales. De este modo, se ha explotado la vía más verde, el uso de enzimas. El conjunto de CDAs puede emplearse para crear quitosano con un patrón único de desacetilación, lo que aumentaría sus aplicaciones biomédicas

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer a la Academia Manipal de Educación Superior (MAHE) por el fondo MAHE UNSW, y a los autores les gustaría agradecer al Consejo de Investigación Científica e Industrial - Grupo de Desarrollo de Recursos Humanos (CSIR-MHRD), Gobierno de la India por una beca de investigación senior, carta de adjudicación número 09/1165 (0007) 2K19 EMR-I con fecha 31.3.2019.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kits
glucosaAgappe diagnosis Ltd., India12018013El protocolo ha sido ligeramente modificado y optimizado para realizar el ensayo en placa
de 96 pocillosChemicals
Hi-media, IndiaAS001Se utiliza para preparar la solución de tinción y destaque SDS-PAGE
AcrilamidaHi-media, IndiaMB068Se utiliza para preparar el gel SDS-PAGE
Pursulfato de amonioHi-media, IndiaMB003Se utiliza para preparar el gel SDS-PAGE
Bis-acrilamidaHi-media, IndiaMB005Se utiliza para preparar el gel SDS-PAGE
Coomassie briliiant blue G-250Hi-media, IndiaMB092Se utiliza para preparar la solución de tinción y destaing SDS-PAGE
Coomassie briliiant blue R-250Hi-media, IndiaMB153Se utiliza para preparar el ensayo de Bardford
Etilenglicol quitosanoSigma-aldrich, EE. UUE1502Se utilizó para preparar quitina de etilenglicol y la quitina de etilenglicol se utilizó como sustrato para la reacción enzimática
D-glucosaHi-media, IndiaMB037Se utilizó como componente del medio.
ImidazolHi-media, IndiaGRM1864Utilizado en tampón de lisis
LactosaHi-media, IndiaGRM017Utilizado como componente de medio.
MetanolFinar, India30930LC250Utilizado para preparar la solución de tinción y destaque SDS-PAGE
Cloruro de sodio (NaCl)Hi-media, IndiaMB023Utilizado en tampón de lisis
Ácido fosfóricoHi-media, IndiaMB157Utilizado para preparar el ensayo de Bardford,
dodecil sulfato de sodio (SDS)Hi-media, IndiaGRM6218Utilizado para preparar el gel SDS-PAGE
Fosfato de sodio dibásico anhidroHi-media, IndiaMB024Se utiliza para preparar sald de TB para medios y tampón para reacción enzimática.
Fosfato de sodio monobásico anhidroHi-media, IndiaGRM3964Se utiliza para preparar sald de TB para medios y tampón para reacción enzimática.
Tetrametiletilendiamina (TEMED)Hi-media, IndiaMB026Utilizado para la preparación de gel SDS-PAGE
Tris baseHi-media, IndiaMB029Utilizado para la preparación de gel SDS-PAGE
TriptonaHi-media, IndiaRM7707Utilizado como componente de medios.
Extractode levadura Hi-media, IndiaRM027Se utiliza como componente de medios.
Equipment
AlphaImager Unidad de documentación de gel HPProteinSimple, EE. UU.92-13823-00Se utiliza para capturar fotografías SDS-PAGE
Mezclador de sobremesaEppendorf, Alemania 9.776 660Se utiliza para mantener la reacción enzimática con un adaptador de 2 mL Agitador
de bioincubadoraTrishul instruments, India13410622Se utiliza para incubar cultivos bacterianos a diferentes temperaturas y RPM
BioespectrofotómetroEppendorf, Alemania 6135000009Se utiliza para tomar todas las lecturas espectroscópicas
Centrífuga de enfriamientoEppendorf, Alemania 5805000017Se utiliza para centrifugar el cultivo, el lisado y todos los demás protocolos de centrifugación
Baño secoLabnet International, EE. UU.S81522039Se utiliza para desnaturalizar muestras de proteínas para micropipetas SDS-PAGE
Eppendorf, Alemania 3123000900Utilizado a través del protocolo para mediciones de volumen
Rocker shakerTrishul instruments, India11770719Se utiliza para agitar el gel SDS-PAGE para teñir y decolorar
la unidad SDS-PAGEBio-Rad, EE. UU.1658001FCSe utiliza para fundir y ejecutar el gel SDS-PAGE
Ultra sonicatorSonics & Materials, Inc., EE. UU.VCX 130Se utiliza para lisar la célula bacteriana por ultrasonicación
Balanza de pesajeSartorius, AlemaniaBSA124 SSe utiliza para medir el peso en todo el protocolo
Devices
Nanosep Dispositivos centrífugos con membrana Omega (3 kDa)PALL life sciences, EE. UU.OD003C33Se utiliza para separar la enzima después del sustrato tratamiento
SoftwaresVersiondesarrollado en
MINITAB17.0  (Versión de prueba)  La Universidad Estatal de PensilvaniaUtilizado para diseñar el modelo experimental y analizar los datos
ImageJ1.53oNational Institutes of Health (NIH)Utilizado para analizar el nivel de expresión utilizando SDS-PAGE image
Plasmid
pET22b (+) DNA— NovagenMerck- Millipore, USA69744Almacenado en &-20 ° C
. coli fuerte>
Rosetta pLysS— NovagenMerck- Millipore, EE. UU70956Mantenido en Luria– Caldo Bertani (LB) que contiene 25% de glicerol en &menos; 80 ° C
Acetato kit de ensayo Megazyme, Irlanda K-ACETAK El protocolo ha sido ligeramente modificado y optimizado para realizar el ensayo en placa de 96 pocillos Kit de estimación de . .

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