Determinación de la eficiencia de apareamiento de haploides en Saccharomyces cerevisiae

Summary

En este trabajo, se describe un método robusto para la cuantificación de la eficiencia de apareamiento en la levadura Saccharomyces cerevisiae . Este método es particularmente útil para la cuantificación de barreras precigóticas en estudios de especiación.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae es un organismo modelo ampliamente utilizado en genética, evolución y biología molecular. En los últimos años, también se ha convertido en un organismo modelo popular para estudiar problemas relacionados con la especiación. El ciclo de vida de la levadura implica fases reproductivas asexuales y sexuales. La facilidad para realizar experimentos de evolución y el corto tiempo de generación del organismo permiten el estudio de la evolución de las barreras reproductivas. La eficiencia con la que los dos tipos de acoplamiento (a y α) se acoplan para formar el diploide a/α se conoce como eficiencia de acoplamiento. Cualquier disminución en la eficiencia de apareamiento entre haploides indica una barrera precigótica. Por lo tanto, para cuantificar el grado de aislamiento reproductivo entre dos haploides, se requiere un método robusto para cuantificar la eficiencia de apareamiento. Con este fin, se presenta aquí un protocolo simple y altamente reproducible. El protocolo implica cuatro pasos principales, que incluyen parchear los haploides en una placa YPD, mezclar los haploides en números iguales, diluir y chapar para colonias individuales y, finalmente, calcular la eficiencia basada en el número de colonias en una placa de abandono. Los marcadores auxotrofos se emplean para hacer claramente la distinción entre haploides y diploides.

Introduction

Saccharomyces cerevisiae, comúnmente llamada levadura en ciernes, es un eucariota unicelular. Tiene dos tipos de apareamiento, a y α, y exhibe ciclos reproductivos asexuales y sexuales. Los tipos de apareamiento a y α son haploides y pueden dividirse mitóticamente en ausencia del otro tipo de apareamiento en el entorno circundante, que representa el ciclo asexual de la levadura. Cuando los dos tipos de apareamiento están muy cerca, dejan de dividirse mitóticamente y se fusionan para formar una célula diploide. La levadura diploide puede dividirse mitóticamente cuando los nutrientes están pres....

Protocol

NOTA: El protocolo implica ampliamente los siguientes pasos: (1) parchear los haploides en las rejillas de eficiencia de apareamiento en una placa YPD, (2) mezclar los haploides en números iguales después de 24 h de incubación y dar a los haploides mixtos unas horas para aparearse (7 h en este estudio), (3) colocar las células mixtas en YPD para aislar colonias individuales después de 7 h a 30 ° C, y finalmente, (4) determinar el número de diploides formados utilizando los marcadores auxotróficos. Estos pasos se describen en detalle a continuación (consulte también la figura 2).

1. Parcheo de haploides e....

Results

Cuantificación de la eficiencia de apareamiento de los dos tipos de apareamiento
El protocolo descrito aquí se utilizó para cuantificar la eficiencia de apareamiento entre dos cepas de levadura, entre SK1AM a y SK1AM α y entre ScAMa y ScAMα (Figura 3A). En estos experimentos, el apareamiento entre los dos haploides se repitió al menos 12 veces. En cada una de las repeticiones del experimento, al menos 100.......

Discussion

La cuantificación de la eficiencia de apareamiento en S. cerevisiae es esencial para llevar a cabo estudios relacionados con los genes implicados en las vías de apareamiento o estudiar la influencia del medio externo en el comportamiento de apareamiento. En las últimas dos décadas, S. cerevisiae también se ha convertido en un modelo popular para abordar cuestiones relacionadas con la especiación 14,36,37,38.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenina	Sigma Life Science	A8626
Polvo de agar de grado regular para bacteriología	SRL	19661 (0140186)
Sulfato de amonio, Hi-AR	HiMedia	GRM1273
D-(+)-glucosa	Sigma Life Science	G8270
Placas de Petri de vidrio	HiMedia	PW008	Dimensiones de 90 mm x 15 mm
L-Arginina	Sigma Life Science	A8094
Ácido L-aspártico	Sigma Life Science	A7219
L-Histidina monocloruro monohidrato	Sigma Life Science	H5659
L-Isoleucina	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucina	Sigma Life Science	L8912
L-Lisina	Aldrich	62840
L-metionina	Sigma Ciencias de la Vida	M5308
L-fenilalanina	Sigma Ciencias de la Vida	P5482
L-Treonina	Sigma Aldrich	T8625
L-Tirosina	Sigma Ciencias de la Vida	T8566
L-Valina	Sigma Ciencias de la Vida	V0513
Apareamiento Rejilla de eficiencia	1 cm x 1,5 cm Rejilla rectangular dibujada en la placa de Petri
	BD Difco	233520