Aplicación de la vermimetría de flujo para la cuantificación y el análisis del microbioma intestinal de Caenorhabditis elegans

Summary

Caenorhabditis elegans es un modelo poderoso para examinar los determinantes moleculares que impulsan las interacciones entre el huésped y el microbioma. Presentamos una línea de alto rendimiento que perfila los niveles de colonización del microbioma intestinal de un solo animal junto con aspectos clave de la fisiología de C. elegans.

Abstract

La composición del microbioma intestinal puede tener un impacto dramático en la fisiología del huésped a lo largo del desarrollo y la vida del animal. La medición de los cambios en la composición del microbioma es crucial para identificar las relaciones funcionales entre estos cambios fisiológicos. Caenorhabditis elegans ha surgido como un poderoso sistema huésped para examinar los impulsores moleculares de las interacciones huésped-microbioma. Con su plan corporal transparente y sus microbios naturales marcados con fluorescente, los niveles relativos de microbios dentro del microbioma intestinal de un animal individual de C. elegans se pueden cuantificar fácilmente utilizando un clasificador de partículas grandes. Aquí describimos los procedimientos para la configuración experimental de un microbioma, la recolección y el análisis de las poblaciones de C. elegans en la etapa de vida deseada, la operación y el mantenimiento del clasificador, y los análisis estadísticos de los conjuntos de datos resultantes. También discutimos las consideraciones para optimizar la configuración del clasificador en función de los microbios de interés, el desarrollo de estrategias efectivas de compuerta para las etapas de vida de C. elegans y cómo utilizar las capacidades del clasificador para enriquecer las poblaciones de animales en función de la composición del microbioma intestinal. Como parte del protocolo, se presentarán ejemplos de posibles aplicaciones, incluido el potencial de escalabilidad a aplicaciones de alto rendimiento.

Introduction

La evolución animal está sometida a una constante influencia microbiana¹. A partir de diversos microbios en el medio ambiente, los huéspedes animales adquieren socios específicos² que amplían las capacidades del huésped e impulsan su fisiología y susceptibilidad a las enfermedades³. Por ejemplo, los análisis metagenómicos del microbioma intestinal revelaron clases metabólicas enriquecidas de genes microbianos que pueden conferir una mayor recolección y almacenamiento de energía en ratones obesos⁴, muchos de los cuales también se encuentran en el microb....

Protocol

1. Preparación de la mezcla de microbioma

1. Estampe o elimine las bacterias de un caldo de glicerol congelador en una placa de caldo de lisogenia (LB) o en un medio de cultivo apropiado, y crezca durante la noche a una temperatura óptima basada en las cepas bacterianas de interés (generalmente 25 ° C para los microbios naturales de C. elegans ).
2. A partir de la placa LB, utilice una sola colonia de cada aislado bacteriano (p. ej., 12 bacterias de la colección CeMbio) para inocular 800 μL de medio LB en pocillos separados de una placa de pocillos profundos de 1 mL. Incubar durante la noche a la temperatura óptima con agitación....

Results

Definición de las puertas de la población de adultos y larvas
Aquí, las L1 sincronizadas de C. elegans se cultivaron en una placa NGM sembrada con E. coli OP50 (Eco), una dieta estándar de laboratorio. Las poblaciones de C. elegans se colectaron para el análisis de LPS después de 96 h o 120 h de crecimiento a 20 °C (Figura 2A). Un diagrama de puntos de extinción (EXT, un indicador de la densidad corporal) frente al tiempo de vuelo (TOF, un indic.......

Discussion

La vermimetría de flujo se ha utilizado para caracterizar los genes y las vías de C. elegans contra la colonización y toxicidad de patógenos en varios estudios^21,22. Aquí, se presenta un enfoque de alto rendimiento que utiliza C. elegans para investigar cómo los microbiomas intestinales modulan la fisiología de su huésped. En comparación con los métodos existentes que utilizan unidades formadoras de colonias (UFC) o secuenciación de amplicones d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de centrífuga de fondo cónico de 15 mL VWR		10026-076
96 placas de pocillos profundos (1 mL)	Axygen	P-DW-11-C
96 placas de pocillos profundos (2 mL)	Axygen	P-DW-20-C
Placa Costar de 96 pocillos	Agar Corning	3694
Millipore Sigma		El agar bacteriología estándar también es suficiente.
Colector de aspiración	V& P scientific	VP1171A
Bleach	Clorox
Bleach solution			Mezcle lejía con 5M Hipoclorito de sodio 2:1 (v/v)
Lector multimodo de imágenes celulares	Biotek	Cytation 5	Medición de OD bacteriano
Centrífuga	Thermo scientific	Sorvall Legend XTR	para placa de 96 pocillos y tubos cónicos
Microscopio fluorescente	Nikon	TiE
ggplot: Varias herramientas de programación R para trazar datos.	Paquete R	Versión 3.3.2
Muestreador automático de partículas grandes	Union Biometrica	LP Sampler
Clasificador de partículas grandes	Union Biometrica	COPAS Biosorter
Levamisole	Fisher	AC187870100
Caldo de lisogenia (LB)	RPI	L24066	Las recetas caseras estándar de LB que utilizan bacto-triptona, extracto de levadura y NaCl también son suficiente.
Solución M9			22 mM KH2PO4 monobásico, 42,3 mM Na2HPO4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematodo	RPI	N81800-1000.0	1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 añadido después del autoclave.
RStudio	GNU	Versión 1.3.1093
Hipoclorito de sodio	Sigma-Aldrich		5M NaOH
Microscopio estereoscópico	Nikon	SMZ745
Placas de Petri estériles de 10 cm de diámetro	Corning	351029
Placas estériles de 12 pocillos	VWR	10062-894
Placas estériles de 24 pocillos	VWR	10062-896
Placas de Petri estériles de 6 cm de diámetro	Corning	351007
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787