Artículo de método

Generación de un modelo de tiroiditis autoinmune espontánea en ratones

DOI:

10.3791/64609

⸱

17 de marzo de 2023

 ,  ,  ,  , 
1Thyroid and Parathyroid Surgery Center, West China Hospital of Sichuan University, 2The Laboratory of Thyroid and Parathyroid Disease, West China Hospital of Sichuan University, 3State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University and Collaborative Innovation Center

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Aviso de erratum

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Resumen

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Se han establecido varios tipos de modelos animales de tiroiditis de Hashimoto, al igual que la tiroiditis autoinmune espontánea en el ratón NOD. Los ratones H-2h4 son un modelo simple y confiable para la inducción de HT. Este artículo describe este enfoque y evalúa el proceso patológico para una mejor comprensión del modelo murino SAT.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En los últimos años, la tiroiditis de Hashimoto (TH) se ha convertido en la enfermedad tiroidea autoinmune más común. Se caracteriza por la infiltración de linfocitos y la detección de autoanticuerpos séricos específicos. Aunque el mecanismo potencial aún no está claro, el riesgo de tiroiditis de Hashimoto está relacionado con factores genéticos y ambientales. En la actualidad, existen varios tipos de modelos de tiroiditis autoinmune, incluida la tiroiditis autoinmune experimental (EAT) y la tiroiditis autoinmune espontánea (SAT).

La EAT en ratones es un modelo común para la HTA, que se inmuniza con lipopolisacárido (LPS) combinado con tiroglobulina (Tg) o se complementa con adyuvante de Freund completo (CFA). El modelo de ratón EAT está ampliamente establecido en muchos tipos de ratones. Sin embargo, es más probable que la progresión de la enfermedad esté asociada con la respuesta de anticuerpos Tg, que puede variar en diferentes experimentos.

SAT también es ampliamente utilizado en el estudio de HTA en la NOD. Ratón H-2H4. El NOD. El ratón H2h4 es una nueva cepa obtenida del cruce del ratón diabético no obeso (NOD) con el B10. A(4R), que se induce significativamente para TH con o sin yodo de alimentación. Durante la inducción, el NOD. El ratón H-2h4 tiene un alto nivel de TgAb acompañado de infiltración de linfocitos en el tejido folicular tiroideo. Sin embargo, para este tipo de modelo de ratón, hay pocos estudios para evaluar exhaustivamente el proceso patológico durante la inducción de yodo.

En este estudio se establece un modelo de ratón SAT para la investigación de HT, y el proceso de cambio patológico se evalúa después de un largo período de inducción de yodo. A través de este modelo, los investigadores pueden comprender mejor el desarrollo patológico de la TH y detectar nuevos métodos de tratamiento para la HTA.

Introducción

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La tiroiditis de Hashimoto (TH), también conocida como tiroiditis linfocítica crónica o tiroiditis autoinmune, se informó por primera vez en 19121. La TH se caracteriza por infiltración de linfocitos y daño al tejido folicular tiroideo. Las pruebas de laboratorio se manifiestan principalmente como un aumento de los anticuerpos específicos de la tiroides, incluidos los anticuerpos antitiroglobulina (TgAb) y los anticuerpos antioxidasa antitiroidea (TPOAb)2. La incidencia de HTA está en el rango de 0,4%-1,5%, representando 20%-25% de todas las enfermedades tiroideas, y este valor ha aumentado en los últimos años3. Además, un gran número de estudios han reportado que la TH se asocia con la oncogénesis y recurrencia del carcinoma papilar de tiroides (PTC)4,5; Los posibles mecanismos siguen siendo controvertidos. La tiroiditis autoinmune también es un factor importante en la infertilidad femenina6. Por lo tanto, la patogénesis de la HTA debe ser clara, para lo cual es esencial un modelo animal estable y simple.

Para estudiar la etiología de la HTA, se han empleado dos tipos principales de modelos murinos, incluyendo la tiroiditis autoinmune experimental (EAT) y la tiroiditis autoinmune espontánea (SAT) en los presentes estudios 7,8. Los ratones susceptibles fueron inmunizados con antígenos tiroideos específicos (incluyendo la tiroides cruda, tiroglobulina purificada [TG], peroxidasa tiroidea [TPO], ectodominio TPO recombinante y péptidos TPO seleccionados) para establecer el modelo murino EAT. Además, los adyuvantes, incluyendo lipopolisacárido (LPS), adyuvante completo de Freund (CFA) y otros adyuvantes inusuales, también se utilizan durante la inmunización para descomponer la tolerancia inmune 9,10,11,12,13,14,15,16,17.

El modelo SAT es un modelo importante para estudiar el desarrollo espontáneo de tiroiditis autoinmune, que se basa en NOD. Ratones H-2H4. El NOD. El ratón H-2h4 es una nueva cepa obtenida del cruce de NOD y B10. Ratones A(4R), seguidos de múltiples retrocruces a NOD, con el gen de susceptibilidad a la tiroiditis autoinmune IAk18,19. CABECEO. Los ratones H-2h4 no desarrollan diabetes, pero tienen una alta incidencia de tiroiditis autoinmune y síndrome de Sjogren (SS)19. Los estudios han encontrado que la molécula de adhesión intracelular-1 (ICAM-1) está altamente expresada en el tejido tiroideo de NOD. Ratones H-2h4 a las 3-4 semanas de edad. Además, con el aumento de la ingesta de yodo, se mejora la inmunogenicidad de la molécula de tiroglobulina, lo que regula aún más la expresión de ICAM-1, que desempeña un papel importante en el proceso de infiltración de monocitos21. Este modelo simula el proceso autoinmune mientras verifica la relación entre la dosis de yodo y la gravedad de la enfermedad. El método establecido es estable, con una alta probabilidad de éxito. El modelo SAT se ha aplicado para inducir tiroiditis autoinmune durante muchos años y sigue siendo un método eficaz para estudiar la patogénesis de la tiroiditis autoinmune. Sin embargo, el método de construcción actual del modelo EAT es más complicado y costoso; Diferentes laboratorios utilizan diferentes métodos de inmunización y sitios de inyección. Además, los ratones con diferentes antecedentes genéticos tienen diferentes tasas de inducción, que necesitan más estudios para revelar el potente mecanismo.

Sin embargo, el desarrollo de tiroiditis en el modelo SAT se asocia con yoduro de sodio, dimorfismo sexual y condiciones de crianza. Para revelar el procedimiento apropiado de tiroiditis autoinmune en el modelo SAT, este artículo describió el método de inducción de tiroiditis autoinmune en diferentes condiciones. Además, permite el estudio de la patogénesis y el progreso inmunológico de la tiroiditis autoinmune en diferentes etapas de esta enfermedad.

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Protocolo

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El protocolo que se describe a continuación fue aprobado por las pautas de cuidado y uso establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Sichuan.

1. Preparación

  1. Aloje a todos los ratones en condiciones específicas libres de patógenos en ciclos de luz-oscuridad de 12 h (a partir de las 07:00 a.m. y 07:00 p.m., respectivamente). Mantener la temperatura ambiente a 22 °C. Cambie los materiales de la ropa de cama cada semana. Proporcione cantidades adecuadas de comida estándar para roedores y agua.
  2. Al preparar la solución madre de NaI en agua, pesar 2,5 g del compuesto y disolverla en 50 ml de agua pura estéril bajo vórtice para obtener una solución madre del 5%. Conservar esta solución madre en un congelador a 4 °C, evitando la luz, durante un máximo de 8 semanas.
  3. Para preparar una solución de trabajo de NaI, extraiga 2,5 ml de solución madre y disuélvala en 250 ml de agua regular como agua potable diaria para NOD. H-2h4, para dar una solución de trabajo de 0.05%.

2. Inducción de tiroiditis

  1. Modelo SAT
    1. Prepara el NOD. Ratones H-2h4 (8 semanas de edad) para el estudio alojando a todos los ratones de un solo sexo (sin dimorfismo sexual) en jaulas de barrera (cinco animales por jaula) con las condiciones de alimentación descritas en el paso 1.1.
    2. Para inducir tiroiditis autoinmune en NOD. Ratones H-2h4, alimenta a todos los ratones con 0.05% de NaI durante 8 semanas. Cambie el agua NaI cada semana y evalúe el estado de los ratones semanalmente, incluida la apariencia, el peso, el apetito, el estado mental y la movilidad.
  2. Modelo EAT
    1. Preparar los ratones BALB/c (8 semanas de edad) para el estudio alojando a todos los ratones de un solo sexo (sin dimorfismo sexual) en jaulas de barrera (cinco animales por jaula) con las condiciones de alimentación descritas en el paso 1.1. Alimente a todos los ratones con NaI al 0,05% durante 8 semanas.
    2. Durante las primeras 2 semanas, inyecte por vía subcutánea una mezcla de CFA y Tg (200 μL) una vez a la semana.
    3. A partir de la tercera semana, inyecte por vía subcutánea una mezcla de IFA y Tg (200 μL) una vez a la semana durante 3 semanas.

3. Mediciones

  1. Preparación de muestras de sangre periférica
    1. Después de la inducción, anestesiar a los ratones con un volumen de 0,01 mL/g de anestésico mediante inyección intraperitoneal. Prepare el anestésico mezclando midazolam (40 μg/100 μL para sedación), medetomidina (7,5 μg/100 μL para sedación) y tartrato de butorfanol (50 μg/100 μL para analgesia) en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
      NOTA: Las concentraciones específicas de cada componente en la mezcla de anestesia son: midazolam 13.33μg/100μL, medetomidina 2.5μg/100μL y butorfanol 16.7μg/100μL. Para dosis específicas utilizadas en ratones, las dosis son: midazolam 4μg / g, medetomidina 0.75μg / g y butorfanol 1.67μg / g. La profundidad de la anestesia se confirmó cuando los músculos de las extremidades del ratón se relajaron, los bigotes no tuvieron respuesta táctil y hubo pérdida del reflejo pedal.
    2. Después de anestesiar a los ratones, prepare las muestras de sangre periférica, fijando el ratón con una mano y presionando la piel del ojo para que sobresalga el globo ocular. Luego, inserte el tubo capilar en la esquina interna del ojo y penetre en un ángulo de 30-45 grados con respecto al plano de la fosa nasal. Aplique presión mientras gira suavemente el tubo capilar. La sangre fluirá hacia el tubo a través de la acción capilar.
    3. Introducir la sangre en nevera a 4 °C durante 2 h y, a continuación, centrifugar a 1.000 × g durante 10 min a 4 °C para obtener la muestra. Para un análisis más detallado, almacenar el resto de la muestra a -80 °C.
  2. Preparación de muestras de tejido tiroideo
    1. Sacrificar humanamente al animal de acuerdo con las políticas institucionales. Luego, disecciona la pared torácica para exponer el corazón, abre la aurícula derecha e infunde solución salina en el ventrículo izquierdo con una aguja de infusión intravenosa conectada a una jeringa de 20 ml hasta que el tejido se vuelva blanco.
    2. Fije el ratón en la tabla de disección con pines. Esterilizar el cuello con etanol al 75%. Corte la piel del ratón a lo largo de la línea mediana del cuello desde la parte superior del esternón hasta la mandíbula inferior con tijeras de tejido para exponer completamente el tejido del cuello.
    3. Observe el par de glándulas rosadas, las glándulas submandibulares, debajo de las cuales está el músculo de la tráquea anterior. Separe las glándulas y el músculo con tijeras oftálmicas y fórceps para exponer la tráquea y el cartílago tiroides.
    4. Separe el tejido debajo del cartílago, usando pinzas curvas para recoger el cartílago y la tráquea juntos. Cortar los extremos distal y proximal del cartílago y la tráquea, respectivamente, y extirpar la glándula tiroides junto con la tráquea.
    5. Sumergir las glándulas en paraformaldehído al 4% durante 12-24 h. Luego, transfiera el tejido al 70% de etanol.
    6. Coloque los lóbulos individuales del material de biopsia tiroidea en los casetes de procesamiento y deshidrate a través del siguiente gradiente de alcohol en serie: 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%, etanol durante 40 minutos cada uno; 1/2 xileno + 1/2 etanol absoluto durante 2 h; 100% xileno durante 1,5 h; 100% xileno durante 1,5 h; 1/2 xileno + 1/2 parafina durante 2 h; horno a 40 ° C durante 40 min; parafina I durante 30 min; y parafina II durante 30 min. Insértelos en bloques de cera de parafina.
    7. Antes de la tinción, desparafinar secciones de tejido tiroideo de 5 μm de espesor en xileno (como sigue) y rehidratar a través de las siguientes concentraciones decrecientes de etanol: xileno I durante 10 min; xileno II durante 10 min; xileno III durante 10 min; etanol absoluto I durante 5 min; etanol absoluto II durante 5 min; 90% de alcohol durante 5 min; 80% de alcohol durante 5 min; 70% de alcohol durante 5 min; y 50% de alcohol durante 5 min.
    8. Manchar los tejidos con hematoxilina y eosina (H&E). Manche con hematoxilina durante 15 minutos, enjuague con agua del grifo durante 15 minutos, agregue etanol de ácido clorhídrico al 1% durante 10 s, enjuague con agua corriente y luego con etanol al 50%, 70% y 80%, cada uno durante 3 minutos. Realice tinción de etanol de eosina al 0,5% durante 2 minutos y enjuague con agua corriente. Coloque las secciones de parafina sucesivamente en etanol al 75% durante 2 min, etanol al 85% durante 2 min, etanol absoluto durante 5 min y xileno durante 5 min. Fije las rodajas con goma neutra y portaobjetos de vidrio.
    9. Para evaluar la extensión de la tiroiditis linfocítica, puntúe las secciones tiroideas de la siguiente manera: 0: poca o ninguna infiltración de linfocitos en el tejido tiroideo; 1+: más de 1/8 de la glándula está infiltrada en uno o varios focos; 2+: no más de 1/4 de la glándula está infiltrada con linfocitos; 3+: 1/4-1/2 de la glándula está infiltrada con linfocitos; 4+: más de 1/2 de la glándula se destruye.
      NOTA: Se recomienda eliminar el cartílago tiroides para mantener toda la estructura de la tiroides del ratón, que es demasiado pequeña para eliminarla de la tráquea.
  3. Medición del TPOAb
    NOTA: Las células de ovario de hámster chino (CHO) que expresan de manera estable el TPO de ratón se establecieron en nuestro laboratorio. El ADNc TPO de ratón fue extirpado por XbaI y NheI. Luego, el ADNc se transfirió a pcDNA5 / FRT. Después de que el plásmido se construyó con éxito, se transfectó en las células CHO y se seleccionó con higromicina B (100 g / ml).
    1. Después de la construcción de las células mTPO-CHO, diluir los sueros de ratón del paso 3.1.3 (1:50) e incubar con las células mTPO-CHO durante 2 h. Después de la incubación, excluir la tinción celular con yoduro de propidio (1 g/ml) y analizar la muestra por citometría de flujo utilizando IgG de cabra anti-ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína, purificado por afinidad. Examinar las poblaciones unicelulares supervivientes mediante canales FSC-A y SSC-A y seleccionar células marcadas con FITC y PI de las poblaciones unicelulares21.
    2. Incluir el suero de ratones BALB/c o C57BL/6 no inmunizados unidos a IgG como control negativo. Incluir anticuerpos monoclonales de ratón contra TPO22 humano como controles positivos que reconocen TPO23 de ratón. Exprese los datos de enlace TPO como medios geométricos.
  4. Medición de TgAb
    NOTA: Utilice un kit ELISA para detectar tiroglobulina siguiendo las instrucciones del fabricante.
    1. Diluir las muestras estándar en el tubo de microcentrífuga de acuerdo con las instrucciones. Saque el kit del refrigerador y manténgalo a temperatura ambiente durante 30 minutos.
    2. Establezca los pozos estándar, los pozos en blanco y los pozos de prueba. Los pozos en blanco solo obtienen amortiguador, mientras que los pozos estándar obtienen soluciones estándar. Agregue 10 μL de muestras en los pocillos de prueba. Al agregar las muestras, trate de no tocar las paredes de los pozos y agite la placa suavemente para mover las muestras al fondo de los pozos.
    3. Incluya suero de ratones BALB/c inmunizados con Tg, CFA e IFA24 como control positivo y suero de NOD de 8 semanas de edad. Ratones H-2h4 en agua regular como control negativo.
    4. Incubar las muestras en un baño maría a 37 °C durante 30 min. Diluir el tampón de lavado con agua destilada en una proporción de 1:30. Luego, retire la película de sellado, sacuda el líquido dentro de la placa de enzimas y seque con palmaditas en papel absorbente, y agregue 350 μL de tampón de lavado durante 30 s. Repita este procedimiento cinco veces y luego seque los pozos.
    5. Agregue 50 μL de reactivo de marcado enzimático a cada pocillo, excepto los pocillos en blanco, e incube en un baño de agua de 37 ° durante 30 min. Retire la película de sellado, sacuda el líquido dentro de la placa de enzimas y séquelo con papel absorbente.
    6. Agregue 50 μL de revelador A a cada pocillo seguido de 50 μL de revelador B y agite suavemente los pocillos para mezclar durante 5 minutos. Agregue 50 μL de la solución de terminación en cada pocillo durante 15 minutos para detener la reacción. Mida la absorbancia (OD) de cada pocillo a una longitud de onda de 450 nm utilizando un lector de microplacas. Presente los datos de TgAb como densidad óptica (OD) a 490 nm.
  5. Medición de T4 y hormona estimulante de la tiroides (TSH)
    NOTA: Mida los niveles de T4 y TSH (en alícuotas de 10 μL) mediante ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante.
    1. Diluir el conjugado enzimático a 1:11 con el diluyente del ensayo; diluir las muestras a medir (1:100) utilizando 0,01 M PBS.
    2. Añadir 10 μL del patrón y la muestra a los pocillos correspondientes, añadir 100 μL de enzima conjugada a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
    3. Deseche el líquido en los pozos y límpielo con tampón de lavado tres veces.
    4. Añadir 100 μL de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) e incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
    5. Añadir 50 μL de solución de parada y mezclar suavemente durante 15-20 s.
    6. Determine la absorbancia (OD) utilizando un lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm y calcule la concentración de la muestra.
    7. Utilice software estadístico para realizar la prueba t o la prueba de suma de rangos y trace los resultados.

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Resultados

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Los cambios histológicos fueron sorprendentemente diferentes en mujeres y hombres, la duración de la ingesta de yodo y la solución de NaI. Como se muestra en la Figura 1, ~10% de NOD. Los ratones H-2h4 desarrollaron SAT incluso sin inducción de yodo a la edad de 24 semanas, y todos los ratones finalmente desarrollaron tiroiditis. Cuando se les administró agua regular, no hubo diferencias significativas en los cambios histológicos entre hombres y mujeres. La adición de NaI al agua potable ace...

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Discusión

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La TH ocurre debido a un trastorno del sistema autoinmune causado por linfocitos que se infiltran en la glándula tiroides, lo que afecta aún más la función tiroidea, al tiempo que produce anticuerpos específicos para la tiroides. Los niveles séricos de TSH, TgaB y TPOAb en pacientes con HTA están significativamente elevados27. En la actualidad, dos tipos principales de modelos murinos son ampliamente utilizados para estudiar la etiología de la tiroiditis autoinmune: EAT y SAT29

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Divulgaciones

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Todos los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

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Los anticuerpos monoclonales de ratón contra TPO humano (utilizados como controles positivos) fueron proporcionados por el Dr. P. Carayon y el Dr. J. Ruf (Marsella, Francia). Los autores agradecen a todos los participantes en este estudio y a los miembros de nuestro equipo de investigación. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Fondo de Sustentación Postdoctoral del Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan, China (2020HXBH057) y el Programa de Apoyo a la Ciencia y Tecnología de la Provincia de Sichuan (Proyecto No. 2021YFS0166)

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tartrato de butorfanolSupelcoL-044 
Clorhidrato de dexmedetomidina Sigma-Aldrich145108-58-3
Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) pozoSigma-AldrichM9410-1CS
Etanolmacklin64-17-5 
Freund' s Coadyuvante, Completo Sigma-AldrichF5881 
Freund' s Coadyuvante, Incompleto Sigma-AldrichF5506
Cabra anti-ratón IgG invitrogenSA5-10275 
Solución de midazolam SupelcoM-908 
Tiroxina de ratón/rata (T4) ELISACalbiotechDKO045
Paraformaldehídomacklin30525-89-4 
Yoduro de propidioSigma-AldrichP4864
Yodo de sodioSigma-Aldrich 7681-82-5
TiroglobulinaSigma-Aldrich T1126
Tiroglobulina  Kit ELISAThermo ScientificEHTGX5
TSH ELISACalbiotechDKO200
Xilenomacklin1330-20-7

Referencias

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  30. Carayanniotis, G. Molecular parameters linking thyroglobulin iodination with autoimmune thyroiditis. Hormones. 10 (1), 27-35 (2011).
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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model
Posted by JoVE Editors on 6/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. The Protocol section was updated.

Step 3.1.1 of the Protocol was updated from:

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).

to

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).
NOTE: The specific concentrations of each component in the anesthesia mixture are: midazolam 13.33µg/100µL, medetomidine 2.5µg/100µL, and butorphanol 16.7µg/100µL. For specific dosages used in mice, the doses are: midazolam 4µg/g, medetomidine 0.75µg/g, and butorphanol 1.67µg/g. Anesthesia depth was confirmed when the mouse's limb muscles relaxed, the whiskers had no touch response, and there was loss of  pedal reflex.

Step 3.1.2 of the Protocol was updated from:

After the mice are anesthetized, cut off their whiskers with ophthalmic scissors to prevent blood from flowing down the whiskers and causing hemolysis. Fix the mouse with one hand and press the skin of the eye to make the eyeball protrude. Quickly remove the eyeball and draw 1 mL of blood into the microcentrifuge tube via a capillary tube.

to

After the mice are anesthetized, prepare the peripheral blood samples, by fixing the mouse with one hand and pressing the eye skin to protrude the eyeball. Then, insert the capillary tube into the inner corner of the eye and penetrate at a 30-45 degree angle to the plane of the nostril. Apply pressure while gently rotating the capillary tube. Blood will flow into the tube via capillary action.

Step 3.2.1 of the Protocol was updated from:

Dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

to

Humanely euthanize the animal according to the institutional policies. Then, dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

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Tiroiditis de Hashimotomodelo rat nrat n NOD H 2h4inducci n con yodoanticuerpo contra la tiroglobulinaanticuerpo contra la peroxidasa tiroideainfiltraci n linfocitariaaislamiento de tejido tiroideo

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