Este protocolo discute un enfoque para generar organoides epiteliales a partir de tejido mamario primario normal y tumoral a través de centrifugación diferencial. Además, se incluyen instrucciones para el cultivo tridimensional, así como imágenes inmunofluorescentes de organoides incrustados.
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Artículo de método
Generación y obtención de imágenes de organoides epiteliales humanos y de ratón a partir de tejido mamario normal y tumoral sin pasar
En este artículo
Resumen
Resumen
Los organoides son un método confiable para modelar el tejido orgánico debido a sus propiedades de autoorganización y retención de la función y la arquitectura después de la propagación a partir de tejido primario o células madre. Este método de generación de organoides renuncia a la diferenciación unicelular a través de múltiples pasajes y en su lugar utiliza la centrifugación diferencial para aislar organoides epiteliales mamarios de tejidos disociados mecánica y enzimáticamente. Este protocolo proporciona una técnica simplificada para producir rápidamente organoides epiteliales pequeños y grandes a partir de tejido mamario humano y de ratón, además de técnicas para la incrustación de organoides en colágeno y matriz extracelular basal. Además, se proporcionan instrucciones para la fijación en gel y la tinción inmunofluorescente con el fin de visualizar la morfología y densidad de los organoides. Estas metodologías son adecuadas para innumerables análisis posteriores, como el cocultivo con células inmunes y el modelado de metástasis ex vivo a través del ensayo de invasión de colágeno. Estos análisis sirven para dilucidar mejor el comportamiento célula-célula y crear una comprensión más completa de las interacciones dentro del microambiente tumoral.
Introducción
La capacidad de modelar células epiteliales in vitro ha sido la base de la investigación biomédica moderna porque captura características celulares que no son accesibles in vivo. Por ejemplo, el crecimiento de líneas celulares epiteliales en un plano bidimensional puede proporcionar una evaluación de los cambios moleculares que ocurren en una célula epitelial durante la proliferación1. Además, la medición de la regulación dinámica entre la señalización y la expresión génica está limitada en los sistemas in vivo 2. En la investigación del cáncer, el modelado de la línea celular epitelial del cán....
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Protocolo
Todo el tejido de ratón utilizado en este manuscrito ha sido recolectado éticamente de acuerdo con las regulaciones y pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas. Del mismo modo, todos los pacientes dieron su consentimiento antes de la donación de tejidos bajo la supervisión de una Junta de Revisión Institucional (IRB), y las muestras fueron desidentificadas.
NOTA: Este protocolo describe la generación de organoides a partir de tejido primario.
1. Preparación nocturna de los materiales
- Para incrustar en l....
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Resultados
Las imágenes presentadas en la Figura 1 proporcionan un ejemplo de organoides epiteliales mamarios de tipo salvaje y tumorales de tejidos humanos y de ratón. Una ilustración de un vistazo del método para aislar organoides epiteliales a través de centrifugación diferencial se proporciona en el flujo de trabajo de dibujos animados en la Figura 1A, que muestra que los tejidos primarios de diferentes especies pueden procesarse de maneras casi idénticas mientras prod.......
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Discusión
Se han descrito diferentes métodos en la literatura para generar organoides tumorales. Este protocolo destaca un método para generar organoides tumorales directamente del tumor sin pasar. Utilizando este método, los organoides tumorales son producibles a las pocas horas de iniciar el procedimiento y generan organoides cerca del 100% viables en comparación con el 70% reportado en la literatura31. En comparación, otros métodos requieren el paso en serie de células a organoides durante varias semanas.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por fondos proporcionados por METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa's Research Foundation y el NCI/UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Reconocemos la asistencia del recurso compartido de manejo de tejidos del suroeste de la Universidad de Texas, un recurso compartido en el Simmons Comprehensive Cancer Center, que cuenta con el apoyo parcial del Instituto Nacional del Cáncer bajo el número de premio P30 CA142543. Un agradecimiento especial a todos los miembros del Chan Lab.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10 mM Tampón HEPES | Gibco | ||
| 100x Antibiótico-Antimicótico | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Tecnologías de Vida Glutamax | 35050-061 Suplemento de | glutamina | |
| 100x Insulina-Transferrina-Selenio (ITS) | Tecnologías de la Vida | 51500-056 | |
| 100x Penicilina/Estreptomicina (Pluma/Estreptococo) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0,2 y micro; matraz filtrante m | Fisher | #564-0020 | |
| Anfotericina B | Tecnologías de la Vida | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| Solución BSA (32%) | Sigma | ||
| Toxina del cólera | Sigma | C8052 | |
| CO2 medio independiente | Gibco | 18045-088 | |
| Colagenasa A | Sigma | C2139 | |
| Desoxirribonucleasa I de páncreas bovino (DNasa) | Sigma | D4263 | |
| DMEM con 4500 mg/L de glucosa, piruvato de sodio y bicarbonato de sodio, sin L-glutamina, líquido, filtrado estéril, apto para cultivo celular | Sigma | D6546 | Medio basal común |
| D-MEM/F12 | Tecnologías de la Vida | #10565-018 | Medio de células basales |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Suero fetal bovino (FBS) | Sigma | ||
| Gentamicina | Tecnologías de la Vida | #15750-060 | |
| Factor de crecimiento epidérmico humano (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hidrocortisona | Sigma | H0396 | |
| Insulina | Sigma | ||
| Matrigel | Corning | #354230 | Matriz extracelular basal (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Cola de Rata Colágeno I | Corning | ||
| medios RPMI-1640 | Fisher | ||
| Tripsina | Tecnologías de la Vida | 27250-018 |
Referencias
- Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Fron....
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Reimpresiones y permisos
