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Summary

Este protocolo discute un enfoque para generar organoides epiteliales a partir de tejido mamario primario normal y tumoral a través de centrifugación diferencial. Además, se incluyen instrucciones para el cultivo tridimensional, así como imágenes inmunofluorescentes de organoides incrustados.

Abstract

Los organoides son un método confiable para modelar el tejido orgánico debido a sus propiedades de autoorganización y retención de la función y la arquitectura después de la propagación a partir de tejido primario o células madre. Este método de generación de organoides renuncia a la diferenciación unicelular a través de múltiples pasajes y en su lugar utiliza la centrifugación diferencial para aislar organoides epiteliales mamarios de tejidos disociados mecánica y enzimáticamente. Este protocolo proporciona una técnica simplificada para producir rápidamente organoides epiteliales pequeños y grandes a partir de tejido mamario humano y de ratón, además de técnicas para la incrustación de organoides en colágeno y matriz extracelular basal. Además, se proporcionan instrucciones para la fijación en gel y la tinción inmunofluorescente con el fin de visualizar la morfología y densidad de los organoides. Estas metodologías son adecuadas para innumerables análisis posteriores, como el cocultivo con células inmunes y el modelado de metástasis ex vivo a través del ensayo de invasión de colágeno. Estos análisis sirven para dilucidar mejor el comportamiento célula-célula y crear una comprensión más completa de las interacciones dentro del microambiente tumoral.

Introduction

La capacidad de modelar células epiteliales in vitro ha sido la base de la investigación biomédica moderna porque captura características celulares que no son accesibles in vivo. Por ejemplo, el crecimiento de líneas celulares epiteliales en un plano bidimensional puede proporcionar una evaluación de los cambios moleculares que ocurren en una célula epitelial durante la proliferación¹. Además, la medición de la regulación dinámica entre la señalización y la expresión génica está limitada en los sistemas in vivo ². En la investigación del cáncer, el modelado de la línea celular epitelial del cáncer ha permitido la identificación de los impulsores moleculares de la progresión de la enfermedad y los posibles objetivos farmacológicos³. Sin embargo, el crecimiento de líneas celulares epiteliales de cáncer en un plano bidimensional tiene limitaciones, ya que la mayoría son genéticamente inmortalizadas y modificadas, a menudo de naturaleza clonal, seleccionadas por su capacidad para crecer en condiciones no fisiológicas, limitadas en su evaluación de la arquitectura tridimensional (3D) del tejido tumoral, y no modelan adecuadamente las interacciones del microambiente dentro de un entorno tisular realista⁴. Estas limitaciones son particularmente evidentes en el modelado de metástasis, que in vivo incluye varias etapas biológicas distintas, incluyendo invasión, diseminación, circulación y colonización en el sitio del órgano distante⁵.

Los organoides epiteliales del cáncer han sido desarrollados para recapitular mejor el ambiente 3D y el comportamiento de los tumores ^6,7,8. Los organoides se desarrollaron por primera vez a partir de células de cripta intestinal LRG5+ individuales y se diferenciaron para representar la estructura 3D de las unidades de cripta-vellosidades que mantenían la estructura jerárquica del intestino delgado in vitro⁹. Este enfoque permitió la visualización y caracterización en tiempo real de la arquitectura tisular autoorganizada en condiciones homeostáticas y de estrés. Como extensión natural, los organoides epiteliales del cáncer se desarrollaron para modelar muchos tipos diferentes de cáncer, incluidos los cánceres colorrectal 10, pancreático^{11, mama 12}, hígado 13, pulmón 14, cerebro 15 y gástrico ¹⁶. Los organoides epiteliales del cáncer han sido explotados para caracterizar la evolución del cáncer^17,18 y los comportamientos espaciotemporales metastásicos^19,20 e interrogar la heterogeneidad tumoral^21, y probar quimioterapias ²². Los organoides epiteliales del cáncer también se han aislado y recolectado durante ensayos clínicos en curso para predecir la respuesta del paciente a los agentes anticancerosos y la radioterapia ex vivo 8,23,24,25. Además, los sistemas que incorporan organoides epiteliales cancerosos pueden combinarse con otras células no cancerosas, como las células inmunes, para formar un modelo más completo del microambiente tumoral para visualizar las interacciones en tiempo real, descubrir cómo las células epiteliales cancerosas cambian la naturaleza fundamental de las células inmunes efectoras citotóxicas, como las células asesinas naturales, y probar posibles inmunoterapias y actividad citotóxica dependiente de anticuerpos^{26, 27,28}. Este artículo demuestra un método para generar organoides epiteliales sin pasar e incrustarse en colágeno y matriz extracelular basal (ECM). Además, también se comparten técnicas para obtener imágenes posteriores de organoides aislados.

Protocol

Todo el tejido de ratón utilizado en este manuscrito ha sido recolectado éticamente de acuerdo con las regulaciones y pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas. Del mismo modo, todos los pacientes dieron su consentimiento antes de la donación de tejidos bajo la supervisión de una Junta de Revisión Institucional (IRB), y las muestras fueron desidentificadas. NOTA: Este protocolo describe la generación de organoides a partir de tejido primario. 1. Preparación nocturna de los materiales Para incrustar en la matriz extracelular basal (BECM), descongelar la alícuota BECM dejándola a 4 °C. 2. Preparación de la solución de recubrimiento de colagenasa y albúmina sérica bovina (BSA) Preparar una solución de recubrimiento BSA/PBS al 2,64% (solución BSA): filtro estéril 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 4,10 ml de solución BSA al 30% utilizando un matraz filtrante de 50 ml/0,2 μm. Esta solución BSA se puede filtrar y utilizar de nuevo. Preparar solución de colagenasa para tejido mamario de ratón: filtro estéril 27 ml de medio de células basales, 1,5 ml de suero fetal bovino (FBS), 30 μL de 50 mg/ml de gentamicina, 15 μL de 10 mg/ml de insulina, 600 μL de 0,1 g/ml de colagenasa A y 600 μL de tripsina de 0,1 g/ml utilizando un matraz filtrante de 50 ml/0,2 μm. Asigne entre 10 ml y 30 ml de solución de colagenasa por ratón, dependiendo de la masa del tejido. Preparar solución de colagenasa para el tejido mamario humano: Filtro estéril 18 ml de RPMI-1640, 200 μL de solución de penicilina-estreptomicina 100x (pluma/estreptococo), 200 μL de 10 mM de tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES), 1 ml de FBS y 400 μL de 0,1 g/ml de colagenasa A con un matraz filtrante de 50 ml/0,2 μm. Asigne entre 10 ml y 20 ml por muestra de tejido, dependiendo de la masa tisular. 3. Preparación de los medios Preparar medios organoides: Medio de células basales de filtro estéril con 1% de pluma/estreptococo y 1% de insulina-transferrina-selenio (ITS) utilizando un matraz filtrante de 50 ml/0,2 μm. Para producir medios de factor de crecimiento organoide, agregue el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) a una concentración final de 2.5 nM. Preparar medios epiteliales mamarios: Para hacer 100 ml de medios epiteliales mamarios, filtro estéril de medio basal común de alta glucosa con 1 ml de suplemento de glutamina 100x, 1 ml de pluma/estreptococo, 1 ml de tampón HEPES de 10 mM (7.3 pH), 250 μL de stock de BSA al 30%, 1 μL de cepas de cólera de 1 mg/ml, 1 ml de stock de hidrocortisona de 50 μg/ml en PBS, 50 μL de solución de insulina humana de 10 mg/ml, 10 μL de cepa de factor de crecimiento epidérmico (EGF) de 50 μg/ml y FBS al 1% con un matraz filtrante de 150 ml/0,2 μm. Conservar el medio a 4 °C y utilizar durante un máximo de 2 semanas. Preparar el lavado de anfotericina: Filtro estéril PBS con 2% de pluma/estreptococo y 2% de anfotericina B. Conservar a 4 °C. 4. Recolectar y digerir tejidos Tejido mamario de ratónEutanasia al ratón colocándolo en una cámara deCO2 durante 2-5 minutos, y luego seguir con la dislocación cervical. Con el lado ventral hacia arriba, extienda las extremidades del ratón y use cuatro agujas de 19 G para sujetar el ratón por las patas a una tabla cubierta con una almohadilla absorbente. Rocíe con etanol al 70% para suavizar el pelaje y desinfectar la piel. Limpie las heces con una gasa o un pañuelo de papel. Comenzando justo por encima de la región anogenital, corte hacia arriba desde la línea media con tijeras quirúrgicas, teniendo cuidado de no perforar el peritoneo. Al llegar a la barbilla, haga cortes laterales por ambas clavículas y por las patas traseras, y fije la piel del ratón tensa a la tabla para exponer las almohadillas de grasa mamaria. Localice las almohadillas de grasa mamaria inguinal en ratones de tipo salvaje identificando el ganglio linfático inguinal ubicado cerca de las extremidades posteriores. Localice las almohadillas de grasa mamaria torácica en ratones de tipo salvaje como el tejido vascularizado más grueso debajo de las extremidades delanteras. Use fórceps para elevar la almohadilla de grasa mamaria. Evite acumular músculo subyacente. Usando el extremo romo de las tijeras afiladas, cree un bolsillo debajo de la almohadilla de grasa mamaria, lejos de la piel. Corte la almohadilla de grasa mamaria en una pieza completa. Una vez que se hayan retirado las almohadillas de grasa mamaria, enjuague en PBS antes de colocarlas en una placa de cultivo de tejido estéril. Transfiera rápidamente a una campana de cultivo de tejidos.NOTA: Para los tumores mamarios, use un hisopo de algodón humedecido con PBS para alejar suavemente el tumor de la piel. Asegúrese de evitar las áreas oscuras o blandas, ya que la decoloración oscura indica necrosis, que no producirá organoides saludables. Picar los tumores mamarios con un bisturí # 10 o # 11 para aflojar el tejido hasta que alcance una consistencia pastosa. Transfiera el tejido picado a un tubo cónico que contenga 10-30 ml de solución de colagenasa con un bisturí. Para asegurarse de que se recoge todo el tejido, pipetear 1 ml de solución de colagenasa en la placa de cultivo de tejidos y de nuevo en el tubo cónico.NOTA: Para producir organoides más grandes, la digestión mecánica debe minimizarse, dejando intactas algunas pequeñas piezas visibles de tejido. Alternativamente, el tejido puede almacenarse congelado para su posterior preparación de organoides con una pérdida mínima de viabilidad. Para hacerlo, lave el tejido en una solución de PBS o medios de células basales + 1% de FBS, y luego pique grueso para aumentar el área de superficie (manteniendo el tejido en una o dos piezas sólidas). Mueva el tejido a un crio-vial, cubra con medios de congelación (90% FBS + 10% dimetilsulfóxido (DMSO)). Congele los viales en un recipiente de congelación de velocidad controlada durante la noche antes de pasar al almacenamiento en nitrógeno líquido. Coloque el tubo cónico en una incubadora de agitación de sobremesa a 37 °C a 180 RPM hasta que el tejido se vuelva fibroso y la solución de colagenasa se vuelva turbia. Por ejemplo, una gran masa de tejido (alrededor de 500-800 mg) de un tumor tarda 30-60 minutos. Una masa de tejido más pequeña (alrededor de 100-300 mg) de almohadillas de grasa mamaria de tipo salvaje tarda unos 20-30 minutos. Si no está seguro, verifique a intervalos de 5 minutos. Después de la incubación, centrifugar el tubo cónico durante 10 min a 550 x g a temperatura ambiente (RT). Aspire cuidadosamente el sobrenadante del tubo cónico.NOTA: En el futuro, recubra previamente todas las puntas de pipetas, pipetas serológicas y tubos cónicos con solución BSA para evitar la pérdida de organoides debido a la adhesión al plástico. Agregue 8 ml de medios celulares basales y 80 μL de solución de DNasa [2 U/μL] al tubo. Invertir suavemente durante 1-3 min. Agregue 12 ml de medios de células basales al tubo y mezcle cuidadosamente pipeteando o gire suavemente el tubo 15 veces para mezclar. Centrífuga durante 10 min a 550 x g en RT. Aspirar el sobrenadante, y luego resuspender el pellet en 12 ml de medios de células basales. Deje que los fragmentos de tejido más pesados se asienten en el fondo. Recoger el sobrenadante con una pipeta serológica y transferir a un tubo cónico de 15 ml. Esta suspensión contiene organoides epiteliales y células estromales/inmunes. Tejido mamario humanoProcesar las muestras de tejido mamario humano en busca de organoides o almacenarlas dentro de las 24 h posteriores a la recolección. Almacenar las muestras a 4 °C en medios independientes delCO2 con antibiótico-antimicótico 100x al 1%. Transfiera el tejido a una placa de cultivo de tejidos. Incline la placa y aspire el exceso de medios de almacenamiento, y luego enjuague el pañuelo con 5 ml del lavado de anfotericina B. Retire el lavado de anfotericina B inmediatamente. Picar la muestra de tejido con un bisturí #10 o #11 para aflojar el tejido hasta que alcance una consistencia similar a una pasta. Transfiera el tejido picado a un tubo cónico que contenga 10-30 ml de solución de colagenasa con un bisturí. Para asegurarse de que se recoge todo el tejido, pipetear 1 ml de solución de colagenasa en la placa de cultivo de tejidos y volver al tubo cónico.NOTA: Para producir organoides más grandes, la digestión mecánica debe minimizarse, dejando intactas algunas pequeñas piezas visibles de tejido. La masa tisular inicial para este protocolo osciló entre 100-250 mg. Alternativamente, el tejido se puede almacenar congelado para su posterior preparación de organoides con una pérdida mínima de viabilidad después del paso 4.2.2 en 90% FBS + 10% DMSO como se mencionó anteriormente. Coloque el tubo cónico en una incubadora de agitación de sobremesa a 37 °C a 180 RPM hasta que el tejido se vuelva más pequeño y la colagenasa se vuelva turbia. Revise el tejido a intervalos de 5 minutos. La disociación de la colagenasa de muestras humanas toma aproximadamente 5-20 min. Después de la incubación, girar el tubo cónico durante 10 minutos a 550 x g en RT. Aspire cuidadosamente el sobrenadante del tubo cónico.NOTA: Avanzando, recubra previamente todas las puntas de pipeta, pipetas serológicas y tubos cónicos con solución BSA para evitar la pérdida de organoides debido a la adhesión al plástico. Agregue 4 ml de medios de células basales y 40 μL de solución de DNasa [2 U/μL] al tubo cónico. Invertir suavemente durante 3 min. Agregue 6 ml de medios de células basales al tubo y mezcle cuidadosamente pipeteando o gire suavemente el tubo cónico 15 veces para mezclar. Centrífuga durante 10 min a 550 x g en RT. Aspirar el sobrenadante, y luego resuspender el pellet en 10 ml de medios de células basales. Deje que los fragmentos de tejido más pesados se asienten en el fondo. Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un tubo cónico de 15 ml. Esta suspensión contiene organoides epiteliales y células estromales/inmunes. 5. Centrifugación diferencial Pulse a 550 x g durante 3-4 s en RT, aspire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 10 ml de medios de células basales. Repita este paso tres veces más (un total de cuatro giros). Después de cada centrifugación, asegúrese de que el pellet se vuelva cada vez más opaco. Este pellet restante serán organoides epiteliales. 6. Recolección de organoides pequeños Pulse a 80-100 x g durante 3 s en RT. Recoja el sobrenadante en un tubo fresco recubierto de BSA, y luego pulse a 550 x g durante 3 s en RT para granular los organoides pequeños. 7. Incrustación de organoides en BECM Suspensión alícuota adecuada de organoides en tubos de microcentrífuga de acuerdo con la densidad organoide en relación con la cantidad de BECM por pocillo (Tabla 1). Por ejemplo, use 50-100 organoides para 20 μL de BECM en un pocillo de una placa de 96 pocillos.NOTA: La densidad de organoides se puede contar utilizando la siguiente fórmula: ((Número promedio de organoides)/50 μL) x factor de dilución. Realice todos los pasos en hielo. Coloque el BECM descongelado en hielo en una campana de cultivo de tejidos. Mientras prepara la campana, coloque todas las puntas de pipeta en hielo para que se enfríen. Centrifugar los tubos de microcentrífuga durante 10 min a 300 x g en RT. Desechar el sobrenadante de los tubos. Mover los tubos con gránulos organoides al hielo y añadir el volumen adecuado de BECM a cada tubo de microcentrífuga (Tabla 1).NOTA: Dado que BECM es viscoso, agregue volúmenes adicionales (aproximadamente 10% -20% adicionales del volumen de la cúpula) de BECM para tener en cuenta la pérdida en la punta de la pipeta. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender los organoides en BECM, teniendo cuidado de no producir burbujas. Pipetear lenta y cuidadosamente los organoides suspendidos por BECM sobre la superficie de recubrimiento. Mientras pipetea, levante lentamente la pipeta para crear una cúpula. Llene todos los pozos vacíos con PBS para mantener la humedad. Colocar la placa en una incubadora a 37 °C durante 1 h para permitir que BECM se solidifique, y luego cubrir con el volumen apropiado de medio (Tabla 1). 8. Incrustación de organoides en colágeno Realice todos los pasos en hielo. Prepare la solución de colágeno combinando, en orden secuencial, 375 μL de 10x DMEM, 100 μL de hidróxido de sodio (NaOH) de 1 N y 3 ml de solución de colágeno I de cola de rata en un tubo cónico de 15 ml. Mezcla de pipetas, teniendo cuidado de no hacer burbujas. Valorar la solución a un pH de 7.2-7.4 con pequeñas cantidades (incrementos de 1-3 μL) de NaOH o 10x DMEM según sea necesario. Cubra el fondo de los pozos con la cantidad mínima de colágeno requerida para cubrir completamente el fondo del pozo. Un enfoque es colocar una pequeña cantidad de colágeno y mecer la placa de lado a lado para cubrir. Deje que las capas base de colágeno se fijen a 37 °C durante 30 min-2 h. Alícuota la suspensión adecuada de organoides en tubos de microcentrífuga de acuerdo con la densidad organoide relativa a la cantidad de colágeno por pocillo (Tabla 1). Colocar en una incubadora a 37 °C. Almacene la solución de colágeno a 4 °C y controle la polimerización comprobando la formación de fibra bajo un microscopio cada 10 minutos. El colágeno alcanzará la polimerización adecuada entre 30 min-2 h.NOTA: La polimerización adecuada puede determinarse por la presencia de fibras que se ramifican en toda la matriz. Continúe con el paso 8.5 inmediatamente una vez que se observen algunas fibras en el campo de visión. Centrifugar los tubos de microcentrífuga a 300 x g durante 10 min a RT. Desechar el sobrenadante de los tubos. Mover los gránulos de organoides al hielo y añadir el volumen adecuado de colágeno a cada tubo de microcentrífuga (Tabla 1).NOTA: Dado que el colágeno es viscoso, agregue volúmenes adicionales (aproximadamente 10% -20% adicionales del volumen de la cúpula) de colágeno para tener en cuenta la pérdida en la punta de la pipeta. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender los organoides en colágeno, teniendo cuidado de no producir burbujas. Pipetea lenta y cuidadosamente los organoides suspendidos en colágeno sobre la superficie del recubrimiento. Mientras pipetea, levante lentamente la pipeta para crear una cúpula. Llene todos los pozos vacíos con PBS para mantener la humedad. Colocar la placa en una incubadora a 37 °C durante 1 h para permitir que el colágeno se solidifique, y luego cubrir con el volumen adecuado de medios (Tabla 1). NOTA: Los organoides mantienen la viabilidad en matriz 3D hasta por 7 días. Si se utilizan imágenes para el análisis, continúe con los pasos 9 y 10. 9. Fijación de organoides incrustados Utilice una pipeta para extraer todos los medios de los pocillos sin hacer contacto con los domos ECM. Fijar con solución de paraformaldehído (PFA)/PBS al 4% durante 5 min. Lave dos o tres veces aplicando PBS a los pozos después de colocarlos en una coctelera que se mueve lentamente. Después de los lavados, aplicar PBS fresco a las cúpulas y conservar la placa a 4 °C. 10. Tinción inmunofluorescente de organoides incrustados Preparación de soluciones para la tinción inmunofluorescenteTampón de permeabilización: Prepare una solución de PBS con Triton X-100 al 10%. Búfer de bloqueo: Prepare una solución PBS con 10% FBS y 0.2% Triton X-100. Tampón de dilución de anticuerpos: Prepare una solución de PBS con 2% FBS y 0.2% Triton X-100. Permebilización y bloqueoPipetear suficiente tampón de permeabilización para cubrir las cúpulas ECM. Incubar durante 1 h en RT en una agitadora que se mueva lentamente. Retire el tampón de permeabilización con una pipeta y aplique el mismo volumen de tampón de bloqueo durante 3 h. Incubación de anticuerpos primariosRetire el tampón de bloqueo con una pipeta y aplique el tampón de dilución de anticuerpos que contiene el anticuerpo primario a concentraciones especificadas por el fabricante. Incubar la muestra a 4 °C durante 12-16 h en una agitadora de movimiento lento. Retire la solución de anticuerpos primarios y lave las muestras tres veces durante 10 minutos con PBS en RT en una coctelera de movimiento lento. Incubación secundaria de anticuerpos y tinción nuclearAspirar el lavado de PBS restante y aplicar el tampón de dilución de anticuerpos que contiene anticuerpos secundarios a concentraciones especificadas por el fabricante. Además, agregue DAPI o Hoechst (para etiquetar núcleos) o faloidina (para etiquetar actina) al tampón en una proporción de 1:250. Incubar durante 2-4 h en RT en una agitadora de movimiento lento. Retire la solución de anticuerpos secundarios y lave las muestras tres veces durante 10 minutos en PBS a RT en un agitador. Almacene las muestras en PBS a 4 °C hasta obtener imágenes.

Representative Results

Las imágenes presentadas en la Figura 1 proporcionan un ejemplo de organoides epiteliales mamarios de tipo salvaje y tumorales de tejidos humanos y de ratón. Una ilustración de un vistazo del método para aislar organoides epiteliales a través de centrifugación diferencial se proporciona en el flujo de trabajo de dibujos animados en la Figura 1A, que muestra que los tejidos primarios de diferentes especies pueden procesarse de maneras casi idénticas mientr…

Discussion

Se han descrito diferentes métodos en la literatura para generar organoides tumorales. Este protocolo destaca un método para generar organoides tumorales directamente del tumor sin pasar. Utilizando este método, los organoides tumorales son producibles a las pocas horas de iniciar el procedimiento y generan organoides cerca del 100% viables en comparación con el 70% reportado en la literatura³¹. En comparación, otros métodos requieren el paso en serie de células a organoides durante varias …

Materials

10 mM HEPES Buffer	Gibco	15630080
100x Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-096
100x Glutamax	Life Technologies	35050-061	Glutamine supplement
100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)	Life Technologies	51500-056
100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Sigma	P4333
10x DMEM	Sigma	D2429
50 mL/0.2 µm filter flask	Fisher	#564-0020
Amphotericin B	Life Technologies	15290-018
bFGF	Sigma	F0291
BSA Solution (32%)	Sigma	#A9576
Cholera Toxin	Sigma	C8052
CO2-Independent Medium	Gibco	18045-088
Collagenase A	Sigma	C2139
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)	Sigma	D4263
DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma	D6546	Common basal medium
D-MEM/F12	Life Technologies	#10565-018	Basal cell medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Sigma	#D8662	PBS
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	#F0926
Gentamicin	Life Technologies	#15750-060
Human epidermal growth factor (EGF)	Sigma	E9644
Hydrocortisone	Sigma	H0396
Insulin	Sigma	#I9278
Matrigel	Corning	#354230	Basement Extracellular Matrix (BECM)
NaOH (1 N)	Sigma	S2770
Rat Tail Collagen I	Corning	354236
RPMI-1640 media	Fisher	SH3002701
Trypsin	Life Technologies	27250-018