Uno de los principales impulsores de los fenotipos celulares en eucariotas es la expresión génica. El control de la expresión génica es esencial y se basa en múltiples proteínas y ARN, desde la transcripción hasta los procesos de traducción1. Las alteraciones a lo largo de estos pasos pueden desencadenar varias enfermedades diferentes. El procesamiento y el empalme del ARN constituyen un grupo importante de reacciones responsables de generar moléculas de ARN maduras 2,3,4,5. El empalme elimina los intrones y une los exones para generar una molécula de ARN madura capaz de realizar actividades funcionales y estructurales. Las eficiencias y las tasas de empalme tienen un gran impacto en los fenotipos observados en diferentes condiciones6.
El empalme se realiza mediante una compleja maquinaria macromolecular llamada espliceosoma, que está compuesta por cinco snRNAs y más de 100 proteínas 5,7. Además de los componentes proteicos centrales, los espliceosomas tienen proteínas que actúan trans, lo que podría afectar directamente la regulación de este proceso 8,9. La importancia del splicing se refleja en el amplio espectro de enfermedades causadas por alteraciones en este proceso, incluyendo trastornos neurodegenerativos, enfermedades neuromusculares y varios tipos de cáncer 3,10,11. El estudio de la dinámica de empalme y el ensamblaje de espliceosomas puede tener un gran impacto en la comprensión de la biología de estos trastornos.
El ensamblaje del espliceosoma comienza con la asociación de U1 snRNP con una región específica del pre-ARNm recientemente transcrito, el sitio de empalme5 '5,8. El emparejamiento eficiente y el reconocimiento de sitios de empalme 5 'por U1 snRNA no solo definen los sitios de empalme que deben usarse, sino que también controlan qué pre-ARN se empalmarán primero, o de manera más eficiente 6,12,13. El uso de diferentes sitios de empalme puede generar múltiples isoformas alternativas de ARN maduros a partir del mismo gen. El empalme alternativo es una fuente importante de diversidad proteómica, permitiendo la generación de los ARN y proteínas necesarios durante el desarrollo o en diferentes células y tejidos14,15. Las transcripciones alternativas de ARN pueden generar isoformas de proteínas truncadas o no funcionales, que pueden causar enfermedades10,16. Por lo tanto, los componentes proteicos del complejo snRNP U1 tienen un importante papel regulador en el empalme1. La galectina-1 y la galectina-3 (Gal1 y Gal3) son componentes de U1 snRNP17,18. Voss et al.19 proponen un método de fraccionamiento de extractos nucleares para obtener complejos enriquecidos con snRNP Gal3-U1 capaces de rescatar la actividad de empalme en células agotadas de U1. Este análisis contribuye a comprender el mecanismo de asociación de Gal3 con los espliceosomas, y se pueden utilizar enfoques similares para explorar otras posibles proteínas reguladoras de empalme.
La unión de U1 snRNP a los sitios de empalme 5' es un mediador importante de la fidelidad del empalme20. Las mutaciones en los sitios de empalme 5' son críticas y causan la pérdida del emparejamiento U1 snRNP, lo que resulta en defectos de empalme2. La fibrosis quística, por ejemplo, es causada por un sitio de empalme mutado 5' en el gen CFTR21. Wong et al.22 describen un método para compensar las mutaciones del sitio de empalme 5' con mutaciones complementarias en los snRNAs U1. El enfoque promueve con éxito la inclusión de exones, generando ARN maduros y dando como resultado el rescate de defectos de empalme. Además de ofrecer una posible terapia basada en ARN para estas enfermedades, este enfoque puede ser útil para el análisis de secuencias reguladoras individuales en pre-ARNm23.
La fidelidad de la asociación de snRNA U1 a los sitios de empalme también se explora en el sistema modelo de levadura por van der Feltz24. La levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae se ha utilizado ampliamente para explorar la cinética de empalme y el ensamblaje de espliceosomas25. La cinética de empalme y la composición del espliceosoma están bien conservadas en eucariotas, y la levadura se ha utilizado ampliamente para monitorear la formación de complejos intermedios durante el ensamblaje26. El ensayo reportero ACT1-CUP1 se basa en la expresión de un par de genes: ACT1, que contiene un intrón con secuencias óptimas del sitio de empalme, y CUP1, que expresa un quelante de cobre, protegiendo a la célula del daño causado por este ion metálico. CUP1 solo se expresa si ACT1 está correctamente empalmado, creando así el sistema de notificación27. El crecimiento celular en condiciones con diferentes concentraciones de cobre se puede monitorear para abordar la eficiencia de empalme de diferentes secuencias de intrones o utilizando diferentes proteínas reguladoras. van der Feltz24 presenta un método para analizar los efectos de una proteína reguladora de empalme utilizando este sistema reportero y ensayos de viabilidad de cobre. Se puede utilizar un enfoque similar para diseñar variaciones en las secuencias de intrones en combinación con diferentes proteínas para abordar el éxito del empalme en levaduras.
Además de la asociación de snRNP, la unión de proteínas es esencial durante el ensamblaje del espliceosoma1. El control de la actividad del espliceosoma depende directamente de su composición proteica y de las interacciones que se producen durante su formación. Las características estructurales y funcionales de los componentes proteicos son importantes para activar el complejo 5,7. Carvalho et al.28 utilizan un enfoque basado en el método Grafix, que se basa en la reticulación de proteínas no reversible en el análisis de gradiente de glicerol. Este análisis aborda la composición de las proteínas y las interacciones transitorias que ocurren durante el ensamblaje, lo que puede ser crítico para el ensamblaje del complejo activo y el éxito del empalme. El análisis de otros complejos macromoleculares dinámicos con este enfoque puede ser muy útil y proporcionar información sobre la organización y las interacciones de las proteínas.
La química y la velocidad de empalme también se ven afectadas por la asociación dinámica de los diferentes componentes del empalme8. Recientemente, el uso de inhibidores de empalme de moléculas pequeñas ha revelado que los pasos específicos pueden estancarse in vitro debido a la velocidad reducida de las reacciones de empalme29,30. Basei et al.31 presentan un método para analizar el empalme alternativo sobre la influencia del factor regulador del empalme, Nek4. Se aborda la prevalencia de isoformas de transcripción que conducen a fenotipos protumorales o antitumorales en células HEK293 utilizando un minigen. La mala regulación del empalme o los diferentes usos de los sitios de empalme pueden conducir a la generación de transcripciones alternativas, causando diferentes tipos de cáncer16. El uso de moduladores o inhibidores de empalme durante la terapia puede determinar las opciones del sitio de empalme, definiendo así las isoformas alternativas generadas, ya sean protumorales o antitumorales. El paclitaxel y el cisplatino se utilizan actualmente como agentes quimioterapéuticos. Con el uso del minigen E1A, se abordan los efectos de estos fármacos en el empalme alternativo. El análisis de empalme alternativo utilizando minigenes es una estrategia importante para monitorear los efectos de las proteínas que actúan trans y los cambios de empalme sobre la terapia y el uso de medicamentos específicos.
En esta línea, se ha informado que muchos microARN intrónicos (miARN) están asociados con fenotipos tumorales32,33. El control y la regulación de la síntesis y biogénesis de miARN intrónico se pueden asociar con el control de las reacciones de empalme. Los miARN pueden modular la estabilidad y prevalencia de los ARNm en las células, afectando la estabilidad del ARN y la velocidad de traducción34. Gatti da Silva y Coltri35 describen un sistema reportero para evaluar la biogénesis y maduración de miARN intrónicos, que puede estar directamente relacionado con alteraciones en los fenotipos celulares y la determinación de características protumorales o antitumorales. Con la modulación de la proteína reguladora de empalme HuR, el sistema permite el análisis de la biogénesis y la actividad funcional de un miARN oncogénico intrónico.
El análisis del empalme previo al ARN y la maduración de diferentes ARN en células específicas será esencial para comprender e interpretar la información genómica. Los espliceosomas de levadura y mamíferos están conservados, y la investigación básica puede mejorar el uso de los diferentes métodos aplicados a la terapéutica y la biomedicina. A pesar de la gran cantidad de datos genómicos disponibles actualmente, la expresión de esta información en los fenotipos podría ser específica de la célula y depender del procesamiento y empalme del ARN. Comprender la compleja regulación de este proceso será esencial para futuras investigaciones.