El presente protocolo describe las capacidades y las modalidades esenciales de cultivo del Open-Top Organ-Chip para el establecimiento exitoso y la maduración de cultivos de órgano en chip de espesor completo de tejidos primarios (piel, alvéolo, vías respiratorias e intestino), brindando la oportunidad de investigar diferentes aspectos funcionales de la interfaz epitelial/mesenquimal y nicho vascular humana in vitro.
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Artículo de método
Reconstitución de la citoarquitectura y la función de los tejidos epiteliales humanos en un chip de órgano abierto
En este artículo
Resumen
Resumen
Casi todos los órganos humanos están revestidos con tejidos epiteliales, que comprenden una o varias capas de células estrechamente conectadas organizadas en estructuras tridimensionales (3D). Una de las principales funciones del epitelio es la formación de barreras que protegen los tejidos subyacentes contra insultos físicos y químicos y agentes infecciosos. Además, los epitelios median el transporte de nutrientes, hormonas y otras moléculas de señalización, a menudo creando gradientes bioquímicos que guían el posicionamiento celular y la compartimentación dentro del órgano. Debido a su papel central en la determinación de la estructura y función de los órganos, los epitelios son objetivos terapéuticos importantes para muchas enfermedades humanas que no siempre son capturadas por modelos animales. Además de las obvias diferencias de especie a especie, la realización de estudios de investigación sobre la función de barrera y las propiedades de transporte de los epitelios en animales se ve agravada por la dificultad de acceder a estos tejidos en un sistema vivo. Si bien los cultivos de células humanas bidimensionales (2D) son útiles para responder preguntas científicas básicas, a menudo producen predicciones in vivo deficientes. Para superar estas limitaciones, en la última década, una gran cantidad de plataformas biomiméticas de microingeniería, conocidas como órganos en un chip, han surgido como una alternativa prometedora a las pruebas tradicionales in vitro y en animales. Aquí, describimos un Open-Top Organ-Chip (o Open-Top Chip), una plataforma diseñada para modelar tejidos epiteliales específicos de órganos, incluyendo piel, pulmones e intestinos. Este chip ofrece nuevas oportunidades para reconstituir la arquitectura multicelular y la función de los tejidos epiteliales, incluida la capacidad de recrear un componente estromal 3D mediante la incorporación de fibroblastos específicos de tejido y células endoteliales dentro de un sistema mecánicamente activo. Este chip abierto proporciona una herramienta sin precedentes para estudiar las interacciones epiteliales / mesenquimales y vasculares a múltiples escalas de resolución, desde células individuales hasta construcciones de tejido multicapa, lo que permite la disección molecular de la diafonía intercelular de los órganos epitelializados en la salud y la enfermedad.
Introducción
Históricamente, los científicos han confiado en las pruebas preclínicas en animales para el descubrimiento de fármacos, pero un número creciente de estos métodos han sido cuestionados debido a la mala correlación con el resultado humano1. La implementación de los principios de las "3R" para reemplazar, reducir y refinar la experimentación animal insta a los científicos a encontrar nuevos métodos alternativos in vitro para apoyar la evaluación preclínica de riesgos de toxicología química y de medicamentos2. Sin embargo, muchos modelos in vitro desarrollados hasta la fecha carecen de la arquitectura bioló....
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Protocolo
Los colonoides humanos se obtuvieron de resecciones intestinales de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Bioseguridad del Hospital de Niños de Cincinnati (IBC 2017-2011).
1. Activación de superficie
- Preparación del búfer de activación
- Coloque el reticulante y los reactivos tampón del disolvente debajo del gabinete de bioseguridad (BSC) y déjelos equilibrarse a temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos antes de su uso.
- Reconstituya 5 mg de reticulante en 5 ml del tampón disolvente utilizando un recipiente estéril impermeable a la luz o un tubo cónico transparente de 15 ml env....
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Resultados
Micropatrones superficiales
El micropatrón de la matriz extracelular (ECM) se puede utilizar para replicar la configuración espacial de la interfaz de la cripta intestinal. La configuración del chip abierto se puede modificar para integrar sellos micropatronados diseñados específicamente para imitar la topografía natural de la interfaz epitelio-estroma colónico (Figura 6A, B) y las criptas intestinales a escala micrométrica (Figura 6C.......
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Discusión
El chip Open-Top representa una plataforma habilitadora para investigar la compleja interacción celular que ocurre entre el endotelio, el estroma y el epitelio en un microambiente controlado, en tiempo real. Esta tecnología ofrece ventajas críticas sobre los cultivos organotípicos y organoides convencionales, como la integración de señales físicas y bioquímicas que son relevantes para reconstituir el microambiente del tejido humano, incluido el cizallamiento fluídico (flujo), el estiramiento cíclico y la reconstrucción d.......
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Divulgaciones
Los autores declaran los siguientes intereses financieros / relaciones personales, que pueden considerarse como posibles intereses en competencia: Varone Antonio es un ex empleado de Emulate Inc. y puede tener una participación accionaria en Emulate.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medio; Stroma |
| Aguja de calibre 18 | MicroGroup | 316H18RW | Tubo de acero inoxidable 316 soldado, 18RW Full Hard |
| Aguja de calibre 19 | MicroGroup | 316H19RW | Tubo de acero inoxidable 316 soldado, 19RW Full Hard |
| 2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tubo, 0.25 mm, 12/paquete |
| 70% etanol y toallitas | - | - | Para la esterilización de superficies |
| 8-Bromoadenosina 3′,5′-sal sódica monofosfato cíclico (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Suplemento medio |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| Adenina | Sigma | A9795 | |
| DMEM / F12 | Células | ||
| de las vías respiratorias Tecnología | celda Lifeline | FC-0016 | |
| Papel de aluminio | - | - | - |
| Células alveolares | Cell Biologics | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | ABCAM | AB24751 | Anticuerpo monoclonal de ratón [3C9] |
| Anti-Acuaporina5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | AB215225 | Anticuerpo monoclonal de conejo [EPR3747] |
| Anti-Acuaporina5 | ABCAM | AB92320 | Anticuerpo monoclonal de conejo [EPR3747] |
| Tubulina intravenosa anti-beta | ABCAM | AB11315 | Anticuerpo monoclonal de ratón [ONS.1A6] |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Anticuerpo monoclonal de ratón [JC/70A] |
| Anti-CK5 | ABCAM | AB75869 | Monoclonal recombinante de conejo [AY1E6] |
| Anti-Citoqueratina 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Anticuerpo monoclonal de ratón (DE-K10) |
| Anti-Citoqueratina 14 | ABCAM | AB7800 | Anticuerpo monoclonal de ratón |
| Anti-E-Cadherin | ABCAM | AB1416 | Anticuerpo monoclonal de ratón |
| Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Anticuerpo policlonal de conejo |
| Anti-HTI-56 | Terraza Biotech | TB-29AHT1-56 | Anticuerpo monoclonal de ratón (IgG1) |
| Anti-HTII-280 | Terraza Biotech | TB-27AHT2-280 | Anticuerpo monoclonal de ratón (IgM) |
| Anti-Involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Anticuerpo monoclonal de ratón (SY5) |
| Anti-isoformas TA p63-α, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Anticuerpo policlonal de conejo |
| Anti-Ki67 | ABCAM | AB8191 | Anticuerpo monoclonal de ratón [B126.1] |
| Anti-LAMP3 | ABCAM | AB111090 | Anticuerpo policlonal de conejo |
| Anti-Maduro SP-B | Siete Colinas | WRAB-48604 | Anticuerpo policlonal de conejo |
| Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Anticuerpo policlonal de conejo |
| Anti-Mucina-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Anticuerpo monoclonal de ratón (IgG1) |
| Anti-p63 | Dako | GA662 | Anticuerpo monoclonal de ratón p63 Proteína (Dako Omnis) Clonar DAK-p63 |
| Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Anticuerpo policlonal de conejo |
| Anti-Podoplanin (AT-1α) | ABCAM | AB128994 | Anticuerpo policlonal de conejo |
| Anti-Pro + Proteína Surfactante Madura B | ABCAM | AB40876 | Anticuerpo policlonal de conejo |
| Anti-Surfactante C | Siete Colinas | WRAB-9337 | Anticuerpo policlonal de conejo |
| Anti-Uteroglobina/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Anticuerpo monoclonal de ratón [AY1E6] |
| Anti-VE-cadherina | ABCAM | AB33168 | Anticuerpo policlonal de conejo |
| Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Anticuerpo monoclonal de ratón [1A12] |
| Ácido ascórbico | Sigma | A4544 | |
| Pipetas de aspiración | Corning / Halcón | 357558 | 2 mL, poliestireno, envuelto individualmente; |
| Puntas de aspiración | - | - | Estéril (esterilizado en autoclave) |
| B27 | Thermo | 17504044 | |
| Blocker BSA (10X) en solución PBS | ThermoFisher | 37525 | Agente bloqueador |
| Cloruro de Calcio | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| Colágeno I Biomatrix | Avanzado | 5133 | 10 mg/mL (Estroma) |
| Colágeno I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (ECM vascular) |
| Colágeno IV | Sigma | C5533 | |
| Colágeno-IV | Sigma | C5533-5MG | Colágeno de placenta humana, 5 mg en polvo, reconstituido a 1 mg/mL |
| Fibroblastos colónicos | Productos biológicos celulares | H6231 | |
| Células endoteliales microvasculares colónicas | Productos biológicos celulares | H6203 | |
| Tubos cónicos | - | - | 15 mL y 50 mL polipropileno, estéril |
| Reticulante (ER-1) | Emular | 10461 | 5 mg en polvo |
| DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, dilactato) | ThermoFisher | D3571 | Sonda de ADN |
| Fibroblastos dérmicos | ATCC | PCS-201-010 | |
| Células endoteliales microvasculares dérmicas | ATCC | CRL-3243 | |
| Dexametasona | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | ||
| DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 y nbsp; | Medio basal para medio ALI |
| Burro Anti-Ratón IgG H& L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | AB150105 | Anticuerpo secundario Donkey Anti-Mouse |
| Burro Anti-Ratón IgG H& L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | AB175472 | Anticuerpo secundario Donkey Anti-Mouse |
| Burro Anti-Ratón IgG H& L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | AB150107 | Anticuerpo secundario Donkey Anti-Mouse |
| Burro Anti-Conejo IgG H& L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | AB150073 | Anticuerpo secundario Donkey Anti-Mouse |
| Burro Anti-Conejo IgG H& L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | AB175470 | Anticuerpo secundario Donkey Anti-Mouse |
| Burro Anti-Conejo IgG H& L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | AB150075 | Anticuerpo secundario Donkey Anti-Mouse |
| Dulbecco' s PBS (DPBS-/-) (sin Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
| Factor de crecimiento epidérmico (EGF) humano, recombinante en E. coli | PromoCell | C-60170 | Suplemento medio |
| F-12 Ham' s | Invitrogen | 21700-108 | Para ECM vascular |
| FibriCol | BioMatrix Avanzado | 5133-20ML | Solución de colágeno I (10 mg/mL) |
| Fibronectina | Corning | 356008 | |
| Fibronectina, Humana, Natural, | Corning | 47743-654 y 4774 | fibronectina de plasma humano |
| Pinzas de precisión de punta fina | Aven | 18056USA | Pinzas de acero inoxidable de precisión Technik Style 5B-SA |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| Glutamax | Invitrogen | ||
| Cabra Anti-Ratón IgG H& L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | AB150080 | Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra |
| Cabra Anti-Ratón IgG H& L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | AB150115 | Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra |
| Cabra Anti-Ratón IgG H& L (FITC) | ABCAM | AB6785 | Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra |
| Cabra Anti-Ratón IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Anticuerpo secundario IgG1 anti-ratón de cabra |
| Cabra Anti-Ratón IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Anticuerpo secundario IgM anti-ratón de cabra |
| Aspirador de vacío de mano | Corning | 4930 y 4930 | - |
| Suero HyClone FetalClone II Inactivado por Calor (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| Hemocitómetro | - | - | - |
| Heparina sal sódica de la mucosa intestinal porcina | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo 15630080 | ||
| Human [Leu15] - Gastrin | Sigma | G9145 | |
| Colonoides humanos | Obtenidos de resecciones | Obtenidos de resecciones clínicas | |
| Proteína recombinante de EGF humano | Factor de | ||
| Termo | |||
| HyClone FetalClone II Serum (EE. UU.) | GE Cuidado de la salud | SH30066.02HI | FBS estéril inactivado por calor |
| Hidrocortisona 21-hemisuccinato sal sódica | Sigma | H4881 | |
| Hidrocortisona | PromoCell | C-64420 y nbsp; | Suplemento medio |
| Cubo de hielo | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Bomba peristáltica digital de baja velocidad; q24 canales (1 por 12 chips) |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| Factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), también conocido como factor de crecimiento básico de fibroblastos 7 (FGF-7), humano, recombinante en HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Queratinocitos | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminin | Biolamina | CT521-0501 | |
| Laminina, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | laminina recombinante humana 521 |
| Células de fibroblastos pulmonares | Biologics | H6013 | |
| Fibroblastos pulmonares | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
| Células endoteliales microvasculares pulmonares | Lonza | CC-2527 | |
| Células musculares lisas pulmonares | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
| Contador manual | - | - | - |
| Tubo de transferencia Masterflex (TPE) | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
| Medio 199, sin rojo fenol | Thermo | ||
| Tubo de microcentrífuga | - | - | 1,5 mL, estéril |
| Microscopio (con cámara) | - | - | Para imágenes de campo claro |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-acetilcisteína | Sigma | A5099 | |
| Noggin (medio HEK293T acondicionado) | Sigma | N17001 | |
| Suero de cabra normal | ThermoFisher | 50062Z | Solución de bloqueo |
| O-fosfosestriletanolamina | Sigma | P0503 | |
| Paraformaldehído (4% en peso/vol) | EMS | 15710 | Agente de fijación |
| Penicilina Estreptomicina | GIBCO 15140122 | ||
| Penicilina-estreptomicina | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
| Puntas de pipeta | - | - | P20, P200 y P1000 Pipeta estéril de baja adherencia |
| Gilson | F167380 | P20, P200 y P1000 | |
| Reemplazo de suero PluriQ (o alternativamente reemplazo de suero KO) | AMSBIO (o Thermo) | N/A (o C1910828010) | |
| Portaobjetos de vidrio recubiertos de poli-L-lisina | Sigma | P0425 | Toboganes de vidrio |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Progesterona | Sigma | P8783 | |
| ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Montaje antidecoloración con DAPI |
| Ácido retinoico | Sigma | R2625 | |
| Inhibidor de ROCK (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-espondina (medio HEK293T acondicionado) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots suplementos | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM Vía Aérea Pequeña Medio de Crecimiento de Células Epiteliales BulletKitTM | Lonza | CC-4124 y nbsp; | Suplementos medianos |
| SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
| Pipetas serológicas | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL y 25 mL de endotoxinas bajas, estériles |
| Medio de crecimiento de células epiteliales de las vías respiratorias pequeñas (SAGM) | Lonza | CC-4124 y nbsp; | |
| Tampón solvente (ER-2) | Emular | 10462 | Frasco de 25 mL |
| Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Tubo cónico filtrante estéril |
| Sterilin 100 mm Placas de Petri cuadradas | Thermo | 103 | Estéril, 1 por cada 6 virutas |
| Frascos T25 | - | - | - |
| Frascos T75 | - | - | - |
| Tri-yodotironina | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100 (0,3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Agente de permeabilización |
| Azul de tripán | Sigma | 93595 | Solución al 0,4% |
| Solución TrypEE | Sigma | 12604013 | Solución de desconexión de celdas |
| PREADOLESCENTE-20 | Sigma | P2287 | Agente de permeabilización |
| Horno de luz ultravioleta (frecuencia máxima de 365 nm, intensidad de 100 y micro; J/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Modelo CL-1000L |
| Configuración de vacío | - | - | Presión mínima: -70 kPa |
| Factor de Crecimiento Endotelial Vascular 165 (VEGF-165) humano, recombinante en E. coli | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 y nbsp; | Suplemento medio |
| Factor de Von Willebrand conjugado FITC | ABCAM | ab8822 | Anticuerpo policlonal de ovejas |
| Baño de agua (o perlas) | - | - | Establézcalo en 37 ° C |
| Wnt3A (medio condicionado L-Wnt3A) | ATCC | CRL-2647 |
Referencias
- Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
- Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L.
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Reimpresiones y permisos
