Reconstitución de la citoarquitectura y la función de los tejidos epiteliales humanos en un chip de órgano abierto

Summary

El presente protocolo describe las capacidades y las modalidades esenciales de cultivo del Open-Top Organ-Chip para el establecimiento exitoso y la maduración de cultivos de órgano en chip de espesor completo de tejidos primarios (piel, alvéolo, vías respiratorias e intestino), brindando la oportunidad de investigar diferentes aspectos funcionales de la interfaz epitelial/mesenquimal y nicho vascular humana in vitro.

Abstract

Casi todos los órganos humanos están revestidos con tejidos epiteliales, que comprenden una o varias capas de células estrechamente conectadas organizadas en estructuras tridimensionales (3D). Una de las principales funciones del epitelio es la formación de barreras que protegen los tejidos subyacentes contra insultos físicos y químicos y agentes infecciosos. Además, los epitelios median el transporte de nutrientes, hormonas y otras moléculas de señalización, a menudo creando gradientes bioquímicos que guían el posicionamiento celular y la compartimentación dentro del órgano. Debido a su papel central en la determinación de la estructura y función de los órganos, los epitelios son objetivos terapéuticos importantes para muchas enfermedades humanas que no siempre son capturadas por modelos animales. Además de las obvias diferencias de especie a especie, la realización de estudios de investigación sobre la función de barrera y las propiedades de transporte de los epitelios en animales se ve agravada por la dificultad de acceder a estos tejidos en un sistema vivo. Si bien los cultivos de células humanas bidimensionales (2D) son útiles para responder preguntas científicas básicas, a menudo producen predicciones in vivo deficientes. Para superar estas limitaciones, en la última década, una gran cantidad de plataformas biomiméticas de microingeniería, conocidas como órganos en un chip, han surgido como una alternativa prometedora a las pruebas tradicionales in vitro y en animales. Aquí, describimos un Open-Top Organ-Chip (o Open-Top Chip), una plataforma diseñada para modelar tejidos epiteliales específicos de órganos, incluyendo piel, pulmones e intestinos. Este chip ofrece nuevas oportunidades para reconstituir la arquitectura multicelular y la función de los tejidos epiteliales, incluida la capacidad de recrear un componente estromal 3D mediante la incorporación de fibroblastos específicos de tejido y células endoteliales dentro de un sistema mecánicamente activo. Este chip abierto proporciona una herramienta sin precedentes para estudiar las interacciones epiteliales / mesenquimales y vasculares a múltiples escalas de resolución, desde células individuales hasta construcciones de tejido multicapa, lo que permite la disección molecular de la diafonía intercelular de los órganos epitelializados en la salud y la enfermedad.

Introduction

Históricamente, los científicos han confiado en las pruebas preclínicas en animales para el descubrimiento de fármacos, pero un número creciente de estos métodos han sido cuestionados debido a la mala correlación con el resultado humano¹. La implementación de los principios de las "3R" para reemplazar, reducir y refinar la experimentación animal insta a los científicos a encontrar nuevos métodos alternativos in vitro para apoyar la evaluación preclínica de riesgos de toxicología química y de medicamentos². Sin embargo, muchos modelos in vitro desarrollados hasta la fecha carecen de la arquitectura biológica, la complejidad celular y el entorno mecánico necesarios para recapitular la naturaleza dinámica de los órganos vivos humanos ^3,4.

Los sistemas preclínicos in vitro convencionales suelen emplear monocultivos 2D de células humanas cultivadas sobre una superficie plástica rígida. Estos métodos proporcionan una herramienta para realizar estudios mecanicistas simples y permiten una rápida selección de candidatos a fármacos. Debido a su costo relativamente bajo y alta robustez, los modelos 2D a menudo se combinan con sistemas automáticos de alto rendimiento y se utilizan para la identificación rápida de posibles candidatos a fármacos durante la etapa inicial del proceso de desarrollo de fármacos ^5,6. Sin embargo, tales modelos 2D no proporcionan un enfoque traslacional para modelar respuestas a nivel de tejido, órgano o sistémicas a candidatos terapéuticos, lo cual es necesario para predicciones precisas de la seguridad y eficacia de los medicamentos durante la etapa preclínica de su desarrollo. Los cultivos de células planas no recapitulan el microambiente tisular nativo, incluida la compleja interacción multicelular, las propiedades biomecánicas y la arquitectura tridimensional (3D) de los tejidos humanos⁷. Las células que crecen en una superficie plana a menudo no adquieren un fenotipo maduro y, por lo tanto, no pueden responder a los estímulos farmacológicos como lo harían en el tejido nativo. Por ejemplo, las células epiteliales alveolares humanas primarias cultivadas in vitro exhiben un fenotipo escamoso y pierden marcadores fenotípicos clave, incluidas las proteínas surfactantes C y B (SP-C y SP-B)⁸. Además de la diferenciación insuficiente, las células primarias con frecuencia se vuelven insensibles a los factores estresantes biológicos in vitro, ya que ciertas vías bioquímicas asociadas con la inflamación del tejido se vuelven no funcionales⁹. Tal pérdida de función celular parece estar asociada principalmente con el uso de sustratos rígidos, así como con la falta de factores solubles liberados naturalmente por las células estromales específicas del tejido, como los fibroblastos pulmonares y las células del músculo liso^10,11.

La comprensión de que la falta de complejidad quimiofísica y biológica limita el comportamiento fisiológico de las células in vitro ha fomentado el desarrollo de modelos multicelulares más sofisticados, que han demostrado captar mejor la complejidad de los tejidos humanos fuera del cuerpo^12,13. Desde la creación de los primeros modelos de cocultivo a principios de la década de 1970¹⁴, la introducción de hidrogeles sintéticos y naturales ha mejorado significativamente la capacidad de imitar microambientes de tejidos nativos y se ha convertido en una herramienta invaluable para impulsar la diferenciación celular, guiar la autoorganización de las células en estructuras similares a los tejidos y la restauración de las funciones de los tejidos nativos^15,16. Por ejemplo, cuando se cultivan en el andamio 3D apropiado, las células humanas pueden autoorganizarse en estructuras funcionales como esferoides u organoides, expresando marcadores de células madre, y son capaces de autorrenovarse¹⁷. En contraste, las células humanas (incluidas las células madre), cuando se cultivan en sustratos 2D tradicionales, envejecen rápidamente y sufren senescencia después de unos pocos pasajes¹⁸. Además, los hidrogeles pueden ser "adaptados" para que coincidan con propiedades específicas del tejido, como porosidad, tamaño de poro, grosor de fibra, viscoelasticidad, topografía y rigidez, o diseñados con componentes celulares derivados de tejidos y / o moléculas bioactivas que permiten la emulación de las condiciones fisiológicas o patológicas^19,20. A pesar de su enorme potencial para las pruebas farmacológicas, los modelos 3D basados en hidrogel utilizados en la investigación farmacéutica no recapitulan completamente la compleja citoarquitectura de los tejidos in vivo y carecen de importantes estímulos hemodinámicos y mecánicos normalmente presentes en el cuerpo humano, incluyendo la presión hidrostática, el estiramiento cíclico y el cizallamiento del fluido²¹.

Los sistemas microfisiológicos (MPS) como los Organs-on-chips (OOCs) han surgido recientemente como herramientas capaces de capturar respuestas fisiológicas complejas in vitro^22,23. Estos modelos a menudo emplean el uso de plataformas microfluídicas, que permiten el modelado del microambiente dinámico de los órganos vivos.

Hemos combinado los principios de la bioingeniería de tejidos 3D y la mecanobiología para crear un modelo de chip abierto de tejido epitelial humano complejo. Esto nos permitió recapitular de cerca el microambiente multicelular y dinámico de los tejidos epiteliales. Esto incluye señales bioquímicas y biomecánicas específicas del tejido naturalmente presentes en los órganos vivos, pero a menudo descuidadas por los modelos tradicionales in vitro ²⁴. El chip Open-Top incorpora dos compartimentos: un compartimento vascular (Figura 1A) y un compartimento estromal (Figura 1B) separados por una membrana porosa, lo que permite la difusión de nutrientes entre las dos cámaras (Figura 1C). El compartimiento vascular está expuesto a un flujo continuo de fluido para recapitular el esfuerzo cortante fisiológico, mientras que el diseño estirable de la cámara estromal permite el modelado de la tensión mecánica asociada con los movimientos respiratorios o la peristalsis intestinal. El compartimento estromal alberga el andamio de hidrogel 3D sintonizable diseñado para apoyar el crecimiento fisiológico de fibroblastos específicos de tejido. Posee una tapa extraíble que facilita el establecimiento de una interfaz aire-líquido, una condición que permite una mayor emulación de la fisiología humana de los tejidos de la mucosa, así como el acceso directo al tejido para administrar medicamentos directamente sobre la capa epitelial. La Figura Suplementaria 1 captura algunos de los componentes clave del diseño del chip Open-Top, incluidas las dimensiones y los compartimentos biológicos (Figura Suplementaria 1A-D), así como los principales pasos técnicos descritos en este protocolo (Figura Suplementaria 1E).

La perfusión del chip Open-Top se logra con una bomba peristáltica programable (Figura 1D). La configuración de la bomba peristáltica permite que 12 chips descapotables se perfundan simultáneamente. La mayoría de las incubadoras pueden albergar dos configuraciones que permiten el cultivo de hasta 24 chips por incubadora. El estiramiento mecánico se logra utilizando un regulador de presión de vacío programable hecho a medida (Figura 1E). Consiste en un regulador de vacío electroneumático controlado electrónicamente por un convertidor de digital a analógico. En otras palabras, el regulador de vacío electroneumático genera un perfil de vacío sinusoidal con una amplitud y frecuencia que es determinada por el usuario. La deformación cíclica que oscila entre el 0% y el 15% se genera aplicando presión negativa al canal de vacío del chip abierto a una amplitud que varía de 0 a -90 kPa y una frecuencia de 0,2 Hz. Es un sistema hecho a medida equivalente a la unidad de deformación Flexcell disponible comercialmente previamente adoptada y descrita en otros documentos²⁵. Para imitar la deformación mecánica del tejido asociada, por ejemplo, con el movimiento respiratorio del pulmón o el peristaltismo del intestino, el actuador neumático aplica ondas sinusoidales de vacío / deformación cuya magnitud y amplitud se pueden ajustar para que coincidan con el nivel fisiológico de tensión y frecuencia que experimentan las células humanas en su tejido nativo.

Aquí, describimos un método eficiente y reproducible para diseñar y cultivar equivalentes de epitelio organotípico en una plataforma prototipo de chip Open-Top. Permite la generación de modelos de órganos complejos como piel, alvéolos, vías respiratorias y colon al tiempo que integra un flujo de fluido vascular y estiramiento mecánico. Describiremos los aspectos técnicos clave que deben considerarse al implementar los principios de la ingeniería de tejidos para generar modelos epiteliales complejos. Discutiremos las ventajas y posibles limitaciones del diseño actual.

Una visión general de los principales pasos utilizados para lograr la maduración de tejidos y órganos, incluidos los parámetros de flujo y estiramiento, se informa en: Figura 2 para la piel, Figura 3 para el alvéolo, Figura 4 para las vías respiratorias y Figura 5 para el intestino. En las tablas suplementarias se incluye información adicional sobre la composición de los medios y los reactivos utilizados para el cultivo de los diferentes modelos de órganos (Tabla suplementaria 1 para la piel; Tabla complementaria 2 para el alvéolo; Tabla complementaria 3 para la vía aérea y Tabla complementaria 4 para el intestino).

Protocol

Los colonoides humanos se obtuvieron de resecciones intestinales de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Bioseguridad del Hospital de Niños de Cincinnati (IBC 2017-2011).

1. Activación de superficie

1. Preparación del búfer de activación
   1. Coloque el reticulante y los reactivos tampón del disolvente debajo del gabinete de bioseguridad (BSC) y déjelos equilibrarse a temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos antes de su uso.
   2. Reconstituya 5 mg de reticulante en 5 ml del tampón disolvente utilizando un recipiente estéril impermeable a la luz o un tubo cónico transparente de 15 ml envuelto en papel de aluminio para proteger la solución de reticulación de la exposición directa a la luz.
   3. Realice un vórtice de la solución durante 1 minuto para eliminar todos los grumos y, a continuación, pipete 50 μL de la solución reticulante directamente en el canal inferior del chip y 150 μL en la cámara abierta.
   4. Retire cualquier exceso de solución de reticulación de la superficie del chip con un aspirador. A continuación, pipetear 50 μL adicionales de la solución de reticulación directamente en el canal inferior del chip y 150 μL en la cámara superior abierta para eliminar cualquier burbuja de aire restante.
2. Activación con máquina de reticulación UV
   1. Retire suavemente la tapa del chip debajo del BSC y guárdela en un recipiente estéril.
   2. Transfiera las virutas que contienen la solución de reticulación a una placa de Petri, cierre la placa de Petri para evitar la contaminación y coloque la placa con las virutas debajo de la máquina de reticulación UV.
      NOTA: Retire la tapa de la placa de Petri para maximizar la exposición a los rayos UV.
   3. Ajuste la máquina de reticulación UV con una longitud de onda máxima de 365 nm a una intensidad de 100 μJ/cm², y encienda la luz UV durante 20 min.
      NOTA: Después de 20 minutos de tratamiento UV, la solución de reticulación se verá más oscura (marrón).
   4. Vuelva a colocar las virutas bajo el BSC y aspire la solución reticulante oxidada. Luego, enjuague todas las virutas tres veces con el tampón del solvente y deje que las virutas se sequen debajo del BSC durante 5-10 minutos para completar la funcionalización química de la superficie del polidimetilsiloxano (PDMS).

2. Preparación del equivalente del estroma

1. Preparación de tampón de reconstrucción 10x (100 mL)
   1. Disolver 2,2 g de bicarbonato de sodio en 75 mL de NaOH 0,067 M en agua de doble destilación.
   2. Añadir 4,76 g de HEPES y llevar el volumen a 100 mL con agua destilada doble.
   3. Filtrar estéril la solución bajo el BSC utilizando un filtro estéril desechable con tapa de botella con una membrana de 0,22 μm.
      NOTA: La solución es estable durante unos 6 meses cuando se almacena a 4 °C.
2. Estimación del volumen de la solución pre-gel
   1. Multiplique el número de chips necesarios para el experimento por 150 μL (volumen interno de la cámara central abierta) para estimar la cantidad de solución de pregel requerida para el experimento:
      Volumen necesario = (Número de fichas x 150) μL
   2. Preparar la solución de colágeno pre-gel en hielo mezclando: 1 volumen de 10x EMEM que contenga las células de elección, 1 volumen de tampón de reconstrucción 10x (ver paso 2.1), 8 volúmenes de solución de colágeno I (10 mg/ml) y 1 μL de solución de NaOH de 1 N por cada mg de colágeno I.
      NOTA: Se recomienda preparar un volumen adicional de +15% para tener en cuenta los errores experimentales; El ejemplo descrito en la sección 2.2 proporciona un procedimiento detallado paso a paso para preparar suficiente solución de pre-gel para 12 chips y un volumen adicional del 15%.
3. Preparación de solución pre-gel para el equivalente de estroma (para 12 chips)
   1. Llevar las siguientes soluciones bajo el BSC sobre hielo: 10x EMEM; 10x Búfer de reconstrucción (consulte el paso 2.1); Solución de colágeno I (10 mg/ml); y solución estéril de NaOH 1 N.
   2. Cultive células mesenquimales específicas del tejido según las indicaciones de los proveedores hasta un 80% -90% de confluentidad, y luego disocie las células usando tripsina u otros métodos recomendados por el proveedor de células. Recoger las células en un pellet por centrifugación a 250 x g durante 5 min a 24 °C.
   3. Resuspender el pellet celular en 225 μL de EMEM 10x helado y añadir 225 μL de tampón de reconstrucción 10x helado (ver paso 2.1). Mezcle la solución pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, y luego agregue 1,800 μL de solución de colágeno I helada.
   4. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 5-6 veces, evitando burbujas para mezclar la solución de pre-gel mientras está en hielo.
4. Incorporación del equivalente de estroma en chip (para 12 chips)
   1. Neutralizar la solución pre-gel con 18 μL de NaOH 1 N. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5-6 veces, y luego pipetear 150 μL de hidrogel cargado de células en la cámara central del chip abierto evitando burbujas.
      NOTA: Si se requiere micropatrones, pase al siguiente paso (sección 3).
   2. Agrupe las virutas en placas de Petri separadas, incluida una tapa de tubo de centrífuga llena con 2 ml de ddH₂O estéril en cada placa de Petri, e incube las placas de Petri en la incubadora a 37 °C, 5% de_CO2.
      NOTA: Después de 90 min, el hidrogel cargado de células se polimerizará por completo.

3. Micropatrón de superficie (opcional)

1. Realice el micropatrón superficial del hidrogel estromal después de pipetear el hidrogel de colágeno neutralizado (aún en su estado líquido) utilizando sellos impresos en 3D.
   NOTA: Los sellos impresos en 3D se pueden obtener en varios diseños personalizables, como se describió anteriormente en otra parte²⁴.
2. Pipetear 20 μL de la solución de pregel de colágeno I neutralizado en la superficie estampada de un sello estéril impreso en 3D e insertar el sello dentro (en la parte superior) de la cámara abierta mientras el hidrogel estromal todavía está en forma líquida.
3. Retire cualquier residuo del hidrogel que pueda derramarse de la parte superior de la cámara superior abierta con un aspirador (o una pipeta). Agrupe todas las fichas en placas de Petri separadas e incluya una tapa de tubo cónico de 15 ml de centrífuga llena con 2 ml de ddH₂O estéril en cada placa de Petri.
4. Incubar todas las placas de Petri a 37 °C, 5% de_CO2 durante 90 min, y luego volver a colocar las virutas debajo del BSC y retirar suavemente los sellos con pinzas de precisión para reducir el riesgo de dañar el hidrogel.

4. Recubrimiento de la superficie epitelial y vascular con proteínas ECM específicas del tejido

1. Revestir la cámara microfluídica vascular con proteínas de la matriz extracelular
   1. Multiplique el número de chips necesarios para el experimento por 20 μL (volumen del canal vascular) para estimar el volumen de solución de recubrimiento de ECM vascular requerida para el experimento:
      Volumen necesario = (Número de fichas x 20) μL
      NOTA: Se recomienda preparar un volumen adicional del 15% para tener en cuenta los errores experimentales.
   2. Prepare la solución de recubrimiento ECM vascular para todos los chips (por ejemplo, 300 μL por 12 chips) utilizando PBS o HBSS helados.
      NOTA: Consulte la tabla específica de protocolo de órganos en la sección de materiales suplementarios (Tabla suplementaria 1 para la piel; Tabla complementaria 2 para el alvéolo; Tabla complementaria 2 para la vía aérea y Tabla complementaria 4 para el intestino) para identificar los reactivos específicos y la composición recomendada de la MEC.
   3. Pipetear 20 μL de solución de recubrimiento de ECM vascular en el canal vascular de cada chip.
2. Recubriendo la superficie apical del equivalente estromal con proteínas de la matriz extracelular
   1. Multiplique el número de chips necesarios para el experimento por 50 μL (volumen del canal vascular) para estimar el volumen de solución de recubrimiento ECM epitelial requerida para el experimento:
      Volumen necesario = (Número de fichas x 50) μL
      NOTA: se recomienda preparar un volumen adicional del 15% para tener en cuenta los errores experimentales.
   2. Prepare suficiente solución de recubrimiento ECM para todos los chips (por ejemplo, 750 μL por 12 chips) en PBS o HBSS helados y transfiera 50 μL de solución de recubrimiento ECM epitelial directamente sobre la superficie del hidrogel.
      NOTA: Consulte la tabla específica de protocolo de órganos en la sección de materiales suplementarios (Tabla suplementaria 1 para la piel; Tabla complementaria 2 para el alvéolo; Tabla complementaria 2 para la vía aérea y Tabla complementaria 4 para el intestino) para identificar los reactivos específicos y la composición recomendada de la MEC.
   3. Agrupe las astillas en placas de Petri separadas, incluida una tapa de tubo cónico de 15 ml de centrífuga llena con 2 ml de ddH 2 O estéril en cada placa de Petri, e incube las placas de Petri en la incubadora a 37 °C, 5% de_CO2 durante₂h antes de proceder con la siembra de células epiteliales.

5. Siembra de células epiteliales en el equivalente estromal

1. Cultivo de células epiteliales
   1. Cultivar células epiteliales específicas del tejido según las indicaciones de los proveedores hasta un 80% -90% de confluente.
   2. Disociar las células utilizando procedimientos enzimáticos proteolíticos según lo recomendado por el proveedor de células.
      NOTA: Para obtener los mejores resultados, recolecte células epiteliales de paso bajo (P1-P2) durante la fase de crecimiento activo cuando alcancen entre 70% -90% de confluencia.
   3. Una vez disociadas, centrifugar las células y recogerlas en forma de pellet.
   4. Resuspender las células epiteliales a la densidad de célula/fragmento apropiada como se indica en la tabla de protocolo de órgano específico.
      NOTA: En este estudio, la solución celular se utilizó a una densidad de 3 x 10 6 células/ml para la piel, 1 x 10 6 células/ml para el alvéolo, 6 x 10 6 células/ml para la vía aérea y 8 x 10 ⁶ fragmentos/ml para el intestino.
2. Siembra de células epiteliales
   1. Transfiera los chips de la incubadora al BSC. Aspirar la solución de recubrimiento del canal vascular y enjuagar el canal microfluídico vascular tres veces con 50 μL de medio de cultivo de células endoteliales frescas.
   2. Aspirar la solución de recubrimiento de la superficie del hidrogel y enjuagar la superficie estromal tres veces con 100 μL de medio de cultivo de células epiteliales frescas para eliminar cualquier exceso de solución de recubrimiento.
   3. Aspirar el medio ascendente y sembrar la superficie del hidrogel con 50 μL de la suspensión de células epiteliales utilizando la densidad celular adecuada, como se indica en las tablas suplementarias, y luego transferir las virutas de nuevo a la incubadora durante 2 h (o durante la noche para los colonoides).
   4. Enjuague suavemente la superficie del hidrogel con el medio de cultivo celular dos veces para eliminar los restos celulares. Finalmente, refresque el medio en autoclave en recipientes sellados en autoclave y conecte los chips a la bomba peristáltica.

6. Conectar chips al flujo

1. Preparación de las partes fluídicas
   1. Corte 2 pulgadas de tubo de transferencia de elastómero termoplástico (TPE) a base de polipropileno biocompatible (Tabla de materiales) para preparar el tubo microfluídico corto que se requiere para conectar los chips a los depósitos de medios.
   2. Corte 7.5 pulgadas de tubo de transferencia de TPE biocompatible para producir el tubo microfluídico largo.
   3. Prepare suficientes conectores metálicos de 18 G y 19 G (Tabla de materiales).
      NOTA: Se recomienda preparar y esterilizar los tubos y conectores descritos en los pasos 6.1.1 y 6.1.2 al menos 1 día antes de conectar los chips descapotables a las bombas peristálticas.
   4. Perfore la tapa de cada reservorio mediano con una aguja hipodérmica de 4 pulgadas (Tabla de materiales).
2. Desgasificación media
   1. Permita que el medio de cultivo celular se equilibre a temperatura ambiente (RT).
   2. Transfiera el volumen de medio necesario a un tubo filtrante cónico.
   3. Aplique una presión de vacío negativa de -20 PSI para desgasificar el medio (filtración accionada por vacío).
      NOTA: Si no se dispone de un vacío, el medio de cultivo celular se puede dejar equilibrar en la incubadora durante la noche para lograr resultados similares.
3. Prepare el chip abierto para el flujo de fluido
   1. Coloque las virutas y las partes fluidas estériles debajo del BSC y alinee la tapa (parte superior) del chip abierto para sellar el prototipo de chip abierto antes de comenzar el flujo de fluido.
   2. Pipetear 200 μL del medio de cultivo celular desgasificado (ver tablas específicas de órganos) en el puerto de entrada de los canales superior e inferior del chip mientras se presta atención para evitar burbujas.
   3. Pipetear 300 μL del medio de cultivo en el tubo microfluídico corto para cebar la superficie interna de los tubos y conectar el tubo corto a las entradas de los canales superior e inferior del chip.
4. Conectar y cebar las superficies microfluídicas
   1. Coloque los depósitos medianos en el estante de la granja, conecte la aguja hipodérmica a la entrada inferior de las virutas y, finalmente, coloque todas las virutas en el soporte de la carcasa dentro de la incubadora.
   2. Conecte los chips a la bomba peristáltica y luego inspeccione todos los conectores para asegurarse de que todos los chips estén conectados correctamente y que no haya fugas visibles de medios de cultivo celular.
   3. Use el botón de purga de la bomba y manténgalo presionado durante unos 15 s o hasta que aparezcan las gotas del medio de cultivo celular al final del tubo de salida.
   4. Utilice el sistema de control de la bomba para ajustar el caudal de chip de órgano adecuado (Figura 2, Figura 3, Figura 4 y Figura 5).

7. Mantenimiento de chips

1. Mantenimiento de chips de órganos
   1. Preparar el medio de cultivo celular fresco para el epitelio y/o endotelio y realizar los pasos de desgasificación (como se describió anteriormente en el paso 6.2).
   2. Pause la bomba peristáltica, desconecte cuidadosamente los chips de la bomba y extraiga los soportes de la carcasa del chip. Transfiera los chips de la incubadora al BSC y retire el volumen de medios que quedan en los depósitos.
   3. Reemplace los medios de cultivo celular en los depósitos de entrada superior e inferior con 5 ml de medios de cultivo celular frescos y vuelva a colocar los portadores de la carcasa del chip en la incubadora. Conecte los chips a la bomba peristáltica y reinicie el flujo.
      NOTA: Se recomienda utilizar la función de purga para actualizar rápidamente el medio al compartimiento vascular y reducir el riesgo de burbujas de aire.
   4. Repita los pasos 7.1.1-7.1.3 cada dos días, como se indica en la Figura 2, Figura 3, Figura 4 y Figura 5.
2. Establecimiento de la interfaz aire-líquido (ALI)
   1. Pause la bomba peristáltica, desconecte cuidadosamente los chips de la bomba y extraiga los soportes de la carcasa del chip. Transfiera las virutas de la incubadora al gabinete de bioseguridad y retire el volumen de medio que queda en el depósito superior.
   2. Aspire suavemente todo el medio desde el canal microfluídico superior y sujete el tubo microfluídico corto conectado a las entradas superiores utilizando clips aglutinantes para reducir la evaporación del medio y el mantenimiento de ALI.
   3. Coloque el chip abierto en el(los) soporte(s) de carcasa de nuevo en la incubadora y vuelva a conectar los chips a la bomba peristáltica.
      NOTA: Se recomienda utilizar la función de purga para actualizar rápidamente el medio al compartimiento vascular y reducir el riesgo de burbujas de aire.
   4. Reanude el flujo iniciando la bomba peristáltica.
3. Estiramiento (opcional)
   1. Haga una pausa en la bomba peristáltica y conecte los puertos de vacío de los chips al módulo de vacío utilizando dos tubos microfluídicos largos por chip.
   2. Utilice el módulo de vacío para ajustar el ajuste de estiramiento a la condición recomendada para cada órgano como se especifica dentro de las tablas de protocolo de órganos: Tabla suplementaria 1 para la piel; Tabla complementaria 2 para el alvéolo; Tabla complementaria 2 para la vía aérea; y Tabla suplementaria 4 para el intestino.
   3. Inspeccione visualmente las conexiones de los tubos para asegurarse de que todos los chips estén conectados correctamente y que no haya gotas visibles de goteo medio.
   4. Reanude el flujo iniciando la bomba peristáltica.

8. Siembra de células endoteliales en el compartimento vascular

1. Preparar células y chips para la siembra de células vasculares
   1. Cultive las células endoteliales específicas del tejido según las indicaciones de los proveedores hasta el 80% -90% confluente. Disociar las células mediante un procedimiento enzimático proteolítico (según lo recomendado por el proveedor) y, finalmente, resuspender las células endoteliales en una solución de 3 x 10⁶ células/ml.
      NOTA: Para obtener los mejores resultados, cosechar las células endoteliales a paso bajo (P2-P4) durante la fase de crecimiento activo cuando alcanzan entre 70% -90% de confluencia.
   2. Pausa la bomba peristáltica. Transfiera los chips de la incubadora al BSC, desconecte los chips de los depósitos de medios y cualquier tubo conectado, y luego agrupe los chips en placas de Petri separadas.
   3. Refrescar el medio de cultivo celular del compartimento epitelial con un nuevo medio de cultivo de células epiteliales. Enjuague el canal vascular con un medio de cultivo de células endoteliales frescas dos veces y luego aspire el medio del compartimiento vascular.
2. Siembra de células endoteliales
   1. Sembrar el canal inferior (vascular) con 25 μL de suspensión de células endoteliales (3 x 10⁶ células/ml), voltear los chips boca abajo para permitir que las células endoteliales se adhieran a la superficie superior de la cámara microfluídica.
      NOTA: Añadir 50 μL de la suspensión celular por chip (600 μL por 12 chips).
   2. Agrupe las fichas en placas de Petri. Colóquelos de nuevo en la incubadora a 37 °C, 5% de_CO2, y deje que las células endoteliales se adhieran durante 1 h.
   3. Después de 1 h, transfiera los chips de la incubadora al BSC. Enjuague el canal vascular con medio de cultivo de células endoteliales dos veces para eliminar los desechos celulares.
   4. Repita los pasos 8.2.1-8.2.2 para sembrar el canal vascular una vez más con células endoteliales y coloque las astillas planas para facilitar la adhesión de las células endoteliales a la superficie inferior del canal vascular.
3. Vuelva a conectar el chip para que fluya
   1. Llenar el reservorio del medio vascular con el medio de cultivo celular vascular desgasificado bajo el BSC.
   2. Vuelva a colocar los chips dentro de la(s) portadora(s) de la carcasa del chip y vuelva a conectar los chips a los depósitos medianos en un extremo a la bomba peristáltica en el otro extremo.
      NOTA: Se recomienda utilizar la función de purga para actualizar rápidamente el medio al compartimiento vascular y reducir el riesgo de burbujas de aire.
   3. Inspeccione visualmente las conexiones microfluídicas para asegurarse de que todos los chips estén conectados correctamente y que no haya gotas visibles de goteo medio. Luego, reanude el flujo de fluido iniciando la bomba peristáltica.

9. Ensayos comunes de punto final

1. Desconectar chips para ensayos de punto final
   1. Pause la bomba peristáltica, desconecte cuidadosamente los chips de la bomba y extraiga los soportes de la carcasa del chip. Transfiera los portadores de la carcasa del chip de la incubadora al BSC y libere los chips.
   2. Lave suavemente la cámara central del chip abierto con el medio de cultivo de células epiteliales y el canal vascular con el medio de cultivo de endotelio dos veces para eliminar cualquier residuo celular.
   3. Retire la tapa del chip abierto para acceder al compartimento apical del chip con pinzas.
2. Inmunotinción para microscopía de fluorescencia
   1. Proceda con la fijación, permeabilización y bloqueo convencional de la muestra.
      NOTA: En este estudio, las muestras se fijaron en 200 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) durante 1 h, seguido de enjuague con PBS, permeabilización en Triton X-100 al 0,1% durante 40 min y bloqueo en albúmina sérica bovina al 1% durante 1 h.
   2. Incubar los chips con anticuerpos primarios (Tabla de materiales) a 4 °C durante la noche. y luego lavar los compartimentos epitelial y endotelial de los chips con 200 μL de PBS dos veces. Luego, proceda con los anticuerpos secundarios apropiados durante 2 h.
      NOTA: Diluir los anticuerpos primarios y secundarios en PBS + 1% BSA a una dilución de 1:100 (anticuerpo primario) y 1:200 (anticuerpo secundario).
3. Inmunohistoquímica
   1. Extraiga los equivalentes estromales de la cámara principal del chip Open-Top con pinzas, recójalos en un tubo de 1,5 ml lleno de formalina tamponada neutra al 10% e incube durante al menos 24 h.
   2. Transfiera el equivalente estromal fijo al procesador de tejido y siga los pasos a continuación para lograr una deshidratación óptima de la muestra.
      1. Sumergir el hidrogel en etanol al 70% durante 90 min.
      2. Retire el etanol al 70% y sumerja el hidrogel en etanol al 80% durante 90 min.
      3. Retire el etanol al 80% y sumerja el hidrogel en etanol al 95% durante 90 min.
      4. Retire el etanol al 95% y sumerja el hidrogel en etanol al 100% durante 90 minutos dos veces.
      5. Retire el etanol al 100% y sumerja el hidrogel en una solución de xileno durante 120 minutos dos veces.
      6. Retire la solución de xileno e infiltre los equivalentes estromales procesados en cera de parafina durante 120 minutos (~ 2 h) dos veces.
   3. Incruste los equivalentes estromales infiltrados en bloques de parafina seccionados.
   4. En este punto, los equivalentes estromales pueden ser seccionados como bloques de parafina utilizando un micrótomo y procesados de acuerdo con las técnicas histológicas convencionales²⁶.

Results

Micropatrones superficiales
El micropatrón de la matriz extracelular (ECM) se puede utilizar para replicar la configuración espacial de la interfaz de la cripta intestinal. La configuración del chip abierto se puede modificar para integrar sellos micropatronados diseñados específicamente para imitar la topografía natural de la interfaz epitelio-estroma colónico (Figura 6A, B) y las criptas intestinales a escala micrométrica (Figura 6C...

Discussion

El chip Open-Top representa una plataforma habilitadora para investigar la compleja interacción celular que ocurre entre el endotelio, el estroma y el epitelio en un microambiente controlado, en tiempo real. Esta tecnología ofrece ventajas críticas sobre los cultivos organotípicos y organoides convencionales, como la integración de señales físicas y bioquímicas que son relevantes para reconstituir el microambiente del tejido humano, incluido el cizallamiento fluídico (flujo), el estiramiento cíclico y la reconstrucción d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x EMEM	Lonza	12-684F	Medio; Stroma
Aguja de calibre 18	MicroGroup	316H18RW	Tubo de acero inoxidable 316 soldado, 18RW Full Hard
Aguja de calibre 19	MicroGroup	316H19RW	Tubo de acero inoxidable 316 soldado, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT	Cole-Palmer	EW-95723-12	Tubo, 0.25 mm, 12/paquete
70% etanol y toallitas	-	-	Para la esterilización de superficies
8-Bromoadenosina 3′,5′-sal sódica monofosfato cíclico (8-Br-cAMP)	Sigma	B7880	Suplemento medio
A-83-01	Tocris	2939
Adenina	Sigma	A9795
DMEM / F12	Células
de las vías respiratorias Tecnología	celda Lifeline	FC-0016
Papel de aluminio	-	-	-
Células alveolares	Cell Biologics	H6621
Anti-ABCA3	ABCAM	AB24751	Anticuerpo monoclonal de ratón [3C9]
Anti-Acuaporina5 Alexa Fluor 647	ABCAM	AB215225	Anticuerpo monoclonal de conejo [EPR3747]
Anti-Acuaporina5	ABCAM	AB92320	Anticuerpo monoclonal de conejo [EPR3747]
Tubulina intravenosa anti-beta	ABCAM	AB11315	Anticuerpo monoclonal de ratón [ONS.1A6]
Anti-CD31 (PECAM-1)	ABCAM	ab9498	Anticuerpo monoclonal de ratón [JC/70A]
Anti-CK5	ABCAM	AB75869	Monoclonal recombinante de conejo [AY1E6]
Anti-Citoqueratina 10	ThermoFisher	MA5-13705	Anticuerpo monoclonal de ratón (DE-K10)
Anti-Citoqueratina 14	ABCAM	AB7800	Anticuerpo monoclonal de ratón
Anti-E-Cadherin	ABCAM	AB1416	Anticuerpo monoclonal de ratón
Anti-Filaggrin	ThermoFisher	PA5-79267	Anticuerpo policlonal de conejo
Anti-HTI-56	Terraza Biotech	TB-29AHT1-56	Anticuerpo monoclonal de ratón (IgG1)
Anti-HTII-280	Terraza Biotech	TB-27AHT2-280	Anticuerpo monoclonal de ratón (IgM)
Anti-Involucrin	ThermoFisher	MA5-11803	Anticuerpo monoclonal de ratón (SY5)
Anti-isoformas TA p63-α, -β, -γ	Biolengend	618902	Anticuerpo policlonal de conejo
Anti-Ki67	ABCAM	AB8191	Anticuerpo monoclonal de ratón [B126.1]
Anti-LAMP3	ABCAM	AB111090	Anticuerpo policlonal de conejo
Anti-Maduro SP-B	Siete Colinas	WRAB-48604	Anticuerpo policlonal de conejo
Anti-MUC5AC	ThermoFisher	PA5-34612	Anticuerpo policlonal de conejo
Anti-Mucina-2	SantaCruz Biotechnology	sc-7314	Anticuerpo monoclonal de ratón (IgG1)
Anti-p63	Dako	GA662	Anticuerpo monoclonal de ratón p63 Proteína (Dako Omnis)  Clonar DAK-p63
Anti-PCNA	ThermoFisher	PA5-32541	Anticuerpo policlonal de conejo
Anti-Podoplanin (AT-1α)	ABCAM	AB128994	Anticuerpo policlonal de conejo
Anti-Pro + Proteína Surfactante Madura B	ABCAM	AB40876	Anticuerpo policlonal de conejo
Anti-Surfactante C	Siete Colinas	WRAB-9337	Anticuerpo policlonal de conejo
Anti-Uteroglobina/SCGB1A1	Hycult Biotech	HM2178	Anticuerpo monoclonal de ratón [AY1E6]
Anti-VE-cadherina	ABCAM	AB33168	Anticuerpo policlonal de conejo
Anti-ZO-1	ThermoFisher	33-9100	Anticuerpo monoclonal de ratón [1A12]
Ácido ascórbico	Sigma	A4544
Pipetas de aspiración	Corning / Halcón	357558	2 mL, poliestireno, envuelto individualmente;
Puntas de aspiración	-	-	Estéril (esterilizado en autoclave)
B27	Thermo	17504044
Blocker BSA (10X) en solución PBS	ThermoFisher	37525	Agente bloqueador
Cloruro de Calcio	Sigma	C7902
CHIR 99021	Tocris	4423
Colágeno I Biomatrix	Avanzado	5133	10 mg/mL (Estroma)
Colágeno I	Advanced BioMatrix	5005	3 mg/mL (ECM vascular)
Colágeno IV	Sigma	C5533
Colágeno-IV	Sigma	C5533-5MG	Colágeno de placenta humana, 5 mg en polvo, reconstituido a 1 mg/mL
Fibroblastos colónicos	Productos biológicos celulares	H6231
Células endoteliales microvasculares colónicas	Productos biológicos celulares	H6203
Tubos cónicos	-	-	15 mL y 50 mL  polipropileno, estéril
Reticulante (ER-1)	Emular	10461	5 mg en polvo
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, dilactato)	ThermoFisher	D3571	Sonda de ADN
Fibroblastos dérmicos	ATCC	PCS-201-010
Células endoteliales microvasculares dérmicas	ATCC	CRL-3243
Dexametasona	Sigma	D4902
DMEM	ThermoFisher	11054020
DMEM/F-12	GIBCO
DMEM/F-12, GlutaMAX	GIBCO	10565-018 y nbsp;	Medio basal para medio ALI
Burro Anti-Ratón IgG H& L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	AB150105	Anticuerpo secundario Donkey Anti-Mouse
Burro Anti-Ratón IgG H& L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	AB175472	Anticuerpo secundario Donkey Anti-Mouse
Burro Anti-Ratón IgG H& L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	AB150107	Anticuerpo secundario Donkey Anti-Mouse
Burro Anti-Conejo IgG H& L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	AB150073	Anticuerpo secundario Donkey Anti-Mouse
Burro Anti-Conejo IgG H& L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	AB175470	Anticuerpo secundario Donkey Anti-Mouse
Burro Anti-Conejo IgG H& L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	AB150075	Anticuerpo secundario Donkey Anti-Mouse
Dulbecco' s PBS (DPBS-/-) (sin Ca2+, Mg2+)	Corning	21-031-CV	1x
Factor de crecimiento epidérmico (EGF) humano, recombinante en E. coli	PromoCell	C-60170	Suplemento medio
F-12 Ham' s	Invitrogen	21700-108	Para ECM vascular
FibriCol	BioMatrix Avanzado	5133-20ML	Solución de colágeno I (10 mg/mL)
Fibronectina	Corning	356008
Fibronectina, Humana, Natural,	Corning	47743-654 y 4774	fibronectina de plasma humano
Pinzas de precisión de punta fina	Aven	18056USA	Pinzas de acero inoxidable de precisión Technik Style 5B-SA
Glutamax	Invitrogen	21700-108
Glutamax	Invitrogen
Cabra Anti-Ratón IgG H& L (Alexa Fluor 594)	ABCAM	AB150080	Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra
Cabra Anti-Ratón IgG H& L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	AB150115	Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra
Cabra Anti-Ratón IgG H& L (FITC)	ABCAM	AB6785	Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra
Cabra Anti-Ratón IgG1 Alexa Fluor 568	ThermoFisher	A-21124	Anticuerpo secundario IgG1 anti-ratón de cabra
Cabra Anti-Ratón IgM Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21042	Anticuerpo secundario IgM anti-ratón de cabra
Aspirador de vacío de mano	Corning	4930 y 4930	-
Suero HyClone FetalClone II Inactivado por Calor (FCS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30066.03
Hemocitómetro	-	-	-
Heparina sal sódica de la mucosa intestinal porcina	Sigma	H3149
HEPES	Thermo 15630080
Human [Leu15] - Gastrin	Sigma	G9145
Colonoides humanos	Obtenidos de resecciones		Obtenidos de resecciones clínicas
Proteína recombinante de EGF humano	Factor de
	Termo
HyClone FetalClone II Serum (EE. UU.)	GE Cuidado de la salud	SH30066.02HI	FBS estéril  inactivado por calor
Hidrocortisona 21-hemisuccinato sal sódica	Sigma	H4881
Hidrocortisona	PromoCell	C-64420 y nbsp;	Suplemento medio
Cubo de hielo	-	-	-
Ismatec IPC-N	Cole-Palmer	EW-78000-41	Bomba peristáltica digital de baja velocidad; q24 canales (1 por 12 chips)
ITES	BioWhittaker	17-839Z
Factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), también conocido como factor de crecimiento básico de fibroblastos 7 (FGF-7), humano, recombinante en HEK	PromoCell	C-63821
Queratinocitos	ATCC	PCS-200-010
Laminin	Biolamina	CT521-0501
Laminina, 521 CTG (CT521)	Biolamina	CT521-0501	laminina recombinante humana 521
Células de fibroblastos pulmonares	Biologics	H6013
Fibroblastos pulmonares	Lifeline Cell Technology	FC-0049
Células endoteliales microvasculares pulmonares	Lonza	CC-2527
Células musculares lisas pulmonares	Lifeline Cell Technology	FC-0046
Contador manual	-	-	-
Tubo de transferencia Masterflex (TPE)	Cole-Palmer	FV-96880-02	PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Medio 199, sin rojo fenol	Thermo
Tubo de microcentrífuga	-	-	1,5 mL, estéril
Microscopio (con cámara)	-	-	Para imágenes de campo claro
N2	Sigma	17502001
N-acetilcisteína	Sigma	A5099
Noggin (medio HEK293T acondicionado)	Sigma	N17001
Suero de cabra normal	ThermoFisher	50062Z	Solución de bloqueo
O-fosfosestriletanolamina	Sigma	P0503
Paraformaldehído (4% en peso/vol)	EMS	15710	Agente de fijación
Penicilina Estreptomicina	GIBCO 15140122
Penicilina-estreptomicina	Sigma	P4333	10,000 U/mL; 10 mg/mL
Puntas de pipeta	-	-	P20, P200 y P1000  Pipeta estéril de baja adherencia
	Gilson	F167380	P20, P200 y P1000
Reemplazo de suero PluriQ (o alternativamente reemplazo de suero KO)	AMSBIO (o Thermo)	N/A (o C1910828010)
Portaobjetos de vidrio recubiertos de poli-L-lisina	Sigma	P0425	Toboganes de vidrio
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
Progesterona	Sigma	P8783
ProLong Gold	ThermoFisher	P36931	Montaje antidecoloración con DAPI
Ácido retinoico	Sigma	R2625
Inhibidor de ROCK (Y27632)	Tocris	TB1254-GMP/10
R-espondina (medio HEK293T acondicionado)	Sigma	SCC111
SAGM SingleQuots suplementos	Lonza	CC-4124
SAGMTM Vía Aérea Pequeña Medio de Crecimiento de Células Epiteliales BulletKitTM	Lonza	CC-4124 y nbsp;	Suplementos medianos
SB2001190	Tocris	1264/10
Pipetas serológicas	-	-	2 mL, 5 mL, 10 mL y 25 mL de endotoxinas bajas, estériles
Medio de crecimiento de células epiteliales de las vías respiratorias pequeñas (SAGM)	Lonza	CC-4124 y nbsp;
Tampón solvente (ER-2)	Emular	10462	Frasco de 25 mL
Steriflip-HV	Millipore	SE1M003M00	Tubo cónico filtrante estéril
Sterilin 100 mm Placas de Petri cuadradas	Thermo	103	Estéril, 1 por cada 6 virutas
Frascos T25	-	-	-
Frascos T75	-	-	-
Tri-yodotironina	Sigma	T5516
Triton X-100 (0,3% (vol/vol)	Sigma	T8787	Agente de permeabilización
Azul de tripán	Sigma	93595	Solución al 0,4%
Solución TrypEE	Sigma	12604013	Solución de desconexión de celdas
PREADOLESCENTE-20	Sigma	P2287	Agente de permeabilización
Horno de luz ultravioleta (frecuencia máxima de 365 nm, intensidad de 100 y micro; J/cm2)	VWR	21474-598	UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Modelo CL-1000L
Configuración de vacío	-	-	Presión mínima: -70 kPa
Factor de Crecimiento Endotelial Vascular 165 (VEGF-165) humano, recombinante en E. coli	PromoCell	C-64420
VEGF-165	PromoCell	C-64420 y nbsp;	Suplemento medio
Factor de Von Willebrand conjugado FITC	ABCAM	ab8822	Anticuerpo policlonal de ovejas
Baño de agua (o perlas)	-	-	Establézcalo en 37 ° C
Wnt3A (medio condicionado L-Wnt3A)	ATCC	CRL-2647