Method Article

Métodos y protocolos para imágenes en vivo en desarrollo

DOI:

10.3791/64642

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January 13th, 2023

1Department of Neurobiology and Department of Neurosurgery of Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Liangzhu Laboratory, MOE Frontier Science Center for Brain Science and Brain-machine Integration, State Key Laboratory of Brain-machine Intelligence, Zhejiang University, 3NHC and CAMS Key Laboratory of Medical Neurobiology, Zhejiang University

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ARTÍCULOS DISCUTIDOS:

Januschke, J., Loyer, N. Aplicaciones de la inmovilización de tejidos de Drosophila con coágulos de fibrina para imágenes en vivo. Revista de Experimentos Visualizados. (166), 10.3791/61954 (2020).

Li, T., Luo, L. Un sistema de explante para estudios de imágenes de lapso de tiempo del ensamblaje de circuitos olfativos en Drosophila. Revista de Experimentos Visualizados. (176), 10.3791/62983 (2021).

Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. Obtención de imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extracción de cráneo y piel. Revista de Experimentos Visualizados. (168), 10.3791/62166 (2021).

Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. Imágenes simultáneas en vivo de múltiples embriones de insectos en microscopios de fluorescencia de lámina de luz basados en cámara de muestra. Revista de Experimentos Visualizados. (163), 10.3791/61713 (2020).

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS imágenes de células vivas durante el desarrollo neuronal. Revista de Experimentos Visualizados. (168), 10.3791/62165 (2021).

Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Imágenes sin etiquetas de la dinámica de almacenamiento de lípidos en Caenorhabditis elegans utilizando microscopía de dispersión Raman estimulada. Revista de Experimentos Visualizados. (171), 10.3791/61870 (2021).

Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Ablaciones de volumen profundas y espacialmente controladas utilizando un microscopio de dos fotones en la gástrula del pez cebra. Revista de Experimentos Visualizados. (173), 10.3791/62815 (2021).

Discussion

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El desarrollo se caracteriza por el cambio dinámico de estructuras a nivel de orgánulos, células y órganos. La capacidad de las imágenes de lapso de tiempo para recopilar información cuatridimensional de la misma estructura en su condición fisiológica la convierte en una técnica ideal para estudiar el proceso dinámico de desarrollo 1,2,3,4,5,6. La gran cantidad de datos recopilados a través de imágenes en vivo también permite el análisis cuantitativo del desarrollo. Aunque las imágenes de lapso de tiempo se han utilizado más ampliamente para el cultivo celular de una sola capa, la obtención de imágenes de tejidos vivos o animales tridimensionales es mucho más desafiante debido a dificultades técnicas, como la dispersión de la luz de los tejidos vivos, el desarrollo de una estrategia de montaje y un método de etiquetado adecuados, el mantenimiento de una condición fisiológica normal durante un período extenso de imágenes, la accesibilidad a un microscopio adecuado, etcetera. Estos desafíos restringen el uso de imágenes en vivo en muchos laboratorios. En esta colección de métodos, siete artículos informaron nuevos métodos de preparación de muestras vivas, etiquetado y manipulación basada en láser. Todos estos métodos facilitan la obtención de imágenes en vivo de los procesos de desarrollo desde diferentes ángulos.

La obtención de imágenes directas de regiones profundas es técnicamente un desafío debido a la fuerte dispersión de tejidos vivos. Esta dispersión puede minimizarse mediante la exposición de los órganos internos a través de la disección, mejorando así la resolución espacial de las imágenes. En esta colección, Januschke y Loyer7 describieron un protocolo para diseccionar cerebros larvales de Drosophila y un método de montaje utilizando coágulos de fibrina. Esta estrategia de montaje permitió obtener imágenes de lapso de tiempo utilizando microscopios invertidos de múltiples muestras en el mismo plato, ya que solo requería la adición de fibrinógeno y trombina. Li y Luo8 presentaron un protocolo para la disección de un explante antena-cerebro de pupas de mosca y una condición de cultivo ex vivo que mantuvo el desarrollo normal del circuito olfativo durante 24 h. Su sistema permitió visualizar la orientación axonal y dendrítica en el ensamblaje de un circuito olfativo de mosca a partir de su condición fisiológica. Este sistema de explante es adecuado para microscopios de dos fotones y microscopios de hoja de luz de celosía con imágenes basadas en óptica adaptativa, lo que permite obtener imágenes continuas a largo plazo y obtener imágenes rápidas con alta resolución espaciotemporal en un corto período de tiempo. Schramm et al.9 desarrollaron un procedimiento quirúrgico mínimamente invasivo para eliminar la piel y el cartílago blando del cráneo del pez cebra mediante micropeeling. Esto les permitió observar algunos eventos clave en etapas posteriores del desarrollo, incluida la diferenciación neuronal, la maduración, la plasticidad y el transitorio de Ca2+ hasta 30 días después de la fertilización. También les permitió realizar imágenes en vivo después de la pigmentación de las pieles de las larvas de pez cebra. Además de la disección, el montaje adecuado de las muestras también es crucial para la obtención de imágenes en vivo. Ratke et al.10 presentaron un marco experimental para la obtención simultánea de imágenes en vivo de múltiples embriones de mosca utilizando microscopía de hoja de luz. Este protocolo aumentó el rendimiento general y es ideal para estudios comparativos.

Además de la preparación de muestras, los nuevos métodos de etiquetado facilitan la visualización de estructuras específicas en tejidos vivos. Terzi et al.11 informaron de un biosensor específico de H2O2 codificado genéticamente, roGFP2-Orp1, para obtener imágenes de los niveles intracelulares de H2O2 de neuronas de pez cebra cultivadas y larvas enteras durante el desarrollo. Una ventaja importante de este biosensor de H2O2 codificado genéticamente fue la mejora de la resolución temporal y espacial de la detección de H2O2 . Otro estudio de Mutlu et al.12 describió la microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS), un método de imagen química sin etiquetas para la detección rápida y cuantitativa de lípidos en células vivas con una resolución subcelular. Tanto el H2O2 como los lípidos se pierden fácilmente durante la fijación de la muestra. El desarrollo de métodos de etiquetado o imágenes en tejido vivo no solo eludió este desafío, sino que también retuvo información espacial y temporal de estas estructuras en procesos biológicos.

Finalmente, la luz también se puede utilizar para la ablación celular. Boutillon et al.13 mostraron un método para ablacionar volúmenes profundos y espacialmente bien definidos en pez cebra utilizando un microscopio de dos fotones. En comparación con las ablaciones celulares basadas en láser ultravioleta, el láser de dos fotones mejoró la resolución axial y la penetración en el tejido. Este protocolo proporcionó una estrategia de perturbación para estudiar la interacción célula-célula durante el desarrollo.

El avance de las tecnologías microscópicas nos permitió comprender muchos procesos de desarrollo en cuatro dimensiones. Los protocolos de esta colección ayudarán a más científicos a superar la barrera técnica de las imágenes en vivo en diferentes sistemas biológicos. Anticipamos que en el futuro se desarrollarán más métodos que faciliten las imágenes en vivo.

Disclosures

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El autor no tiene nada que revelar.

Acknowledgements

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Esta edición de la Colección del Método JoVE fue financiada por NIH 1K99DC01883001. Agradezco a mi mentor postdoctoral Liqun Luo, a mis colaboradores Eric Betzig y Tian-Ming Fu por el fuerte apoyo para desarrollar mi interés en las imágenes de lapso de tiempo durante mi proyecto de postdoctorado. También agradezco a la Escuela de Ciencias del Cerebro y Medicina del Cerebro de la Universidad de Zhejiang por reclutarme y apoyarme para continuar con el estudio de imágenes de lapso de tiempo en mi propio laboratorio.

References

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  1. Rieger, S., Wang, F., Sagasti, A. Time-lapse imaging of neural development: zebrafish lead the way into the fourth dimension. Genesis. 49 (7), 534-545 (2011).
  2. Wong, C., Chen, A. A., Behr, B., Shen, S. Time-lapse microscopy and image analysis in basic and clinical embryo development research. Reproductive Biomedicine Online. 26 (2), 120-129 (2013).
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  7. Januschke, J., Loyer, N. Applications of immobilization of Drosophila tissues with fibrin clots for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e61954(2020).
  8. Li, T., Luo, L. An explant system for time-lapse imaging studies of olfactory circuit assembly in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (176), e62983(2021).
  9. Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. In vivo imaging of fully active brain tissue in awake Zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal. Journal of Visualized Experiments. (168), e62166(2021).
  10. Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. Simultaneous live imaging of multiple insect embryos in sample chamber-based light sheet fluorescence microscopes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61713(2020).
  11. Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS live cell imaging during neuronal development. Journal of Visualized Experiments. (168), e62165(2021).
  12. Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid storage dynamics in Caenorhabditis elegans using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (171), e61870(2021).
  13. Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Deep and spatially controlled volume ablations using a two-photon microscope in the Zebrafish gastrula. Journal of Visualized Experiments. (173), e62815(2021).

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