Este manuscrito presenta un protocolo detallado para obtener imágenes de la dinámica de la pared celular 3D del tejido de musgo vivo, lo que permite la visualización del desprendimiento de las paredes celulares en mutantes ggb y engrosar los patrones de pared celular en el tipo salvaje durante el desarrollo durante un largo período.
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Artículo de método
Imágenes de lapso de tiempo 3D de la dinámica de la pared celular usando calcofluor en musgo Physcomitrium patens
En este artículo
Resumen
Resumen
Las imágenes de lapso de tiempo con microscopía de fluorescencia permiten observar los cambios dinámicos de crecimiento y desarrollo a nivel celular y subcelular. En general, para observaciones durante un período prolongado, la técnica requiere la transformación de una proteína fluorescente; Sin embargo, para la mayoría de los sistemas, la transformación genética requiere mucho tiempo o no está técnicamente disponible. Este manuscrito presenta un protocolo para imágenes de lapso de tiempo 3D de la dinámica de la pared celular durante un período de 3 días utilizando colorante calcofluor (que tiñe la celulosa en la pared celular de la planta), desarrollado en el musgo Physcomitrium patens. La señal de colorante calcofluor de la pared celular es estable y puede durar 1 semana sin descomposición obvia. Usando este método, se ha demostrado que el desprendimiento de células en mutantes ggb (en el que la proteína geranilgeraniltransferasa-I subunidad beta es eliminada) es causado por la expansión celular no regulada y defectos de integridad de la pared celular. Además, los patrones de tinción de calcofluor cambian con el tiempo; Las regiones menos intensamente teñidas se correlacionan con los futuros sitios de expansión / ramificación celular en el tipo silvestre. Este método se puede aplicar a muchos otros sistemas que contienen paredes celulares y que pueden ser teñidos por calcofluor.
Introducción
Las paredes celulares de las plantas experimentan cambios dinámicos durante la expansión y el desarrollo celular 1,2,3. Mantener la integridad de la pared celular es fundamental para la adhesión de las células vegetales durante el crecimiento y el desarrollo, así como para la respuesta a las señales ambientales. Aunque visualizar la dinámica de la pared celular de las células vivas durante un largo período de tiempo es fundamental para comprender cómo se mantiene la adhesión celular durante el desarrollo y la adaptación a los cambios ambientales, los métodos actuales para obs....
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Protocolo
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para la lista de materiales y equipos y la Tabla 1 para la lista de soluciones que se utilizarán en este protocolo.
1. Preparación de plantas para platos con fondo de cristal.
- Cultivar el tejido protonemal de musgo en medio de agar BCDAT en una placa de Petri de 13 cm bajo luz blanca constante (~50 μmol m-2 s-1) durante 7 días a 25 °C en la cámara de crecimiento.
- Filtrar y esterilizar el calcofluor blanco y conservar a 4 °C hasta su uso. El reactivo es estable durante varios meses.
- Disperse el tejido d....
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Resultados
Este método permite la observación de la dinámica de la pared celular durante el desarrollo en mutantes de tipo salvaje y ggb (Figura 1). Los resultados mostraron que las regiones con menos engrosamiento de la pared celular se correlacionan con los sitios de expansión/ramificación celular, lo que permite la predicción de sitios de expansión/ramificación en el tipo salvaje (Figura 1A). La superficie de las paredes celulares en los mutantes ggb s.......
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Discusión
La reconstrucción 3D de lapso de tiempo, o imágenes 4D, es una herramienta poderosa para observar la dinámica de la morfología celular durante los procesos de desarrollo. En este protocolo, al mezclar el blanco de calcofluor en el medio, se puede observar la dinámica de la morfología celular 3D en el musgo P. patens. Usando este método, observamos que la superficie de las paredes celulares en los mutantes ggb se desgarra durante el desarrollo3. Además, el engrosamiento reducido d.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses contrapuestos o financieros.
Agradecimientos
Soucy Patricia y Betty Nunn de la Universidad de Louisville por su ayuda con el microscopio confocal. Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation (1456884 a M.P.R.) y por un Acuerdo de Cooperación de la National Science Foundation (1849213 a M.P.R.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Filtro de luz de plástico rojo de 3 mm de grosor | Mitsubishi | No.102 | |
| Plato con base de vidrio de 27 mm de diámetro | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor blanco | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L y azul Evans, 0,5 g/L |
| Microscopio Confocal | Nikon | A1 | NIS element software; archivo .nd2 en NIS-elements Viewer, descargar de https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Microscopio de fluorescencia | Nikon | TE200 | Equipado con una cámara DS-U3; |
| Goma gellan | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Cámaras de crecimiento de plantas | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Jeringa esterilizada 0.22 μ filtro m | Millipore | SLGV033RS |
Referencias
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant d....
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Reimpresiones y permisos
