Artículo de método

Investigación de las interacciones entre las enzimas modificadoras de histonas y los factores de transcripción in vivo mediante la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia

DOI:

10.3791/64656

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14 de octubre de 2022

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

En este artículo

Resumen

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La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) es una técnica de imagen para detectar interacciones de proteínas en células vivas. Aquí, se presenta un protocolo FRET para estudiar la asociación de enzimas modificadoras de histonas con factores de transcripción que las reclutan a los promotores objetivo para la regulación epigenética de la expresión génica en tejidos vegetales.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La regulación epigenética de la expresión génica se ve comúnmente afectada por enzimas modificadoras de histonas (HME) que generan marcas de histonas heterocromáticas o eucromáticas para la represión o activación transcripcional, respectivamente. Los HME son reclutados a su cromatina diana por factores de transcripción (TF). Por lo tanto, detectar y caracterizar las interacciones directas entre HME y TF es fundamental para comprender mejor su función y especificidad. Estos estudios serían biológicamente más relevantes si se realizaran in vivo dentro de tejidos vivos. Aquí, se describe un protocolo para visualizar las interacciones en las hojas de las plantas entre una histona desubiquitinasa de la planta y un factor de transcripción de la planta utilizando la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), que permite la detección de complejos entre moléculas de proteínas que están dentro de <10 nm entre sí. Se presentan dos variaciones de la técnica FRET: SE-FRET (emisión sensibilizada) y AB-FRET (blanqueamiento aceptor), en el que la energía se transfiere de forma no radiativa del donante al aceptor o emitida radiativamente por el donante tras el fotoblanqueo del aceptor. Tanto los enfoques SE-FRET como AB-FRET se pueden adaptar fácilmente para descubrir otras interacciones entre otras proteínas en planta.

Introducción

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Las histonas deubiquitinasas de plantas juegan un papel importante en el control de la expresión génica mediante la modificación postraduccional de histonas, específicamente borrando sus marcas de monoubiquitilación1. Hasta ahora, OTLD1 es una de las pocas histonas deubiquitinasas vegetales caracterizadas a nivel molecular en Arabidopsis 2,3. OTLD1 elimina los grupos monoubiquitina de las moléculas de histonas H2B, promoviendo así la eliminación o adición de acetilación eucromática y modificaciones de metilación de histonas H3 en el gen dianacromatina 4,5. Además, OTLD1 interactúa con otra enzima modificadora de la cromatina, la histona lisina desmetilasa KDM1C, para afectar la supresión transcripcional de los genes diana 6,7.

La mayoría de las enzimas modificadoras de histonas carecen de capacidades de unión al ADN y, por lo tanto, no pueden reconocer directamente sus genes diana. Una posibilidad es que cooperen con las proteínas del factor de transcripción de unión al ADN que se unen a estas enzimas y las dirigen a sus objetivos de cromatina. Específicamente, en las plantas, se sabe que varias enzimas modificadoras de histonas importantes (es decir, histona metiltransferasas8,9, histona acetiltransferasas 10, histona desmetilasas 11 y complejos represivos Polycomb12,13,14) son reclutadas por factores de transcripción. De acuerdo con esta idea, recientemente, se propuso un posible mecanismo para el reclutamiento de OTLD1 a los promotores objetivo que se basa en interacciones proteína-proteína específicas de OTLD1 con un factor de transcripción LSH1015.

LSH10 pertenece a una familia de las proteínas vegetales ALOG (Arabidopsis LSH1 y Oryza G1) que funcionan como reguladores centrales del desarrollo 16,17,18,19,20,21,22. El hecho de que los miembros de la familia de proteínas ALOG contengan motivos de unión al ADN23 y exhiban las capacidades para la regulación transcripcional 22, la localización nuclear19 y la homodimerización24 respalda aún más la idea de que estas proteínas, incluida LSH10, pueden actuar como factores de transcripción específicos durante la regulación epigenética de la transcripción. Una de las principales técnicas experimentales utilizadas para caracterizar la interacción LSH10-OTLD1 in vivo es la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET)15.

FRET es una técnica de imagen para detectar directamente interacciones de corto alcance entre proteínas dentro de <10 nm entre sí25 dentro de células vivas. Hay dos variaciones principales del enfoque FRET26: emisión sensibilizada (SE-FRET) (Figura 1A) y blanqueo aceptor (AB-FRET) (Figura 1B). En SE-FRET, las proteínas que interactúan, una de las cuales se marca con un fluorocromo donante (por ejemplo, proteína fluorescente verde, GFP) y la otra con un fluorocromo aceptor (por ejemplo, proteína fluorescente roja monomérica, mRFP27,28), transfieren no radiativamente la energía del estado excitado del donante al aceptor. Debido a que no se emiten fotones durante esta transferencia, se produce una señal fluorescente que tiene un espectro de emisión radiativo similar al del aceptor. En AB-FRET, las interacciones proteicas se detectan y cuantifican en función de la emisión radiativa elevada del donante cuando el aceptor se inactiva permanentemente por fotoblanqueo y, por lo tanto, no puede recibir la energía no radiativa transferida del donante (Figura 1). Es importante destacar que la ubicación subcelular de la fluorescencia FRET es indicativa de la localización de las proteínas que interactúan en la célula.

La capacidad de desplegar FRET en tejidos vivos y determinar la localización subcelular de las proteínas que interactúan simultáneamente con la detección de esta interacción per se, hace de FRET la técnica de elección para estudios y caracterización inicial de interacciones proteína-proteína in vivo. Una metodología comparable de imagen de fluorescencia in vivo, la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC)29,30,31,32, es un buen enfoque alternativo, aunque, a diferencia de FRET, BiFC puede producir falsos positivos debido al ensamblaje espontáneo de los reporteros de BiFC autofluorescentes 33, y la cuantificación de sus datos es menos precisa.

Este artículo comparte la experiencia exitosa en la implementación de técnicas SE-FRET y AB-FRET y presenta un protocolo para su implementación para investigar las interacciones entre OTLD1 y LSH10 en células vegetales.

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Protocolo

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Para el presente estudio se utilizaron Nicotiana benthamiana, cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens o GV3101.

1. Construcción de vectores FRET

  1. Seleccione etiquetas fluorescentes para el par FRET donante/aceptor.
    1. Utilice EGFP de pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (ver Tabla de materiales) para generar el vector donante.
    2. Utilice mRFP de pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (consulte Tabla de materiales) para generar el vector aceptor.
  2. Genere las construcciones FRET donante/aceptor utilizando una técnica de clonación de recombinación específica del sitio34, como el sistema de clonación de recombinación Gateway35.
    1. Amplificar las secuencias codificantes de las proteínas de interés36 (es decir, Arabidopsis OTLD1 y LSH10)15.
      NOTA: También es una buena idea utilizar un control negativo que represente un homólogo de una de las proteínas que interactúan, pero no se espera que muestre interacción; el estudio de interacción OTLD1-LSH10 emplea un homólogo de LSH10, LSH4, que no reconoce OTLD1. Los ADNc OTLD1, LSH10 y LSH4 se amplifican mediante PCR utilizando cebadores enumerados en la Tabla 1.
    2. Clonar OTLD1, LSH10 y LSH4 en el vector de entrada pDONR207 mediante la técnica de clonación de recombinación específica del sitio34.
    3. Utilice la Gateway LR Clonase II (consulte la Tabla de materiales) para transferir LSH10 y LSH4 de pDONR207 al vector binario de destino pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 para generar las construcciones donantes binarias p35S::LSH10-GFP (construcción probada) y p35S::LSH4-GFP (control negativo).
    4. Utilice la misma enzima disponible comercialmente (paso 1.2.3) para transferir OTLD1 de pDONR207 al vector binario de destino pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 para generar la construcción aceptora binaria p35S:: OTLD1-mRFP (construcción probada).
    5. PCR-amplíe36 mRFP de pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 usando cebadores enumerados en la Tabla 1, clónelo por la técnica de clonación de recombinación en pDONR207, y luego use LR Clonase II para transferir mRFP a pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 para generar la construcción de fusión binaria p35S::mRFP-GFP (control positivo).
  3. Realizar la transformación de las construcciones donante y aceptora en Agrobacterium.
    1. Añadir 1 μg de cada plásmido de los pasos 1.2.3-1.2.5 a 100 μL del cultivo de células competentes de Agrobacterium tumefaciens cepa EHA105 o GV3101, preparadas utilizando protocolos estándar 37 u obtenidas comercialmente, e incubar a37 °C durante 5 min.
    2. Añadir 1 ml de medio LB (1% triptona, 0,5% de extracto de levadura y 1% de NaCl; ver Tabla de materiales) a la mezcla celular competente y agitar a 200 rpm y 28° C durante 1,5 h. Recoger las células por centrifugación a 3.000 × g durante 1 minuto a temperatura ambiente.
    3. Resuspender las células en 0,1 ml de medio LB mediante pipeteo y esparcirlas en agar LB suplementado con los antibióticos apropiados (por ejemplo, espectinomicina al 0,01% y rifampicina al 0,005%; ver Tabla de materiales). Cultivar a 28 °C durante 2 días.
    4. Elija colonias individuales e inocule cada una de ellas por separado en 1 ml de caldo LB complementado con los antibióticos apropiados.
    5. Cultivar las células a 28 °C durante 24 h y transferir 0,2 ml del cultivo a un tubo nuevo. Recoger las células por centrifugación a 10.000 × g durante 30 s a temperatura ambiente.
    6. Extraer ADN plásmido mediante un protocolo estándar para aislar plásmidos de células de Agrobacterium 38 y resuspender el ADN extraído en30 μL de agua. Para identificar las colonias que albergan los plásmidos deseados, utilice 2 μL de la preparación de ADN como plantilla para PCR con cebadores específicos de genes enumerados en la Tabla 1. Mezclar 0,7 ml del cultivo identificado con 0,3 ml de glicerol y almacenar a -80 °C.

2. Agroinfiltración

  1. Cultiva plantas de Nicotiana benthamiana .
    NOTA: A lo largo de todo el experimento, todas las plantas deben estar sanas.
    1. Siembre y cultive semillas de N. benthamiana en una maceta que contenga tierra húmeda a una alta densidad.
    2. Mantener las semillas plantadas en una cámara de crecimiento fijada a 23 °C con 16 h de ciclo de luz y 8 h de ciclo oscuro con una intensidad de luz de 150-170 μmol/m2s hasta que el diámetro del euphyll alcance los 0,5 cm.
    3. Transfiera las plántulas a macetas más grandes y permita que crezcan en la misma cámara con los mismos parámetros.
      NOTA: Las plantas están listas para la agroinfiltración cuando sus hojas más grandes tienen 5-7 cm de diámetro, generalmente dentro de 4-5 semanas. En plantas más pequeñas que son demasiado jóvenes, los efectos de la agroinfiltración serán demasiado severos para el análisis FRET.
  2. Preparar células bacterianas para la agroinfiltración.
    1. Cultivar cada colonia de Agrobacterium que contenga las construcciones FRET durante la noche en 5 ml de medio LB suplementado con los antibióticos apropiados (paso 1.3.3) y 150 μM de acetosiringona a 28 °C (ver Tabla de materiales).
    2. Centrifugar las células a 3.000 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
    3. Resuspender las células en tampón de agroinfiltración (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5.6, 150 μM acetosyringone) a OD600 = 0.5.
    4. Combinar las células resuspendidas en una relación 1:1 v/v entre las células que albergan los constructos apropiados (paso 2.2.5).
    5. Para las agroinfiltraciones de doble construcción, mezclar las alícuotas de dos cultivos y, para las agroinfiltraciones de construcción simple, mezclar las alícuotas del mismo cultivo:
      1. Proteínas probadas: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (bacterias que albergan las construcciones p35S::OTLD1-mRFP y p35S::LSH10-GFP).
      2. Control negativo: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (bacterias que albergan las construcciones p35S::OTLD1-mRFP y p35S::LSH4-GFP).
      3. Control negativo: LSH10-GFP + mRFP libre (bacterias que albergan las construcciones p35S::LSH10-GFP y pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1).
      4. Control positivo: mRFP-GFP (bacterias que albergan la construcción p35S::mRFP-GFP).
    6. Incubar las células a 28 °C durante 0,5-1 h.
  3. Realizar agroinfiltración.
    1. Cargue el cultivo bacteriano en una jeringa sin aguja de 1 ml.
    2. Presione suave pero firmemente la boquilla de la jeringa contra el lado abaxial de las hojas de N. benthamiana completamente expandidas mientras sostiene la hoja con un dedo enguantado en el lado adaxial.
    3. Infiltrar hasta cuatro manchas en una hoja, tres hojas por planta, dos o tres plantas para cada cultivo bacteriano. Cambie los guantes entre muestras para evitar la contaminación cruzada.
    4. Mantener las plantas agroinfiltradas en la misma cámara de crecimiento en las mismas condiciones, como se describe en la etapa 2.1.2, durante 24 h a 36 h. No mantenga las plantas agroinfiltradas por más de 36 h, ya que esto reducirá la señal de fluorescencia.

3. Microscopía confocal

  1. Prepare portaobjetos de microscopio para la visualización de fluorescencia.
    1. Después de 24-36 h de la infiltración, use una cuchilla de afeitar para cortar cada hoja agroinfiltrada en trozos pequeños (2 mm x 4 mm) entre las venas.
    2. Coloque las piezas de la hoja en un portaobjetos de vidrio con la superficie de la hoja abaxial hacia arriba. Coloque una gota de agua en los trozos de la hoja y cúbralos con el vidrio de la cubierta. Golpee ligeramente el vidrio de la cubierta para eliminar las burbujas de aire.
    3. Encienda el microscopio y el láser (consulte la Tabla de materiales). Coloque el portaobjetos en el soporte de la etapa del microscopio para obtener imágenes bajo los parámetros FRET específicos (pasos 3.2 y 3.3).
    4. Comience las observaciones usando una lente objetivo 10x para identificar las células que exhiben las señales GFP y mRFP, y luego use una lente objetivo 40x para observaciones detalladas posteriores.
      NOTA: Es importante destacar que SE-FRET y AB-FRET generalmente se realizan en la misma muestra de tejido, lo que permite el uso de la misma configuración de canal (paso 3.2) excepto para el canal FRET, que se activa / desactiva para las observaciones SE-FRET y AB-FRET, respectivamente (pasos 3.2.2.3 y 3.3.1).
  2. Configure los parámetros para SE-FRET (Figura 1A).
    1. Abra la herramienta Adquisición multidimensional (MDA).
    2. Establecer un conjunto de tres canales confocales en el mismo campo de visión (Figura complementaria 1).
      1. Ajuste el canal donante (el canal GFP) para la excitación y emisión del fluorocromo donante con el láser de excitación de 405 nm y el filtro de emisión de 400-597 nm.
      2. Ajuste el canal aceptor (el canal mRFP) para la excitación y emisión del fluorocromo aceptor con el láser de excitación de 561 nm y el filtro de emisión de 400-597 nm.
        NOTA: El filtro de emisión para mRFP se estableció en 400-597 nm para separar la señal mRFP de la señal FRET a 597-617 nm (paso 3.2.2.3) y, por lo tanto, reducir la emisión de mRFP independiente de FRET.
      3. Ajuste el canal FRET para la excitación del donante y la emisión de los fluorocromos aceptores con el láser de excitación de 405 nm y el filtro de emisión de 597-617 nm.
    3. Ajuste la intensidad de excitación del donante a un nivel mínimo para observar FRET evitando el fotoblanqueo, reduciendo la eficiencia SE-FRET.
      NOTA: Esta intensidad de excitación se selecciona experimentalmente antes de realizar el procedimiento FRET para evitar el fotoblanqueo. Varía según el grosor de la hoja, la edad y el tiempo después de la sobreexpresión.
    4. Excite al donante y busque células que contengan la señal de fluorescencia esperada del aceptor.
    5. Seleccione la región que contiene la señal de fluorescencia de interés.
    6. Adquiera una secuencia de imagen SE-FRET pulsando el botón Snap .
      1. Imagen 10-15 células que expresan primero la construcción mRFP-GFP (control positivo); ajustar los parámetros de enfoque, zoom y ganancia inteligente para enfocar el área de interés que se va a capturar (Figura complementaria 2).
      2. Usando la misma configuración, imagen 10-15 celdas, cada una expresando OTLD1-mRFP, mRFP libre, LSH10-GFP o LSH4-GFP por separado.
        NOTA: Estas imágenes son adquiridas por el plug-in "PixFRET" de ImageJ (ver Tabla de materiales), que se utilizó para los análisis de datos FRET (paso 3.4.1) para determinar los valores de sangrado espectral (SBT) para los aceptantes y los donantes; estas imágenes son utilizadas por el software para generar las imágenes SE-FRET para los pares de proteínas OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP y LSH10-GFP + mRFP libre (paso 3.2.6.3).
      3. Además, utilizando la misma configuración, imagen 10-15 células que coexpresan pares de proteínas OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP y LSH10-GFP + mRFP libre.
  3. Configure los parámetros para AB-FRET (Figura 1B).
    1. Utilice los parámetros de canal donante y aceptor establecidos para SE-FRET (paso 3.2.2) pero apague el canal FRET.
    2. Establecer los parámetros para el fotoblanqueo del aceptor (mRFP) (Figura complementaria 3).
      1. Asegúrese de que el blanqueamiento comience después de cinco imágenes. Permita 200 iteraciones para cada blanqueador de área. Mantenga el 100% de intensidad láser a 561 nm.
      2. Mantener una duración de blanqueamiento de 45 s. Garantice una velocidad de escaneo de 512 x 512 píxeles a 400 Hz.
    3. Dibujar la región de la celda a blanquear; Por ejemplo, para las interacciones nucleares, las regiones de interés se dibujan alrededor de toda el área del núcleo celular39.
    4. Active el blanqueo pulsando el botón Iniciar experimento ; activando esta función se realizará el fotoblanqueo y se adquirirá la secuencia de imagen AB-FRET.
  4. Analizar los datos de FRET.
    1. Para analizar los datos SE-FRET, utilice el complemento "PixFRET" para que el software ImageJ genere imágenes corregidas de la eficiencia SE-FRET después de restar SBT40 (paso 3.2.6.2).
    2. Para analizar los datos de AB-FRET, calcule %AB-FRET como el porcentaje de aumento en la emisión de GFP después del fotoblanqueo de mRFP utilizando la siguiente fórmula41: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, donde GFPpost es la emisión de GFP después del fotoblanqueo de mRFP, y GFPpre es la emisión de GFP antes del fotoblanqueo de mRFP.
    3. Al revisar las imágenes FRET, preste atención a la localización subcelular de la señal FRET.
      NOTA: En muchos casos, estos compartimentos celulares (por ejemplo, núcleo, cloroplastos, RE, etc.) se pueden identificar fácilmente y, como beneficio adicional de la técnica FRET, proporcionan pistas importantes sobre la función biológica de las proteínas que interactúan.

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Resultados

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La Figura 2 ilustra los resultados típicos de un experimento SE-FRET, en el que los núcleos celulares se registraron simultáneamente en tres canales (es decir, GFP donante, mRFP aceptor y SE-FRET). Estos datos se utilizaron para generar imágenes de eficiencia SE-FRET codificadas en una escala de pseudocolor. En esta escala, la transición de azul a rojo corresponde a un aumento en la eficiencia FRET, una medida de proximidad proteína-proteína de 0% a 100%. En este experimento representativo, ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo FRET es simple y fácil de reproducir; También requiere una inversión mínima en suministro y utiliza equipos estándar para muchos laboratorios modernos. Específicamente, cinco características técnicas principales distinguen la versatilidad de este procedimiento. En primer lugar, las construcciones FRET se generan utilizando la recombinación específica del sitio, un enfoque de clonación que es fácil de usar, produce resultados precisos y ahorra tiempo en comparación con la clonación tradicional basada en enz...

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Divulgaciones

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No se declararon conflictos de intereses.

Agradecimientos

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El trabajo en el laboratorio de V.C. es apoyado por subvenciones de NIH (R35GM144059 y R01GM50224), NSF (MCB1913165 e IOS1758046) y BARD (IS-5276-20) a V.C.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Acetosiringa (3′,5′-Dimetoxi-4′-hidroxiacetofenona)Sigma-Aldrich#D134406-1G
Bacto AgarBD Biosciences#214010
Bacto triptónBD Biosciences#211705
Extracto de levadura BactoBD Biosciences#212750 
Microscopio de barrido láser confocal (CLSM)ZeissLSM900Cualquier CLSM con capacidades similares es adecuado
EHA105VWR104013-310Utilizamos la culata de la colección de culata del laboratorio bacteriano
Citovsky Gateway BP Clonase II Invitrogen#11789100
Gateway LR Clonase IIInvitrogen#11791020
GV3101VWR104013-296Utilizamos la culata en la colección de existencias del laboratorio bacteriano Citovsky
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
MESSigma-Aldrich#69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich#63068-250G
NaClSigma-Aldrich#S5886-500G
Nicotiana benthamianasemillas Herbalistics PtyRA4 o LABUtilizamos el stock en la colección de stock de laboratorio de semillas
Citovsky pDONR207Invitrogen#12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 N/ARefs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1N/AGenerado en base a la construcción pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 (ver refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 N/AGenerado en base al constructo pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1
Rifampicina Sigma-Aldrich#R7382-5G Spectinomicina Sigma-Aldrich#S4014-5G Jeringas sin agujas BD 309659 Zen Software para imágenes CLSM Zeiss ZEN versión 3.0 El software debe ser compatible con el CLSM utilizado

Referencias

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