Este trabajo describe un protocolo para el sistema modular de transgénesis Tol2, un método de clonación basado en pasarela para crear e inyectar construcciones transgénicas en embriones de pez cebra.
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Artículo de método
El sistema Zebrafish Tol2: un enfoque de transgénesis modular y flexible basado en pasarelas
En este artículo
Resumen
Resumen
Los trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF) se caracterizan por un conjunto altamente variable de defectos estructurales y deficiencias cognitivas que surgen debido a la exposición prenatal al etanol. Debido a la compleja patología del TEAF, los modelos animales han demostrado ser críticos para nuestra comprensión actual de los defectos de desarrollo inducidos por el etanol. El pez cebra ha demostrado ser un modelo poderoso para examinar los defectos de desarrollo inducidos por el etanol debido al alto grado de conservación tanto de la genética como del desarrollo entre el pez cebra y los humanos. Como sistema modelo, el pez cebra posee muchos atributos que los hacen ideales para estudios de desarrollo, incluyendo un gran número de embriones fertilizados externamente que son genéticamente tratables y translúcidos. Esto permite a los investigadores controlar con precisión el momento y la dosis de exposición al etanol en múltiples contextos genéticos. Una herramienta genética importante disponible en el pez cebra es la transgénesis. Sin embargo, generar construcciones transgénicas y establecer líneas transgénicas puede ser complejo y difícil. Para abordar este problema, los investigadores del pez cebra han establecido el sistema de transgénesis Tol2 basado en transposones. Este sistema modular utiliza un enfoque de clonación de puerta de enlace multisitio para el ensamblaje rápido de construcciones transgénicas completas basadas en transposones Tol2. Aquí, describimos la caja de herramientas flexible del sistema Tol2 y un protocolo para generar construcciones transgénicas listas para la transgénesis del pez cebra y su uso en estudios de etanol.
Introducción
La exposición prenatal al etanol da lugar a un continuo de déficits estructurales y deficiencias cognitivas denominadas trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF)1,2,3,4. Las complejas relaciones entre múltiples factores hacen que estudiar y comprender la etiología del TEAF en humanos sea un desafío. Para resolver este desafío, se ha utilizado una amplia variedad de modelos animales. Las herramientas biológicas y experimentales disponibles en estos modelos han demostrado ser cruciales para desarrollar nuestra comprensión de las bases me....
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Protocolo
Todos los embriones de pez cebra utilizados en este procedimiento fueron criados y criados siguiendo los protocolos IACUC establecidos12. Estos protocolos fueron aprobados por la Universidad de Louisville.
NOTA: En este estudio se utilizaron la cepa de pez cebra de tipo salvaje, AB, y la línea mutante doble bmp4st72;smad5b1100 . Toda el agua utilizada en este procedimiento era agua estéril de ósmosis inversa. Las imágenes confocales se tomaron bajo un microscopio confocal de escaneo láser. Las mediciones del endodermo se realizaron utilizando la herramienta de medición en ImageJ. Todos ....
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Resultados
Para generar las construcciones transgénicas, utilizamos el sistema de transgénesis Tol2. Se utilizaron tres vectores de entrada, incluido p5E, que contiene los elementos promotores / potenciadores de genes, pME, que sostiene que el gen se expresa por los elementos promotores / potenciadores, y p3E que, como mínimo, contiene la cola de poliA, para generar la construcción transgénica a través de la clonación LR de puerta de enlace multisitio. El vector de destino, pDest, proporciona las repeticiones Tol2 para la .......
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Discusión
El pez cebra es ideal para estudiar el impacto de la exposición al etanol en el desarrollo y los estados de enfermedad 7,8. El pez cebra produce un gran número de embriones translúcidos, fertilizados externamente y genéticamente tratables, lo que permite la obtención de imágenes en vivo de varios tejidos y tipos de células marcados con transgenes simultáneamente en múltiples contextos ambientales19,20. Es.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
La investigación presentada en este artículo fue apoyada por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional sobre el Abuso de Alcohol (NIH/NIAAA) R00AA023560 a C.B.L.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Caja de herramientas Addgene Tol2 | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Proporcionado directamente por la universidad | ||
| Ampicilina | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Balanza analítica | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID Capilar | FHC | 30-30-0 | |
| Cloruro de calcio | VWR | 97062-590 | |
| Cloranfenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Microscopio de disección fluorescente | Olympus | SZX16 | |
| Kanamicina | Fisher Scientific | BP906 | |
| Microscopio confocal de barrido láser | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawson Lab Preparación de plásmidos de donante | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB | Caldo Fisher Scientific | BP1426 | |
| Agarosa de grado de baja EEO/multipropósito/biología molecular Fisher | Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonasa II Plus Enzima | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Sulfato de magnesio (heptahidrato) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipeta | Instrumentación Científica Aplicada | MIMPH-M-PIP | |
| Tubo de microcentrífuga 0,5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulador | Instrumentación Científica Aplicada | MM33 | |
| Puntas de micropipeta 10 μ L | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Puntas de micropipeta 1000 μ L | Fisher Scientific 13611127 | ||
| Puntas de micropipeta 200 μ L | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcripción | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Hoja de cálculo | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| Espectrofotómetro NanoDrop NanoDrop | ND-1000 | ||
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S Placas de | |
| Petri 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Fenol Sal sódica roja | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipeta | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipeta | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipeta | Gilson | FA10001M | |
| Cloruro de potasio | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Fosfato de potasio (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Inyector de presión Instrumentación | científica aplicada | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Bicarbonato de sodio | VWR | BDH9280-500G | |
| Cloruro de sodio | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Fosfato de sodio (dibásico) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µ m sistema de filtración al vacío | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Página Wiki | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Químicamente Competentes E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Extractor de pipetas verticales | David Kopf Instruments | 720 | |
| Molde de microinyección de pez cebra | Herramientas de ciencia adaptativa | i34 |
Referencias
- Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
- Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis.
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Reimpresiones y permisos
