El sistema Zebrafish Tol2: un enfoque de transgénesis modular y flexible basado en pasarelas

Resumen

Este trabajo describe un protocolo para el sistema modular de transgénesis Tol2, un método de clonación basado en pasarela para crear e inyectar construcciones transgénicas en embriones de pez cebra.

Resumen

Los trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF) se caracterizan por un conjunto altamente variable de defectos estructurales y deficiencias cognitivas que surgen debido a la exposición prenatal al etanol. Debido a la compleja patología del TEAF, los modelos animales han demostrado ser críticos para nuestra comprensión actual de los defectos de desarrollo inducidos por el etanol. El pez cebra ha demostrado ser un modelo poderoso para examinar los defectos de desarrollo inducidos por el etanol debido al alto grado de conservación tanto de la genética como del desarrollo entre el pez cebra y los humanos. Como sistema modelo, el pez cebra posee muchos atributos que los hacen ideales para estudios de desarrollo, incluyendo un gran número de embriones fertilizados externamente que son genéticamente tratables y translúcidos. Esto permite a los investigadores controlar con precisión el momento y la dosis de exposición al etanol en múltiples contextos genéticos. Una herramienta genética importante disponible en el pez cebra es la transgénesis. Sin embargo, generar construcciones transgénicas y establecer líneas transgénicas puede ser complejo y difícil. Para abordar este problema, los investigadores del pez cebra han establecido el sistema de transgénesis Tol2 basado en transposones. Este sistema modular utiliza un enfoque de clonación de puerta de enlace multisitio para el ensamblaje rápido de construcciones transgénicas completas basadas en transposones Tol2. Aquí, describimos la caja de herramientas flexible del sistema Tol2 y un protocolo para generar construcciones transgénicas listas para la transgénesis del pez cebra y su uso en estudios de etanol.

Introducción

La exposición prenatal al etanol da lugar a un continuo de déficits estructurales y deficiencias cognitivas denominadas trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF)1,2,3,4. Las complejas relaciones entre múltiples factores hacen que estudiar y comprender la etiología del TEAF en humanos sea un desafío. Para resolver este desafío, se ha utilizado una amplia variedad de modelos animales. Las herramientas biológicas y experimentales disponibles en estos modelos han demostrado ser cruciales para desarrollar nuestra comprensión de las bases mecanicistas de la teratogenicidad del etanol, y los resultados de estos sistemas modelo han sido notablemente consistentes con lo que se encuentra en los estudios de etanol humano ^5,6. Entre estos, el pez cebra se ha convertido en un poderoso modelo para estudiar la teratogénesis del etanol^7,8, en parte debido a su fertilización externa^, alta fecundidad, trazabilidad genética y embriones translúcidos. Estas fortalezas se combinan para hacer que el pez cebra sea ideal para estudios de imágenes en vivo en tiempo real de TEAF utilizando líneas transgénicas de pez cebra.

El pez cebra transgénico se ha utilizado ampliamente para estudiar múltiples aspectos del desarrollo embrionario⁹. Sin embargo, la creación de construcciones transgénicas y líneas transgénicas posteriores puede ser extremadamente difícil. Un transgén estándar requiere un elemento promotor activo para impulsar el transgén y una señal poli A o "cola", todo en un vector bacteriano estable para el mantenimiento general del vector. La generación tradicional de una construcción transgénica multicomponente requiere múltiples pasos de subclonación que consumen mucho tiempo¹⁰. Los enfoques basados en PCR, como el ensamblaje de Gibson, pueden eludir algunos de los problemas asociados con la subclonación. Sin embargo, los cebadores únicos deben ser diseñados y probados para la generación de cada construcción transgénica única¹⁰. Más allá de la construcción de transgenes, la integración genómica, la transmisión de la línea germinal y la detección de la integración adecuada de transgenes también han sido difíciles. Aquí, describimos un protocolo para usar el sistema de transgénesis Tol2 basado en transposones (Tol2Kit)^10,11. Este sistema modular utiliza la clonación de pasarela multisitio para generar rápidamente múltiples construcciones transgénicas a partir de una biblioteca en constante expansión de vectores de "entrada" y "destino". Los elementos transponibles Tol2 integrados aumentan en gran medida la tasa de transgénesis, lo que permite la rápida construcción e integración genómica de múltiples transgenes. Usando este sistema, mostramos cómo la generación de una línea de pez cebra transgénico endodermo se puede utilizar para estudiar los defectos estructurales específicos del tejido subyacentes al TEAF. En última instancia, en este protocolo, mostramos que la configuración modular y la construcción de construcciones transgénicas ayudarán enormemente a la investigación del TEAF basada en el pez cebra.

Protocolo

Todos los embriones de pez cebra utilizados en este procedimiento fueron criados y criados siguiendo los protocolos IACUC establecidos¹². Estos protocolos fueron aprobados por la Universidad de Louisville.

NOTA: En este estudio se utilizaron la cepa de pez cebra de tipo salvaje, AB, y la línea mutante doble bmp4^st72;smad5^b1100 . Toda el agua utilizada en este procedimiento era agua estéril de ósmosis inversa. Las imágenes confocales se tomaron bajo un microscopio confocal de escaneo láser. Las mediciones del endodermo se realizaron utilizando la herramienta de medición en ImageJ. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando software estadístico.

1. Hacer las soluciones y los medios

1. Medios bacterianos: Disuelva el caldo LB o el agar según las instrucciones del fabricante y el autoclave. Antes de verter el medio en placas de Petri de 100 mm, agregue ampicilina (50 μg/ml), kanamicina (50 μg/ml) o una combinación de ampicilina/cloranfenicol (50 μg/ml y 30 μg/ml, respectivamente).
2. Para hacer 20 veces el stock de medios embrionarios, disuelva lo siguiente en 1 L de agua: 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl, 2,9 g de CaCl 2, 0,41 g de K 2 HPO 4, 0,142 g de Na2 HPO 4 y 4,9 g de MgSO₄·7H₂ O. Esterilizar por filtro la solución madre utilizandoun sistema de filtración al vacío de 0,22 μm, y conservar a 4 °C.
   NOTA: Ignore el precipitado blanco que se forma; Esto no afectará a los medios de comunicación.
3. En 19 L de agua, disolver 1,2 g de NaHCO₃ y añadir 1 L del material de medios embrionarios 20x para generar la solución de medios embrionarios de trabajo, y mantener esta solución a 28 °C.
4. Para una solución de rojo de fenol al 2%, disuelva 20 mg de sal de sodio rojo fenol en 1 ml de agua libre de RNasa y guárdela a temperatura ambiente.

2. Moldes de inyección de embriones

1. Para hacer la placa de inyección de agarosa, disuelva la agarosa en el medio embrionario a una concentración final del 3% calentando hasta hervir.
2. Vierta 50 ml de agarosa en placas de Petri de 100 mm, y mientras la agarosa aún esté líquida, coloque suavemente el molde de inyección en la agarosa para evitar la formación de burbujas debajo del molde.
3. Deja que los platos de agarosa se enfríen. Una vez que la agarosa esté sólida, retire el molde de inyección y guárdelo a 4 °C hasta que esté listo para usar.

3. Pipetas de inyección

1. Tire de los capilares de 1,0 mm (OD) que contienen un filamento en agujas utilizando un extractor de pipeta vertical con el solenoide ajustado a 2,5 y el elemento calefactor ajustado a 14,6.
   NOTA: Cualquier extractor calentado funcionará si tira de los capilares en dos agujas de manera limpia y uniforme, pero las agujas de inyección deben extraerse dentro de 1 semana de inyectar los embriones de pez cebra para obtener resultados de inyección consistentes.
   1. Coloque el capilar en el extractor, apriete la abrazadera en cada extremo y luego active el elemento calefactor.
   2. Tire de los capilares para crear dos agujas de inyección.
   3. Retire los capilares del extractor y guárdelos en una placa de Petri vacía con una tira de arcilla para modelar que actúa como soporte de agujas.

4. Preparación del ARNm de la transposasa

1. Linealizar el plásmido Tol2Kit que contiene transposasa con una endonucleasa de restricción NotI combinando lo siguiente en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml: 10 μL de plásmido transposasa (150 ng/μL), 1,5 μL de tampón de reacción de endonucleasa de restricción, 0,3 μL de endonucleasa NotI.
2. Llene la reacción hasta 20 μL con agua libre de RNasa, y luego mezcle y digiera a 37 °C durante la noche.
3. Detenga la digestión de la transposasa agregando 1 μL de 0.5 M EDTA (pH 8.0), 2 μL de 5 M NH₄OAc y 80 μL de 100% EtOH a la reacción de digestión, y luego mezcle y enfríe a -20 °C durante la noche.
4. Centrifugar la solución a 14.000x g durante 20 min a 4 °C, y luego aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet de ADN en agua libre de RNasa.
5. Determine la concentración lineal de plásmidos en nanogramos por microlitro (ng/μL) usando un fluorómetro haciendo correr primero 2 μL de un espacio en blanco de agua libre de RNasa y luego corriendo 2 μL del plásmido linealizado.
   NOTA: Las concentraciones de plásmidos suelen oscilar entre 100-200 ng/μL
6. Configure la producción de ARNm SP6 combinando los siguientes componentes en orden en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml: 10 μL de 2x NTP/CAP, 2 μL de tampón de reacción 10x, 0,1-1 μg de plantilla de ADN lineal y 2 μL de mezcla de enzimas SP6.
7. Llenar la reacción hasta 20 μL con agua libre de RNasa, y luego mezclar e incubar a 37 °C durante 2 h.
8. Después de incubar durante 2 h, añadir 1 μL de DNasa, mezclar bien e incubar durante 15 min adicionales a 37 °C.
9. Para detener la reacción SP6, agregue 30 μL de solución de precipitación de LiCl al tubo de reacción, y luego mezcle y enfríe a -20 ° C durante la noche.
10. Centrifugar la solución a 14.000 x g durante 20 min a 4 °C para granular el ARNm, y luego aspirar el sobrenadante y lavar el pellet de ARNm con 1 ml de EtOH al 80% (diluido con agua libre de RNasa).
11. Centrifugar la solución a 14.000 x g durante 20 min a 4 °C para granular el ARNm, y luego aspirar el sobrenadante. Deje que el pellet se seque al aire.
12. Resuspender el pellet de ARNm en 20 μL de agua libre de RNasa, determinar la concentración de ARNm en nanogramos por microlitro (ng/μL) utilizando un fluorómetro como se describe en el paso 4.5 (debe ser de al menos 100 ng/μL), alícuota 100 ng de ARNm por tubo para un solo uso, y almacenar a -80 °C.
    NOTA: Para asegurarse de que el ARNm no se degrada, se pueden ejecutar rápidamente 2 μL de ARNm en un gel de electroforesis de ADN para confirmar una sola banda a 1.950 pb.

5. Clonación de Multisite Gateway para crear vectores de entrada para la transgénesis

NOTA: Este protocolo se modifica de Kwan et ^al.10, con la reacción LR escrita como una reacción half-LR y con un volumen total de 5 μL. Para generar nuevos elementos de entrada, las reacciones de PA que utilizan vectores donantes de 5', medio y 3' deben usarse^10,13.

1. Para realizar la reacción, reúna 10 fmol cada uno de p5E, pMe y p3E y 20 fmol del vector de destino (pDest).
   NOTA: La recombinación LR multisitio utiliza cuatro vectores plásmidos diferentes: un vector de entrada 5' (p5E), un vector de entrada medio (pME), un vector de entrada 3' (p3E) y un vector de destino (pDest), para generar una construcción transgénica única flanqueada por repeticiones de Tol2 listas para ser inyectadas en embriones de pez cebra.
   1. Identifique el tamaño de los cuatro vectores en pares de bases de la fuente de plásmidos (Tabla 1, Tol2Kit Wiki página¹⁴ o Addgene¹¹; ver la Tabla de materiales).
      NOTA: Para los vectores nuevos, la secuenciación completa del plásmido a través de compañías de secuenciación comercial puede proporcionar el tamaño exacto del plásmido en bps.
   2. Determinar la concentración de los cuatro vectores en nanogramos por microlitro (ng/μL) utilizando un fluorómetro, como se describe en el paso 4.5.
   3. Usando el peso del ADN como 660 g/mol y el tamaño del plásmido (en bps), calcule el total de nanogramos (ng) de plásmido necesarios para alcanzar 10 fmol (vectores de entrada) o 20 fmol (vector de destino).
      
      NOTA: El laboratorio Mosimann de la Universidad de Colorado, Anschutz Medical Campus, ha generado una hoja de cálculo disponible gratuitamente para calcular la cantidad de plásmido necesario (en ng) y el volumen (en μL) de los vectores necesarios en la reacción LR¹⁵.
2. Para generar la construcción descrita a continuación, sox17: EGFPCAAX, utilice los siguientes vectores: un vector p5E que contiene el promotor sox17 del pez cebra, que es 6.918 pb en tamaño¹⁶; un vector pME que contiene el EGFP prenilado, que es de 3.345 pb en tamaño¹⁰; un vector p3E que contiene la secuencia de señal poli A tardía SV40, que es de 2.838 pb de tamaño¹⁰; y el pDest, que es de 5.883 pb en tamaño¹⁰.
3. Utilizando la concentración de plásmidos determinada en el paso 5.1.2 y la cantidad en nanogramos (ng) para cada vector (paso 5.1.3), calcule el total de microlitros (μL) de cada plásmido necesario para alcanzar 10 fmol (vectores de entrada) o 20 fmol (vector de destino), y luego divida esto por dos para usarlo en las reacciones de 5 μL half-LR (todos los valores enumerados a continuación se enumeran en la Tabla 2).
   
   1. Para generar 10 fmol de p5E-sox17, use 45.66 ng (a una concentración de 140.3 ng / μL) y diluya con agua estéril por un factor de 4 para obtener 0.65 μL.
   2. Para generar 10 fmol de pME-EGFPCAAX, use 22.08 ng (a una concentración de 213.5 ng / μL) y diluya con agua estéril por un factor de 10 para obtener 0.52 μL.
   3. Para generar 10 fmol de p3E-poli A, use 15.73 ng (a una concentración de 276.1 ng / μL) y diluya con agua estéril por un factor de 20 para obtener 0.57 μL.
   4. Para 20 fmol del vector de destino, use 77.66 ng de pDest (a una concentración de 307.3 ng / μL) y diluya con agua estéril por un factor de 5 para obtener 1.63 μL.
4. Para configurar una reacción semiLR de 5 μL, combine los volúmenes de p5E, pME, p3E y pDest determinados en el paso 5.3 en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml y luego agregue agua estéril para alcanzar un volumen de reacción total de 4 μL.
5. Vortex vigorosamente la mezcla de enzimas LR 2x durante 1 min cada una para asegurar una mezcla adecuada, y luego agregue 1 μL a la reacción y mezcle bien.
6. Incubar a 25 °C durante la noche (16+ h).
7. Detenga la reacción LR añadiendo 0,5 μL de proteinasa K (2 μg/μL), incubar a 37 °C durante 10 min y luego enfriar a temperatura ambiente.
8. Transformar 3-4 μL de plásmido en células descongeladas y químicamente competentes añadiendo el plásmido y dejando que las células reposen sobre hielo durante 25-30 min.
9. Mientras las células se asientan sobre hielo, caliente dos placas de agar LB-ampicilina a temperatura ambiente.
10. Golpee térmicamente las células en un baño de agua a 42 ° C durante exactamente 30 s.
11. Después del choque térmico, añadir 250 μL de medios líquidos ricos y libres de antibióticos a las células, e incubar con agitación a 37 °C durante 1,5 h.
12. Extienda 300 μL de bacterias en una placa de ampicilina e incube a 37 ° C durante la noche.
13. A la mañana siguiente, examinar las colonias para detectar la presencia de dos fenotipos, claro y opaco, recoger las colonias claras (como se describe en Kwan et ^al.10) una a la vez, inocular el cultivo líquido y luego agitar a 37 °C durante la noche.
    NOTA: Las colonias claras casi siempre contienen la colonia LR correcta (>85% del tiempo).
14. Usando un kit comercial según las instrucciones del fabricante, realice una preparación de plásmido en cada cultivo líquido y digiera diagnósticamente cada plásmido para confirmar el tamaño apropiado de la construcción transgénica, lo que indica que la reacción de la puerta de enlace LR ha funcionado correctamente.
15. Vuelva a transformar las construcciones transgénicas correctas utilizando el protocolo estándar de transformación bacteriana como se describe en los pasos 5.4-5.12 utilizando 0.5-1 μL del plásmido, y solo incubar a 37 °C durante 1 h.
16. Vuelva a rayar las colonias y confirme que cada una tiene la construcción transgénica LR como en el paso 5.14.
17. Determinar la concentración de plásmidos como se describe en el paso 4.5 (se necesitan al menos 150 ng/μL para la inyección del embrión).

6. Inyección del transgén en los embriones

1. Descongele una muestra de ARNm transposasa de un solo uso y una construcción transgénica de Tol2 en hielo y advierta previamente una placa de inyección de agarosa a temperatura ambiente.
2. Combine lo siguiente en hielo: 150 ng de plásmido, 100 ng de ARNm de transposasa y 2% de rojo de fenol (0,3 μL). Luego, agregue agua sin ARN para compensar el volumen a 3 μL.
3. Transfiera embriones en estadio celular utilizando pipetas de transferencia a la placa de inyección (descrita en el paso 2) llena de EM que cubre completamente el agar, y luego presione suavemente aproximadamente 50-75 embriones por ranura de la placa de inyección.
4. Agregue la mezcla de ARNm/plásmido/rojo fenol al extremo abierto de una aguja de inyección capilar, coloque la aguja capilar en la armadura del equipo de inyección y encienda el equipo de inyección.
   NOTA:La plataforma de inyección utiliza gas comprimido, como aire, para pulsar el volumen deseado (descrito en el paso 6.5) de la mezcla de ARNm/plásmido/rojo fenol en el embrión cuando se activa.
5. Baje la aguja capilar en la EM de la placa de inyección y rompa la punta con pinzas para permitir que la plataforma de inyección bombee solo una pequeña cantidad de mRNA/plásmido/mezcla de rojo fenol.
6. Inyecte los embriones con un pequeño bolo de 3 nL de la mezcla de ARNm/plásmido/rojo fenol en el cuerpo celular del embrión.
   NOTA: Un bolo de 3 nL es un volumen de mezcla de ARNm/plásmido/rojo fenol en el que siete bolos pueden teóricamente encajar por igual a través de la línea media del embrión.
7. Cuando termine de inyectar los embriones, retírelos de la placa de inyección sacándolos suavemente de la ranura y transfiriéndolos pipeteándolos a una placa de Petri de 100 mm con EM fresca (aproximadamente 40 ml), y luego incubar a 28.5 ° C para permitir que los embriones se desarrollen.

7. Cribado de embriones para inserción transgénica

1. Para la expresión de proteínas fluorescentes, elija la etapa de desarrollo apropiada cuando se debe expresar el transgén fluorescente y detecte la presencia de fluorescencia bajo un microscopio de disección fluorescente.
   NOTA: Estos embriones serán mosaicos en su expresión y mostrarán una inserción genómica del constructo transgénico.
2. Detectar transgenes no fluorescentes mediante la detección de un marcador transgénico fluorescente (como se describe en el paso 7.1), como GFP impulsado por el promotor específico del corazón para el gen cmlc2 o mCherry impulsado por el promotor específico del cristalino de αcyrstallin, que están contenidos en distintos vectores de destino.
3. Permitir que los embriones positivos para la inserción transgénica se desarrollen completamente a las etapas adultas de pez cebra.
4. Una vez que los peces transgénicos potenciales alcancen la edad reproductiva, selecciónelos individualmente para detectar tanto la transmisión de la línea germinal como la expresividad transgénica criándolos en peces cebra de tipo salvaje.
5. Aquellos adultos cuyos embriones se desarrollan normalmente y dan la expresión transgénica más fuerte y apropiada se mantienen como líneas únicas de pez cebra transgénico para futuros trabajos y análisis.
   NOTA: Como enfoque alternativo a la detección de la inserción genómica de construcciones transgénicas, diseñe cebadores de PCR que solo amplifiquen la construcción transgénica y no el ADN de tipo salvaje.

Resultados

Para generar las construcciones transgénicas, utilizamos el sistema de transgénesis Tol2. Se utilizaron tres vectores de entrada, incluido p5E, que contiene los elementos promotores / potenciadores de genes, pME, que sostiene que el gen se expresa por los elementos promotores / potenciadores, y p3E que, como mínimo, contiene la cola de poliA, para generar la construcción transgénica a través de la clonación LR de puerta de enlace multisitio. El vector de destino, pDest, proporciona las repeticiones Tol2 para la ...

Discusión

El pez cebra es ideal para estudiar el impacto de la exposición al etanol en el desarrollo y los estados de enfermedad ^7,8. El pez cebra produce un gran número de embriones translúcidos, fertilizados externamente y genéticamente tratables, lo que permite la obtención de imágenes en vivo de varios tejidos y tipos de células marcados con transgenes simultáneamente en múltiples contextos ambientales^19,20. Es...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Caja de herramientas Addgene Tol2	https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
Air			Proporcionado directamente por la universidad
Ampicilina	Fisher Scientific	BP1760
Balanza analítica	VWR	10204-962
Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID Capilar	FHC	30-30-0
Cloruro de calcio	VWR	97062-590
Cloranfenicol	BioVision	2486
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500
Microscopio de disección fluorescente	Olympus	SZX16
Kanamicina	Fisher Scientific	BP906
Microscopio confocal de barrido láser	Olympus	Fluoview FV1000
Lawson Lab Preparación de plásmidos de donante	https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB Agar	Fisher Scientific	BP9724
LB	Caldo Fisher Scientific	BP1426
Agarosa de grado de baja EEO/multipropósito/biología molecular Fisher	Scientific	BP160-500
LR Clonasa II Plus Enzima	Fisher Scientific	12538200
Sulfato de magnesio (heptahidrato)	Fisher Scientific	M63-500
Micro Pipeta	Instrumentación Científica Aplicada	MIMPH-M-PIP
Tubo de microcentrífuga 0,5 mL	VWR	10025-724
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL	VWR	10025-716
Micromanipulador	Instrumentación Científica Aplicada	MM33
Puntas de micropipeta 10 μ L	Fisher Scientific	13611106
Puntas de micropipeta 1000 μ L	Fisher Scientific 13611127
Puntas de micropipeta 200 μ L	Fisher Scientific	13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcripción	Fisher Scientific	AM1340
Mosimann Lab Tol2 Hoja de cálculo	https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
Espectrofotómetro NanoDrop NanoDrop	ND-1000
NcoI	NEB	R0189S
NotI	NEB	R0189S Placas de
Petri 100 mm	Fisher Scientific	FB012924
Fenol Sal sódica roja	Sigma Aldrich	P4758-5G
Pipetman L p1000L Micropipeta	Gilson	FA10006M
Pipetman L p200L Micropipeta	Gilson	FA10005M
Pipetman L p2L Micropipeta	Gilson	FA10001M
Cloruro de potasio	Fisher Scientific	P217-500
Fosfato de potasio (Dibasic)	VWR	BDH9266-500G
Inyector de presión Instrumentación	científica aplicada	MPPI-3
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Bicarbonato de sodio	VWR	BDH9280-500G
Cloruro de sodio	Fisher Scientific	S271-500
Fosfato de sodio (dibásico)	Fisher Scientific	S374-500
Stericup .22 µ m sistema de filtración al vacío	Millipore	SCGPU11RE
Tol2 Página Wiki	http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 Químicamente Competentes E. coli	Fisher Scientific	C404010
Extractor de pipetas verticales	David Kopf Instruments	720
Molde de microinyección de pez cebra	Herramientas de ciencia adaptativa	i34