Detección de espermatozoides para el aislamiento rápido de ediciones de la línea germinal en el pez cebra

Resumen

Las tecnologías CRISPR-Cas han revolucionado el campo de la edición del genoma. Sin embargo, encontrar y aislar la edición de la línea germinal deseada sigue siendo un cuello de botella importante. Por lo tanto, este protocolo describe un método robusto para examinar rápidamente el esperma de pez cebra inyectado con CRISPR F0 para ediciones de la línea germinal utilizando técnicas estándar de PCR, digestión de restricción y electroforesis en gel.

Resumen

El advenimiento de las tecnologías de nucleasa CRISPR-Cas dirigidas ha revolucionado la capacidad de realizar una edición precisa del genoma en sistemas modelo establecidos y emergentes. Los sistemas de edición del genoma CRISPR-Cas utilizan un ARN guía sintético (sgRNA) para dirigir una endonucleasa asociada a CRISPR (Cas) a loci de ADN genómico específico, donde la endonucleasa Cas genera una ruptura de doble cadena. La reparación de roturas de doble cadena mediante mecanismos intrínsecos propensos a errores conduce a inserciones y / o eliminaciones, interrumpiendo el locus. Alternativamente, la inclusión de donantes de ADN bicatenario u oligonucleótidos de ADN monocatenario en este proceso puede provocar la inclusión de ediciones precisas del genoma que van desde polimorfismos de un solo nucleótido hasta pequeñas etiquetas inmunológicas o incluso grandes construcciones de proteínas fluorescentes. Sin embargo, un cuello de botella importante en este procedimiento puede ser encontrar y aislar la edición deseada en la línea germinal. Este protocolo describe un método robusto para detectar y aislar mutaciones de la línea germinal en loci específicos en Danio rerio (pez cebra); Sin embargo, estos principios pueden ser adaptables en cualquier modelo donde sea posible la recolección de espermatozoides in vivo .

Introducción

El sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas es una poderosa herramienta para realizar mutagénesis específica de loci y edición precisa del genoma en el sistema modelo Danio rerio (pez cebra) 1,2,3,4. La Cas-ribonucleoproteína (RNP) está compuesta por dos componentes principales: una endonucleasa Cas (comúnmente Cas9 o Cas12a) y un ARN guía sintético específico del locus (sgRNA)⁵. Juntos, el Cas-RNP genera una rotura de doble cadena (DSB) en el locus deseado que puede ser ....

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Texas en Austin (AUP-2021-00254).

1. Diseño del sgRNA para la mutagénesis CRISPR

1. Obtenga la secuencia de exones que contiene los loci objetivo.
2. Diseñar un ARN guía sintético (sgRNA) con un sitio de motivo adyacente protoespaciador (PAM) que sea específico para la endonucleasa Cas.
   1. Si se coinyecta una construcción donante, diseñe el sgRNA para que tenga ....

Resultados

Los enfoques experimentales descritos en este protocolo permiten la identificación más rápida de ediciones del genoma o alelos deletéreos putativos al centrarse en el análisis de miles de genomas derivados de la colección de espermatozoides masculinos inyectados con F0. La figura 2 destaca cómo interpretar los resultados obtenidos utilizando este protocolo.

Para generar mutaciones en el locus p2ry12, se inyectaron embriones de pez cebra en etapa unicelular con end.......

Discusión

Este protocolo describe un método para caracterizar rápidamente ediciones putativas del genoma o mutaciones dirigidas utilizando la tecnología CRISPR-Cas mediante un análisis centrado en los genomas de espermatozoides masculinos F0. Este protocolo debe ser susceptible a otros modelos animales donde el esperma esté fácilmente disponible para el muestreo sin eutanasia. Este método aumentará el rendimiento de la detección de las ediciones deseadas y es especialmente útil para identificar eventos aleatorios raros mediados po.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Polvo de agarosa	Fisher BioReagents	BP1356-100
Tanques de cría Carolina	Biological
Enzima de restricción BstNI	NEB	R0168S
	Thermo Scientific
Construcción de donantes de DNA10	Sigma-Aldrich	ADN oligotiótido en tubo; 0,025 nM, purificación por desalinización estándar, seco. enlace de fosforotioato en el donante en los tres primeros enlaces de fosfato en los extremos 5' y 3' (5'-CCTCTCTCCCTCTCTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT><><
	Sigma-Aldrich	ADN Oligo en tubo; 0.025 nM, purificación de desalinización estándar, seco (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3')
dnah10 imprimación inversa	Sigma-Aldrich	ADN Oligo en Tubo; 0,025 nM, purificación de desalinización estándar, seco ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3')
dnah10 sgRNA sintético	Synthego	SGRNA sintético, secuencia diana: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'Fuente de alimentación de
electroforesis	Thermo Scientific	105ECA-115
Pinzas de filtro	Millipore	XX6200006P
Fish (sistema) agua	Genérico	n/a
Sistema de electroforesis en gel (incluyendo marco de fundición, peine y cámara de electroforesis)	Thermo Scientific	Caja
	Azure Biosystems	AZI200-01
Tinción de gel, 10000X	Invitrogen	S33102
Cuenco de vidrio, 250 mL	Genérico	n/a
Tanques de aislamiento, 0.8 L	Aquaneering	ZT080
Microcap tubo capilar con bulbo, 20 y micro; L	Drummond	1-000-0020/CA
Minicentrífuga	Bio-Rad	12011919EDU
Micropipetas, varias con puntas apropiadas	Genéricos	n/a
Microondas	Genérico	n/a
Agua sin nucleasa	Promega	P119-C
Toallas de papel	Genéricas	n/a
Tubos de PCR, 0,2 mL	Bioexpress	T-3196-1
Cuchara de plástico, con agujeros/ranuras perforadas	Solución genérica	de n/a
KCl, 0,2 M sin ARNasa	Sigma-Aldrich	P9333
p2ry12 cebador directo	Sigma-Aldrich	ADN Oligo en tubo; 0,025 nM, purificación de desalinización estándar, seca (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3')
p2ry12 cebador inverso	Sigma-Aldrich	ADN Oligo en tubo; 0,025 nM, purificación de desalinización estándar, seca (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3')
p2ry12 sgRNA sintético	Synthego	SgRNA sintético, secuencia diana: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'Enzima
de restricción 10X Tampón	NEB	B6003SVIAL
solución de NaOH, 50 mM	Thermo Scientific	S318; 424330010
Esponja, corte de 1 pulgada x 1 pulgada con pequeña hendidura ovalada	Genérico	n/a
Microscopio estereoscópico	Zeiss	Stemi 508
Taq Mezcla maestra de polimerasa, 2X	Promega	M7122
TBE Buffer Concentrate, 10X	VWR	E442
Thermal Cycler	Bio-Rad 1861096
Papel tisú	Fisher Scientific	06-666
Solución de tricaína-metanosulfonato (Syncaine, MS-222), 0,016% en agua de pescado (pH 7,0± 0.2)	Syndel	200-266
Tris Base, 1M (tamponado con HCl a ph 8.0)	Promega	H5131

161937 Cas9 Endonucleasa IDT 1081060 escalera de ADN, 100 bp FERSM0241CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT de luz de imagen de gel B2