Siguiendo la dinámica de variantes estructurales en poblaciones evolucionadas experimentalmente

Summary

Desarrollamos un método rentable para seguir la dinámica del alelo de polimorfismo de un solo nucleótido que puede adaptarse fácilmente a los archivos congelados de evolución experimental. Una técnica de PCR triplete se combinó con electroforesis capilar paralela automatizada para cuantificar la frecuencia relativa de un alelo de inserción en el transcurso de la evolución experimental.

Abstract

Ahora se sabe que las variantes estructurales (SV) (es decir, deleciones, inserciones, duplicaciones e inversiones) desempeñan un papel importante en la variación fenotípica y, en consecuencia, en procesos como la determinación de enfermedades o la adaptación a un nuevo entorno. Sin embargo, las variantes de un solo nucleótido reciben mucha más atención que las SV, probablemente porque son más fáciles de detectar y sus efectos fenotípicos son más fáciles de predecir. El desarrollo de tecnologías de secuenciación profunda de lectura corta y larga ha mejorado considerablemente la detección de SV, pero la cuantificación de su frecuencia a partir de datos de secuenciación agrupada (poolseq) sigue siendo técnicamente compleja y costosa.

Aquí, presentamos un método bastante simple y económico, que permite a los investigadores seguir la dinámica de la frecuencia del alelo SV. Como ejemplo de aplicación, seguimos la frecuencia de inserción de una secuencia de inserción (IS) en poblaciones de bacterias en evolución experimental. Este método se basa en el diseño de tripletes de cebadores alrededor de los bordes de la variante estructural, de modo que los amplicones producidos por la amplificación de los alelos de tipo salvaje (WT) y derivados difieren en tamaño en al menos un 5%, y que su eficiencia de amplificación es similar. La cantidad de cada amplicón se determina entonces mediante electroforesis capilar paralela y se normaliza a una curva de calibración. Este método puede extenderse fácilmente a la cuantificación de la frecuencia de otras variantes estructurales (deleciones, duplicaciones e inversiones) y a enfoques de agrupamiento de poblaciones naturales, incluidas las poblaciones de patógenos dentro de los pacientes.

Introduction

Las variantes estructurales (SV) son alteraciones de la secuencia genómica, que generalmente afectan a 50 pb o más. Las cuatro categorías de SV descritas son inserciones grandes, eliminaciones grandes, inversiones y duplicaciones. Hasta hace poco, se ha prestado más atención a las variantes de un solo nucleótido (SNV) que a las variantes estructurales, en términos de sus efectos fenotípicos y su papel como determinantes genéticos de la enfermedad, o su contribución a la adaptación. Esto se debe probablemente a que es más fácil detectar SNV y predecir sus efectos fenotípicos. Sin embargo, las tecnologías de secuenciación profunda de lectura corta y larga han mejorado f....

Protocol

La configuración de este protocolo requiere un conocimiento preciso del punto de inserción, eliminación, inversión o duplicación dentro de la secuencia ancestral. Esta información generalmente se obtiene mediante secuenciación del genoma completo (WGS) de las muestras puntuales finales o intermedias. En el siguiente protocolo, se da el principio general para el caso de una mutación de inserción para cada paso, junto con un caso representativo donde se sigue la frecuencia de una inserción IS10 en el gen mutS en una población experimental de evolución de E. coli. En esta población, WGS de la población de punto final identificó la inserción de un IS10 ....

Results

Utilizando ADN extraído de un clon ancestral y un clon hipermutador aislado de la población S2.11 en la generación 1.000, establecimos la curva de calibración que se muestra en la Figura 2. Las proporciones mutantes reales de mezclas de ADN preparadas en laboratorio y medidas por el instrumento de electroforesis capilar paralela se unieron mediante una relación lineal de pendiente 1.0706, con un R² de 0.9705. Además, hubo un buen acuerdo entre las réplicas biológicas; La desviació.......

Discussion

Aquí, hemos propuesto un método rentable que permite seguir la dinámica de los alelos SV adaptativos emergentes en poblaciones de evolución experimental. Este método combina las técnicas clásicas de PCR y la electroforesis capilar paralela automatizada, lo que permite determinar las cantidades relativas de dos alelos. Una vez configurado, permite la cuantificación de proporciones alélicas en muchas muestras en paralelo, y es mucho menos costoso que WGS. Este método puede verse como un equivalente a la secuenciación de am.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Placa de PCR con faldón	de pozo 4titude	4Ti - 0740	PCR
Agarosa grado de biología molecular	Eurogentec	EP-0010-05	Electroforesis en gel de agarosa
Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Guía rápida para los sistemas de análisis de fragmentos Guía de	instrucciones en PDF	Agilent
Tampón TBE	Panreac appliChem	A4228,5000Pc	Electroforesis en gel de agarosa
Asas y agujas de inoculación desechables calibradas	LABELIANS	8175CSR40H	Cultivo bacteriano
Dneasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69506	Extracción de ADN
Electroforesis fuente de alimentación	Amilabo	ST606T	Electroforesis en gel de agarosa
Analizador de fragmentos Sistema CE automatizado	Agilent		Electroforesis capilar paralela
Escalera de ADN	Agilent	DNF-396, rango 1-6000bp	Electroforesis capilar paralela
BIORREACTIVO DE SAL DE SULFATO DE GENTAMICINA	Sigma-Aldrich	G1264-1G	Cultivo bacteriano
Marcador diluyente de alta sensibilidad	Agilent	DNF-373	Capilar paralelo electroforesis
Alta sensibilidad Kit de análisis cuantitativo NGS	Agilent	DNF-474	Electroforesis capilar paralela
Escalera de carga rápida 1 kb plus escalera de ADN	NEB	N0469S	Electroforesis en gel de agarosa
LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus	Millipore	28713	Cultivo bacteriano
Master Mix PCR Alta Fidelidad Phusion Flash	Thermo Fisher Scientific	F548L
PCR	Eurogentec		PCR
Prosize software de análisis de datos v.4	Agilent	V.4	Electroforesis capilar paralela
Ensayos Qubit	Invitrogen	MAN0010876	Cuantificación de ADN
Qubit dsDNA HS kit de ensayo	LIFE TECHNOLOGIES SAS	Q32854	Cuantificación de ADN
Termociclador	Eppendorf	Ep gradientes
PCR UVbox, eBOX VX5	Vilber Lourmat		Visualización de electroforesis en gel de agarosa
Agua para preparación inyectable	Aguettant	PROAMP	PCR