Artículo de método

Evaluación de las actividades antimicrobianas de nanopartículas y superficies nanoestructuradas in vitro

DOI:

10.3791/64712

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21 de abril de 2023

 ,  , 
1Microbiology Graduate Program, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside, 3Materials Science & Engineering Program, University of California, Riverside

En este artículo

Resumen

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Presentamos cuatro métodos para evaluar las actividades antimicrobianas de nanopartículas y superficies nanoestructuradas utilizando técnicas in vitro . Estos métodos se pueden adaptar para estudiar las interacciones de diferentes nanopartículas y superficies nanoestructuradas con una amplia gama de especies microbianas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las actividades antimicrobianas de nanopartículas y superficies nanoestructuradas, como plata, óxido de zinc, dióxido de titanio y óxido de magnesio, se han explorado previamente en entornos clínicos y ambientales y en productos alimenticios consumibles. Sin embargo, la falta de consistencia en los métodos experimentales y materiales utilizados ha culminado en resultados contradictorios, incluso entre estudios de los mismos tipos de nanoestructuras y especies bacterianas. Para los investigadores que desean emplear nanoestructuras como aditivo o recubrimiento en el diseño de un producto, estos datos contradictorios limitan su utilización en entornos clínicos.

Para enfrentar este dilema, en este artículo, presentamos cuatro métodos diferentes para determinar las actividades antimicrobianas de nanopartículas y superficies nanoestructuradas, y discutimos su aplicabilidad en diferentes escenarios. Se espera que la adaptación de métodos consistentes conduzca a datos reproducibles que puedan compararse entre estudios e implementarse para diferentes tipos de nanoestructuras y especies microbianas. Introducimos dos métodos para determinar las actividades antimicrobianas de las nanopartículas y dos métodos para las actividades antimicrobianas de las superficies nanoestructuradas.

Para las nanopartículas, el método de cocultivo directo se puede utilizar para determinar las concentraciones bactericidas mínimas inhibitorias y mínimas de nanopartículas, y el método de cultivo de exposición directa se puede utilizar para evaluar la actividad bacteriostática en tiempo real frente a la actividad bactericida resultante de la exposición a nanopartículas. Para superficies nanoestructuradas, el método de cultivo directo se utiliza para determinar la viabilidad de las bacterias indirectamente y directamente en contacto con superficies nanoestructuradas, y el método de exposición de contacto enfocado se utiliza para examinar la actividad antimicrobiana en un área específica de una superficie nanoestructurada. Discutimos las variables experimentales clave a considerar para el diseño del estudio in vitro al determinar las propiedades antimicrobianas de nanopartículas y superficies nanoestructuradas. Todos estos métodos son relativamente de bajo costo, emplean técnicas que son relativamente fáciles de dominar y repetibles para la consistencia, y son aplicables a una amplia gama de tipos de nanoestructuras y especies microbianas.

Introducción

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Solo en los Estados Unidos, 1.7 millones de personas desarrollan una infección adquirida en el hospital (HAI) anualmente, y una de cada 17 de estas infecciones resulta en la muerte1. Además, se estima que los costos de tratamiento de las IRAS oscilan entre $ 28 mil millones y $ 45 mil millones anuales 1,2. Estas IRAS están predominadas por Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM)3,4 y Pseudomonas aeruginosa4, que comúnmente se aíslan de infecciones crónicas de heridas y generalmente requieren un tratamiento extenso y tiempo para producir un resultado favorable para el paciente.

En las últimas décadas, se han desarrollado múltiples clases de antibióticos para tratar infecciones relacionadas con estas y otras bacterias patógenas. Por ejemplo, los análogos de la rifamicina se han utilizado para tratar MRSA, otras infecciones grampositivas y gramnegativas, y Mycobacterium spp.infecciones 5. En la década de 1990, para tratar eficazmente un número creciente de infecciones por M. tuberculosis, se combinaron medicamentos adicionales con análogos de rifamicina para aumentar su efectividad. Sin embargo, aproximadamente el 5% de los casos de M. tuberculosis siguen siendo resistentes a larifampicina5,6, y existe una creciente preocupación con respecto a las bacterias resistentes a múltiples fármacos7. Actualmente, el uso de antibióticos solos puede no ser suficiente en el tratamiento de las IRAS, y esto ha provocado una búsqueda continua de terapias antimicrobianas alternativas1.

Los metales pesados, como la plata (Ag)8,9,10 y el oro (Au)11, y la cerámica, como el dióxido de titanio (TiO2)12 y el óxido de zinc (ZnO)13, en forma de nanopartículas (NP) (AgNP, AuNP, TiO2NP y ZnONP, respectivamente) han sido examinados por sus actividades antimicrobianas y han sido identificados como posibles alternativas antibióticas. Además, los materiales biorreabsorbibles, como las aleaciones de magnesio (aleaciones de Mg)14,15,16, las nanopartículas de óxido de magnesio 17,18,19,20,21 y las nanopartículas de hidróxido de magnesio [nMgO y nMg(OH)2, respectivamente]22,23,24, también se han examinado. Sin embargo, los estudios antimicrobianos previos de nanopartículas utilizaron materiales y métodos de investigación inconsistentes, lo que resultó en datos que son difíciles o imposibles de comparar y a veces son de naturaleza contradictoria18,19. Por ejemplo, la concentración inhibitoria mínima (CMI) y la concentración bactericida mínima (CMM) de las nanopartículas de plata variaron significativamente en diferentes estudios. Ipe et al.25 evaluaron las actividades antibacterianas de AgNPs con un tamaño de partícula promedio de ~26 nm para determinar las CMI contra bacterias grampositivas y gramnegativas. Las CMI identificadas para P. aeruginosa, E. coli, S. aureus y SARM fueron 2 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL y 10 μg/mL, respectivamente. En contraste, Parvekar et al.26 evaluaron AgNPs con un tamaño de partícula promedio de 5 nm. En este caso, se encontró que la CMI AgNP y un MBC de 0,625 mg/ml eran efectivos contra S. aureus. Además, Loo et al.27 evaluaron AgNPs con un tamaño de 4,06 nm. Cuando E. coli fue expuesta a estas nanopartículas, la CMI y MBC fueron reportadas a 7.8 μg/mL. Finalmente, Ali et al.28 investigaron las propiedades antibacterianas de AgNPs esféricas con un tamaño promedio de 18 nm. Cuando P. aeruginosa, E. coli y MRSA fueron expuestos a estas nanopartículas, la CMI se identificó en 27 μg/mL, 36 μg/mL, 27 μg/mL y 36 μg/mL, respectivamente, y la MBC se identificó en 36 μg/mL, 42 μg/mL y 30 μg/mL, respectivamente.

Aunque la actividad antibacteriana de las nanopartículas ha sido ampliamente estudiada e informada durante las últimas décadas, no existe un estándar para los materiales y métodos de investigación utilizados para permitir comparaciones directas entre estudios. Por esta razón, presentamos dos métodos, el método de cocultivo directo (método A) y el método de exposición directa (método B), para caracterizar y comparar las actividades antimicrobianas de las nanopartículas manteniendo los materiales y métodos consistentes.

Además de las nanopartículas, las superficies nanoestructuradas también se han examinado para detectar actividades antibacterianas. Estos incluyen materiales a base de carbono, como nanoláminas de grafeno, nanotubos de carbono y grafito29, así como aleaciones puras de Mg y Mg. Cada uno de estos materiales ha exhibido al menos un mecanismo antibacteriano, incluido el daño físico impuesto a las membranas celulares por materiales a base de carbono y el daño a los procesos metabólicos o al ADN a través de la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) cuando Mg se degrada. Además, cuando el zinc (Zn) y el calcio (Ca) se combinan en la formación de aleaciones de Mg, se mejora el refinamiento del tamaño de grano de la matriz de Mg, lo que conduce a una reducción de la adhesión bacteriana a las superficies del sustrato en comparación con las muestras de solo Mg14. Para demostrar la actividad antibacteriana, presentamos el método de cultivo directo (método C), que determina la adhesión bacteriana sobre y alrededor de materiales nanoestructurados a lo largo del tiempo a través de la cuantificación de unidades formadoras de colonias bacterianas (UFC) con contacto superficial directo e indirecto.

La geometría de las nanoestructuras en las superficies, incluyendo el tamaño, la forma y la orientación, podría influir en las actividades bactericidas de los materiales. Por ejemplo, Lin et al.16 fabricaron diferentes capas nanoestructuradas de MgO en las superficies de sustratos de Mg mediante anodización y deposición electroforética (EPD). Después de un período de exposición a la superficie nanoestructurada in vitro, el crecimiento de S. aureus se redujo sustancialmente en comparación con el Mg no tratado. Esto indicó una mayor potencia de la superficie nanoestructurada contra la adhesión bacteriana en comparación con la superficie metálica de Mg no tratada. Para revelar los diferentes mecanismos de las propiedades antibacterianas de varias superficies nanoestructuradas, en este artículo se discute un método de exposición de contacto enfocado (método D) que determina las interacciones célula-superficie dentro del área de interés.

El objetivo de este artículo es presentar cuatro métodos in vitro que son aplicables a diferentes nanopartículas, superficies nanoestructuradas y especies microbianas. Discutimos las consideraciones clave para cada método para producir datos consistentes y reproducibles para la comparabilidad. Específicamente, el método de cocultivo directo17 y el método de exposición directa se utilizan para examinar las propiedades antimicrobianas de las nanopartículas. A través del método de cocultivo directo, las concentraciones mínimas inhibitorias y bactericidas mínimas (CMI y MBC90-99.99, respectivamente) se pueden determinar para especies individuales, y la concentración más potente (MPC) se puede determinar para múltiples especies. A través del método de exposición directa, los efectos bacteriostáticos o bactericidas de las nanopartículas a concentraciones inhibitorias mínimas pueden caracterizarse mediante lecturas de densidad óptica en tiempo real a lo largo del tiempo. El método de cultivo directo14 es adecuado para examinar bacterias directa e indirectamente en contacto con superficies nanoestructuradas. Finalmente, se presenta el método de exposición de contacto focalizado16 para examinar la actividad antibacteriana de un área específica en una superficie nanoestructurada mediante la aplicación directa de bacterias y la caracterización del crecimiento bacteriano en la interfaz célula-nanoestructura. Este método se ha modificado de la norma industrial japonesa JIS Z 2801:200016, y está destinado a centrarse en las interacciones microbio-superficie y excluir los efectos de la degradación de muestras a granel en el cultivo microbiano sobre las actividades antimicrobianas.

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Protocolo

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Para presentar los métodos de cocultivo directo y exposición directa, utilizamos nanopartículas de óxido de magnesio (nMgO) como material modelo para demostrar las interacciones bacterianas. Para presentar el cultivo directo y los métodos de exposición de contacto focalizado, utilizamos una aleación de Mg con superficies nanoestructuradas como ejemplos.

1. Esterilización de nanomateriales

NOTA: Todos los nanomateriales deben ser esterilizados o desinfectados antes del cultivo microbiano. Los métodos que se pueden utilizar incluyen calor, presión, radiación y desinfectantes, pero la tolerancia de los materiales para cada método debe identificarse antes de los experimentos in vitro .

  1. Nanopartículas
    NOTA: Las muestras pueden almacenarse en un disolvente orgánico como etanol o envasarse en un plato o caja seguido de esterilización o desinfección de manera adecuada. Las nanopartículas se esterilizaron utilizando el siguiente método para la demostración del método de cocultivo directo17 y el método de exposición directa.
    1. Esterilizar las nanopartículas de MgO en un horno de convección a 200 °C30 durante 60 minutos antes de cada experimento in vitro .
      NOTA: Este método fue elegido porque el vapor de agua y la luz UV pueden afectar las estructuras de las nanopartículas de MgO (nMgO)17.
  2. Materiales a granel
    NOTA: Los materiales nanoestructurados fueron esterilizados por el siguiente método para la demostración del método de cultivo directo.
    1. Para el método de cultivo directo14, desinfectar las muestras ZC21, Mg y T64 preparadas utilizando radiación ultravioleta (UV) durante 4 h antes de iniciar los estudios in vitro .
    2. Para el método de exposición en contacto focalizado16, desinfectar todas las muestras con radiación UV durante 2 h antes del inicio de los estudios in vitro .
  3. Alternativamente, use óxido de etileno (EtO) para la esterilización de materiales sensibles al calor.

2. Método de cocultivo directo (método A)

NOTA: En el método A, las bacterias en un cultivo de siembra en fase retardada se mezclan directamente con nanopartículas de ciertas concentraciones. Para el examen de las actividades antimicrobianas de nanopartículas, seguimos un protocolo descrito por Nguyen et al.17.

  1. Caracterización de nanopartículas y nanoestructuras
    NOTA: La composición y la forma de la nanoestructura se confirman mediante difracción de polvo de rayos X.
    1. Medición de nanopartículas
      1. Pesar las nanopartículas a 9 veces la masa deseada por ml para acomodar muestras de 3 ml por triplicado. Por ejemplo, pesar 0.2 mg/mL nMgO a 1.8 mg/mL.
        NOTA: Esto asegura la distribución consistente de nanopartículas en los cultivos bacterianos y caldos.
      2. Mida todas las nanopartículas en un tubo de microcentrífuga de 5,0 ml que haya sido previamente pesado y tarado utilizando una balanza analítica.
  2. Preparación y cultivo de cultivos de bacterias
    1. Para cada experimento in vitro , recuperar las reservas de células bacterianas del almacenamiento a -80 °C. Añadir 10 μL de cada cepa de bacterias en 5 ml de un medio de crecimiento apropiado.
    2. Colocar el medio inoculado en una incubadora-agitadora a 37 °C y 250 rpm durante aproximadamente 16 h durante la noche.
      1. Si se cultivan especies de Staphylococcus , subcultivar colocando 400 μL de cada cultivo nocturno en 20 ml de medio de crecimiento fresco (medio de 100 μL/5 ml) e incubar con agitación a 37 °C y 250 rpm durante 4-6 h adicionales.
  3. Lavado y conteo de las células bacterianas para determinar la densidad de siembra
    NOTA: La densidad de siembra deseada de 7.8 × 106 UFC/ml se identificó como el número celular mayor de lo que se requiere para confirmar una infección del tracto urinario.
    1. Recolectar bacterias cultivadas alícuotas 1 ml del cultivo de bacterias durante la noche en tubos de microcentrífuga de 1.5 ml. Cree un número suficiente de alícuotas de cultivos bacterianos durante la noche y centrifugarlos durante 10 minutos a 1.956 × g para alcanzar las densidades de siembra deseadas.
    2. Después de la centrifugación, pipeta para eliminar el sobrenadante de las células granuladas y colocar el sobrenadante en un recipiente de recolección. Resuspender los gránulos celulares en 0,5 mL de medio de crecimiento fresco. Combine dos suspensiones de 0,5 ml para crear 1 ml de suspensión para reducir a seis el número de alícuotas de 1 ml de células resuspendidas. Repita la centrifugación durante 10 minutos a 1.956 × g.
    3. Completar un segundo ciclo de lavado utilizando un medio de cultivo fresco, como en el paso 2.3.2, para reducir a tres el número de alícuotas de 1 ml de células lavadas resuspendidas.
    4. Completar el tercer ciclo, como en el paso 2.3.2, excepto resuspender los gránulos celulares en 0,33 ml de tampón Tris (hidroximetil) aminometano tampón (tampón Tris, pH 8,5). Combine las tres suspensiones, cada una de 0,33 ml de volumen, en una microcentrífuga de 1,5 ml. Repita la centrifugación durante 10 minutos a 1.956 × g.
      NOTA: El tampón Tris no contiene iones Mg 2+ o Ca2+ 31. Esto es importante para el uso de espectrometría de emisión óptica de plasma acoplada inductivamente (ICP-OES) para medir iones Mg 2+ y Ca2+ en caldos de postcultivo. En contraste, los fosfatos presentes en la solución salina tamponada con fosfato (PBS)32, por ejemplo, secuestran iones Mg 2+ o Ca2+ 33,34,35 y causan confusión en la interpretación de los datos ICP-OES.
    5. Retire el sobrenadante de las células peletizadas. Resuspender el pellet celular en 1 ml de tampón Tris fresco, conocido como suspensión celular, un cultivo de siembra bacteriana en fase de retraso.
    6. Determinar la concentración de suspensión celular (células/ml) usando un hemocitómetro.
  4. Creación del cultivo de bacterias de siembra
    NOTA: La muestra tiene un volumen total de 3 mL y se completa por triplicado (9 mL en total).
    1. Determinar el volumen total de cultivo de siembra de bacterias necesario. Para crear el cultivo de siembra, utilice C 1V1 = C 2 V2para calcular el volumen de la suspensión celular necesaria para crear un cultivo de siembra de 7,8 × 106 células/ml. Agregue el volumen calculado de la suspensión celular (V1) al volumen requerido de medios de crecimiento (V2).
    2. Determinar la densidad real de siembra de bacterias en UFC/ml. Cree una dilución en serie diez veces mayor a 10-4. Extienda la dilución 10-4 sobre el agar de crecimiento apropiado e incube durante la noche. Después de la incubación, cuente el número de colonias y calcule la UFC/ml.
  5. Formación de cultivos de bacterias y nanopartículas
    1. En placas de poliestireno no tratadas con tejidos de 12 pocillos, alícuota 2 ml del cultivo de siembra bacteriana en cada pocillo para el número de pocillos necesarios.
    2. Por cada tubo de microcentrífuga de 5 ml que contenga nMgO previamente pesado, añadir 3 ml del cultivo de siembra bacteriana. Vórtice brevemente para mezclar el nMgO con las bacterias. Alícuota 1 ml de la mezcla en tres pocillos separados para crear las muestras triplicadas de cada peso premedido de nMgO. Pipet la mezcla de bacterias/nMgO 2-3x antes de hacer cada alícuota de 1 ml para mantener el nMgO en suspensión.
      NOTA: Las muestras de control consistirán en 3 ml de células solamente, 3 ml de medios solamente, y 3 ml que contienen las concentraciones más bajas y más altas de nanopartículas utilizadas. Estos se preparan como en el paso 2.5.2. Todas las muestras de control se completan por triplicado.
    3. Incubar todas las placas de 12 pocillos a 37 °C y 120 rpm durante 24 h.
  6. Determinación del crecimiento celular bacteriano después de la exposición a nMgO
    1. Después de la incubación nocturna de los cultivos bacterianos, recolectar cada muestra de 3 ml pipeteando en un tubo cónico individual de 15 ml.
    2. Utilice una placa de 96 pocillos para crear diluciones seriadas 1:10. Determine el número de columnas necesarias para diluir en serie todas las muestras que contienen bacterias. Agregue 180 μL de tampón Tris a cada pocillo de la fila B a la fila G para el número apropiado de columnas.
    3. Realice brevemente un vórtice cada tubo cónico de 15 ml que contenga muestras bacterianas y agregue 50 μL a un pocillo individual en la fila A.
    4. Para cada pocillo de la fila A, transfiera 20 μL a la fila B (por ejemplo, A1 a B1) y mezcle brevemente mediante pipeteo para obtener un volumen de 200 μL. Utilizando una punta de pipeta estéril, transfiera 20 μL del pocillo de la fila B al pocillo de la fila C. Continuar este patrón hasta que el pocillo de la fila G contenga 200 μL, completando una dilución en serie de 10−1 en la fila B a 10−6 en la fila G.
    5. Pipeta 100 μL de cada pocillo en una placa de agar de crecimiento apropiada y extender a través de la placa para dispersar el cultivo celular. Colocar las placas en una incubadora-agitadora durante la noche a 37 °C. Incubar las placas a 37 °C durante 24 h.
    6. Examine las placas y cuente aquellas que tienen aproximadamente 25-300 colonias. Si es posible, elija placas del mismo valor de dilución. Utilice el número de colonias por placa para calcular la UFC/ml.
  7. Evaluación del pH post-incubación
    NOTA: Siga las instrucciones del fabricante para cada modelo de medidor de pH.
    1. Precalibre un medidor de pH utilizando soluciones estandarizadoras de pH 4, pH 7 y pH 10. Lea cada muestra bacteriana colocando la sonda de pH en el tubo cónico de 15 ml.
  8. Preparación de muestras para ICP-OES
    NOTA: ICP-OES se utiliza para determinar la concentración de iones Mg 2+ y Ca2+. Estos cationes se consideran importantes, ya que cada uno participa en el metabolismo celular.
    1. Centrifugar cada tubo cónico de 15 ml preparado en el paso 2.6.1 durante 5 min a 5.724 × g para granular los restos celulares y de nanopartículas.
    2. Usando un tubo cónico de 15 ml, diluir 30 μL del sobrenadante en 2,97 ml de 18,2 Ω agua filtrada para crear una dilución 1:100.
      NOTA: El factor de dilución se puede ajustar en función de las concentraciones de iones proyectadas y el límite de detección del instrumento del espectrómetro.
    3. Lea las muestras utilizando ICP-OES.

3. Método de exposición directa (método B)

NOTA: Si se desconoce la tasa de crecimiento de la bacteria elegida, entonces se debe completar una estandarización de la curva de crecimiento antes de implementar este método.

  1. Determinar las actividades bacteriostáticas y bactericidas en tiempo real tras la exposición a las nanopartículas de interés.
    1. Preparar las concentraciones deseadas de nanopartículas utilizando los métodos descritos en los pasos 2.1-2.1.2.2. Preparar dos series de cada peso de nanopartículas a utilizar: una para ser añadida a 3 mL de alícuotas de cultivo de bacterias en la fase logarítmica de crecimiento, y la otra para ser añadida a 3 mL de alícuotas de medio de crecimiento sin bacterias como grupos control.
    2. Determinar los antibióticos bacteriostáticos y bactericidas apropiados para las especies de bacterias a probar.
      NOTA: Se requiere el conocimiento de la concentración inhibitoria mínima para cada antibiótico.
  2. Calcule el volumen total de cultivo bacteriano necesario para triplicar muestras de 3 ml para todas las muestras de nanopartículas, antibióticos y control.
    NOTA: Se requiere un volumen igual de medio de crecimiento estéril. Si se planea el uso de espectrofotometría, esto requiere que se realicen ajustes en el volumen total necesario para acomodar el volumen de 0.5 ml a 1.0 ml necesario para las cubetas.
  3. Día 1: Para cada experimento in vitro, cree existencias durante la noche siguiendo los pasos 2.2.1-2.2.2.
  4. Día 2: Confirme que la configuración del lector de placas puede acomodar una placa de 96 pocillos con una densidad óptica de 600 nm. Medir las muestras en alícuotas de 200 μL utilizando una placa de 96 pocillos.
    1. Determinar un cultivo bacteriano inicial OD600 a 0,01, la densidad utilizada para comenzar el período de incubación inicial antes de la adición de nanopartículas y antibióticos.
    2. Recoja el cultivo de bacterias durante la noche de la incubadora-agitadora.
      1. Para cada material (por ejemplo, nanopartículas o antibióticos premedidos) a probar, cree un cultivo bacteriano separado a un OD600 de 0.01. Utilice un recipiente lo suficientemente grande como para acomodar el volumen de cultivo celular necesario (p. ej., un erlenmeyer esterilizado o tubos cónicos de 50 ml).
      2. Diluir las muestras bacterianas durante la noche con medio de crecimiento colocando tres alícuotas de 200 μL del medio de crecimiento en tres pocillos y tres alícuotas de 200 μL del cultivo bacteriano en pocillos adicionales (p. ej., A1 a A6).
      3. Coloque la placa de 96 pocillos en el lector de placas y escanéela.
        NOTA: Las lecturas se promedian para cada pozo escaneado para producir un valor medio.
      4. Para calcular la densidad de bacterias en suspensión, promedie el valor medio de cada pocillo que contiene una muestra triplicada.
      5. Para determinar la densidad óptica de las bacterias, reste el promedio de la muestra de caldo del promedio bacteriano.
      6. Si es necesario continuar ajustando la suspensión bacteriana, continúe agregando caldo o cultivo bacteriano durante la noche según sea necesario, y repita el escaneo en el lector de placas según sea necesario hasta que se alcance un OD600 de aproximadamente 0.01.
      7. Incubar a 37 °C con agitación a 150 rpm hasta alcanzar el crecimiento logarítmico.
  5. Retire los cultivos bacterianos del agitador de la incubadora.
    1. Alícuota 3 ml del cultivo bacteriano OD600 0.01 en tubos cónicos marcados de 15 ml para muestras de prueba y control por triplicado.
    2. Alícuota 200 μL del cultivo bacteriano en tres pocillos de una placa de 96 pocillos y medir las muestras utilizando el lector de placas.
    3. Calcule las lecturas descritas anteriormente en el paso 3.4.2.2 y el paso 3.4.2.6-la "lectura de -0.5 h".
  6. Creación y medición de mezclas de bacterias/nanopartículas
    1. Alícuota 3 ml de medio de crecimiento estéril en igual número que los cultivos bacterianos en tubos cónicos marcados de 15 ml para muestras de control (por triplicado).
    2. Para preparar suspensiones de bacterias/nanopartículas y suspensiones de medios/nanopartículas estériles, retire 1 ml de cultivo bacteriano o medio de cada conjunto triplicado de tubos cónicos de 15 ml.
      1. Coloque las alícuotas de 1 ml en un tubo de centrífuga de 5 ml que contenga nanopartículas medidas previamente y mezcle brevemente el vórtice.
      2. Desde el tubo de centrífuga de 5 ml, devolver 1 ml de alícuotas de las suspensiones bacteria/nanopartícula o medio/nanopartícula al tubo cónico de 15 ml para distribuir las nanopartículas homogéneamente.
        NOTA: Pipet la mezcla de bacterias/nanopartículas 2x-3x antes de pipetear cada alícuota de 1 ml para mantener las nanopartículas en suspensión.
  7. Creación y medición de mezclas bacteria/antibióticos
    1. Para crear los cultivos bacterianos/antibióticos, alícuota 3 ml del cultivo bacteriano incubado en los tubos cónicos de 15 ml etiquetados correspondientemente.
    2. Después de que se hayan preparado todas las muestras, alícuota 200 μL de cada muestra en los pocillos individuales de una placa de 96 pocillos.
    3. Coloque la(s) placa(s) en el lector de placas e inicie el escaneo: la lectura "0 h".
    4. Colocar los tubos cónicos de 15 ml que contienen las muestras en una incubadora-agitadora a 37 °C y 150 rpm. Registre todos los datos como se describió anteriormente en los pasos 3.4.2.2 y 3.4.2.6.
  8. Aproximadamente 15 minutos después de completar la lectura de 0 h, repita los pasos descritos en el paso 3.7.2-3.7.3-la lectura de "0.5 h".
    1. Después de las 0 h establecidas, repita los pasos descritos en el paso 3.7.2-paso 3.7.3 cada 90 min durante seis ciclos; Completo en 9 h.
    2. Una vez completado el sexto ciclo, colocar las muestras en la incubadora-agitadora durante 15 h adicionales a 37 °C y 150 rpm. Repita los pasos descritos en el paso 3.7.2-3.7.3 para obtener la lectura de 24 h. Registre todos los datos como se describió anteriormente en los pasos 3.4.2.2 y 3.4.2.6.

4. Método de cultivo directo (método C)

NOTA: En el método C, las bacterias en un cultivo de siembra en fase retardada se colocan directamente sobre las superficies nanoestructuradas de interés. Para el examen de las actividades antimicrobianas de la nanoestructura, seguimos un protocolo descrito por Zhang et al.14. Para demostrar este método de cultivo directo, se utilizaron pines ZC21 (aleación de Mg-Zn-Ca) y Mg como muestras.

  1. Preparación y cultivo de cultivos de bacterias
    1. Para cada experimento in vitro, crear existencias durante la noche siguiendo los pasos 2.2.1-2.2.2.
  2. Lavar y contar las bacterias para determinar la densidad de siembra
    NOTA: La densidad de siembra deseada de 7,5 × 105 UFC/ml fue identificada como la concentración celular reportada que causa infecciones ortopédicas14.
    1. Recupere el cultivo bacteriano durante la noche de la incubadora-agitadora.
    2. Lave y recoja las bacterias, siguiendo los pasos 2.3.2-2.3.2.3, pero reemplace el medio fresco con fluido corporal simulado revisado (rSBF) para cada paso de lavado.
      NOTA: rSBF es una solución tampón que imita la concentración iónica del plasma sanguíneo humano. Sin embargo, rSBF contiene sólo compuestos inorgánicos, y es sin ningún compuesto bioorgánico como proteínas. Para resolver esto, el suero fetal bovino (FBS) se combina con rSBF para simular la composición de la sangre humana para imitar mejor la formación natural de apatita en tejidos calcificados en condiciones experimentales36.
    3. Retire el sobrenadante de las células peletizadas. Resuspender el pellet celular en 1 ml de rSBF suplementado con 10% de FBS-la suspensión celular.
    4. Determinar la concentración de suspensión celular (células/ml) usando un hemocitómetro. Diluir la suspensión celular a una concentración de 7,5 × 105 células/ml en rSBF suplementado con 10% de FBS. Cree una referencia cultural de siembra siguiendo el paso 2.4.1.
    5. Determinar la densidad de siembra real siguiendo el paso 2.4.2.
  3. Distribuir la suspensión celular bacteriana sobre las muestras en los pocillos de cultivo.
    1. Coloque tanto las muestras como las muestras de control en los pocillos individuales de una placa de poliestireno no tratado con tejido de 48 pocillos.
    2. Alícuota 0,75 ml de la suspensión celular en cada pocillo que contenga las muestras y los controles. Colocar la(s) placa(s) de 48 pocillos en una incubadora-agitadora durante 24 h a 37 °C con agitación a 120 rpm.
  4. Caracterización de la concentración bacteriana
    1. Después de 24 h de incubación, recoja las muestras y colóquelas en tubos de recolección separados y etiquetados.
    2. Recoja dos muestras de cada grupo y colóquelas individualmente en tubos de microcentrífuga de 5.0 ml etiquetados. Agregue 2 ml de rSBF a cada tubo.
    3. Colocar las muestras recogidas en el paso 4.4.2 en un baño de sonicación y sonicar durante 10 min. Después de cada período de 5 minutos, vórtice cada muestra durante 5 s.
    4. Recoja el rSBF que contiene las células bacterianas recién desprendidas y coloque la suspensión en un tubo de microcentrífuga fresco y etiquetado.
  5. Diluciones seriadas y recubrimiento de las bacterias
    1. Diluir en serie y chapar la suspensión bacteriana siguiendo los pasos 2.6.2-2.6.6.
  6. Evalúe el pH posterior a la incubación de los medios de cultivo siguiendo el paso 2.7.
  7. Preparar el medio de postcultivo para ICP-OES siguiendo los métodos descritos en el paso 2.8.

5. Método de exposición por contacto focalizado (método D)

NOTA: En el método D, las bacterias en un papel de filtro de nitrocelulosa se ponen en contacto directo con un área de interés en las superficies nanoestructuradas. Este método minimiza la interferencia de la degradación de muestras a granel en cultivos bacterianos con las actividades bacterianas. Para examinar las actividades antimicrobianas de nanosuperficie, seguimos un protocolo descrito por Lin et al.16.

  1. Siga los procedimientos de los pasos 2.2.1-2.2.2.1 para crear un cultivo de siembra bacteriana. Confirme la densidad de siembra real siguiendo el paso 2.4.2.
  2. Prepare las muestras a un tamaño de 1 × 1 cm2 en forma cuadrada. Preparar todos los tipos de muestras por triplicado. Si es necesario, coloque las muestras en un soporte tridimensional (3D) de 15 mm de diámetro por 10 mm de altura. Coloque la muestra y el soporte en un pocillo de una placa de pocillo de poliestireno no tratada con cultivo de tejidos.
  3. Prepare papeles de nitrocelulosa esterilizados recortando cada uno a un diámetro de 1 cm. Coloque los papeles de nitrocelulosa preparados en una placa de agar que contenga el medio apropiado.
  4. Pipet 50 μL del cultivo bacteriano diluido en el papel de filtro.
  5. Pipeta 50 μL de un medio apropiado en el centro de cada superficie de muestra.
  6. Usando pinzas esterilizadas, recoja el papel de nitrocelulosa de la superficie del agar. Voltea con cuidado el papel de nitrocelulosa y colócalo sobre la superficie de la muestra para que las bacterias estén en contacto con los 50 μL de medio y la superficie nanoestructurada de interés.
  7. Agregue 1 ml de tampón Tris a cada pocillo que contenga una muestra para mantener la humedad. Incubar la placa de pocillo de poliestireno que contiene todas las muestras a 37 °C durante 24 h.
  8. Recoja el papel de nitrocelulosa de cada superficie de muestra. Coloque cada uno en 5 ml de tampón Tris. Vortex los papeles de filtro recolectados y muestras de material nanosuperficial durante 5 s.
  9. Sonicar cada muestra durante 10 min. Vórtice durante 5 s después de 5 minutos y nuevamente después de 10 minutos.
  10. Recoja las suspensiones tampón Tris de todas las muestras y coloque cada volumen en tubos de recolección frescos individuales.
  11. Diluir en serie y chapar las muestras siguiendo el paso 2.6.2-2.6.6.

6. Caracterización post-cultivo de bacterias y nanomateriales

  1. Examen de la adhesión bacteriana y morfología mediante microscopía electrónica de barrido (SEM)
    1. Después de la incubación durante la noche, agregue glutaraldehído al 10% en cada pocillo de la placa de poliestireno no tratado con tejido de 48 pocillos hasta que las muestras estén completamente cubiertas. Incubar las muestras durante 1 h para fijar las células bacterianas.
    2. Aspire el glutaraldehído en una botella de residuos y enjuague todas las muestras 3 veces con solución tampón Tris para eliminar las bacterias no adherentes.
    3. Deshidratar las muestras usando 30%, 75% y 100% de etanol durante 30 minutos cada16.
      NOTA: Se recomienda utilizar un secador de punto crítico para secar las muestras. No es ideal secar al aire las muestras a temperatura ambiente durante 24 h.
    4. Use cintas adhesivas conductoras, como cintas de cobre o carbono, para fijar las muestras en un talón SEM. Cubra las superficies de la muestra mediante un recubrimiento por pulverización catódica para proporcionar conductividad antes de la obtención de imágenes (p. ej., cubra las placas de Mg con bacterias adheridas bajo platino/paladio (Pt/Pd) durante 45 s a 20 mA16).
      NOTA: Los materiales de recubrimiento, el tiempo de procesamiento y la corriente de operación pueden variar según los tipos de muestra.
    5. Tome imágenes de las bacterias en las muestras utilizando SEM con una distancia de trabajo adecuada y voltaje de aceleración y en los aumentos deseados. Por ejemplo, utilice un SEM con un detector de electrones secundario para tomar imágenes a una distancia de trabajo de 5 mm y un voltaje de aceleración de 10 kV16.
  2. Examinar la morfología superficial de muestras de nanomateriales de postcultivo utilizando SEM.
    1. Para los nanomateriales, lave las muestras con Tris buffer 3x para eliminar las bacterias libres que no están adheridas a la muestra. Para las nanopartículas, disperse las partículas en un disolvente que no afecte las propiedades de la muestra a través de ultrasonidos para lograr una mejor dispersión cuando sea necesario.
    2. Seque las muestras después del procedimiento de lavado.
    3. Utilice cintas adhesivas de doble cara de carbono o cobre para adherir las muestras al talón SEM.
    4. Cree una capa superficial conductora de Pt/Pd utilizando una capa de pulverización catódica, como se describe en el paso 6.1.4, antes de la obtención de imágenes. Tome las imágenes de muestra como se describe en el paso 6.1.5.
    5. Analizar la composición elemental de la superficie utilizando EDS con un voltaje de aceleración apropiado y a los aumentos deseados (por ejemplo, a 10 kV después de realizar el análisis SEM16).
  3. Imágenes de fluorescencia de la adhesión bacteriana
    1. Prepare las muestras para ser visualizadas usando microscopía de fluorescencia lavándolas primero con Tris buffer 3x. Seque las muestras al aire a temperatura ambiente.
    2. Teñir cada muestra con colorante fluorescente de tioflavina T de 10 μM siguiendo el protocolo establecido37.
    3. Realice imágenes de fluorescencia de la adhesión bacteriana utilizando un microscopio invertido junto con una cámara digital de dispositivo de carga acoplada multiplicadora de electrones.

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Resultados

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La identificación de la actividad antibacteriana de nanopartículas de óxido de magnesio y superficies nanoestructuradas se ha presentado utilizando cuatro métodos in vitro que son aplicables a diferentes tipos de materiales y especies microbianas.

El método A y el método B examinan las actividades bacterianas cuando se exponen a nanopartículas en una fase de retraso (método A) y fase logarítmica (método B) durante una duración de 24 h o más. El método A proporciona resultados con resp...

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Discusión

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Hemos presentado cuatro métodos in vitro (A-D) para caracterizar las actividades antibacterianas de nanopartículas y superficies nanoestructuradas. Si bien cada uno de estos métodos cuantifica el crecimiento bacteriano y la viabilidad a lo largo del tiempo en respuesta a los nanomateriales, existe cierta variación en los métodos utilizados para medir la densidad de siembra bacteriana inicial, el crecimiento y la viabilidad a lo largo del tiempo. Tres de estos métodos, el método de cocultivo directo (A)

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Los autores aprecian el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias de los Estados Unidos (premio NSF CBET 1512764 y NSF PIRE 1545852), los Institutos Nacionales de Salud (NIH NIDCR 1R03DE028631), la Beca de Desarrollo Docente Regentes de la Universidad de California (UC), la Subvención Semilla del Comité de Investigación (Huinan Liu) y la Beca del Programa de Mentoría de Investigación de Posgrado de UC-Riverside otorgada a Patricia Holt-Torres. Los autores aprecian la asistencia proporcionada por la Instalación Central de Microscopía y Microanálisis Avanzados (CFAMM) en UC-Riverside para el uso de SEM / EDS y el Dr. Perry Cheung para el uso de XRD. Los autores también desean agradecer a Morgan Elizabeth Nator y Samhitha Tumkur por su ayuda con los experimentos y análisis de datos. Todas las opiniones, hallazgos, conclusiones o recomendaciones expresadas en este artículo son las de los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de la National Science Foundation o los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mLMilipore SigmaZ336777
80 L Horno de secado por convección con certificación NTRL MTI CorporationBPG-7082 tampón dehttps://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hidroximetil) aminometano pH 8.5; Tampón Tris Sigma-Aldrich 42457
AnaSpec  TIOFLAVINA T GRADO ULTRAPUROFisher Scientific50-850-291
Dispositivo de carga acoplada multiplicadora de electrones cámara digital HamamatsuC9100-13
Falcon 15 mL tubos cónicosFisher Scientific14-959-49B
GluteraldehídoSigma-Aldrich G5882
HemocitómetroBrightline, Hausser Scientific1492
Plasma acoplado inductivamente - espectrometría de emisión óptica (ICP-OES)PerkinMicroscopio inverso Elmer8000
NikonEclipse Ti-S
Luria Bertani CaldoSigma Ciencias de la Vida L3022
Caldo Luria Bertani + agarSigma Ciencias de la Vida L2897
MacroTube 5.0   Benchmark ScientificC1005-T5-ST
Nanopartículas de óxido de magnesioUS Research Nanomaterials, IncStock #:  US3310      MMgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro BalanceMettler ToledoMS105D
Papel nitrocelulósicoFisherbrand09-801A
Placa de poliestireno de 12 pocillos sin tratamiento tisularMarca Falcon Corning 
Placa de poliestireno de 48 pocillos sin tratamiento tisularMarca Falcon Corning 
Placa de poliestireno de 96 pocillos sin tratamiento tisularMarca Falcon Corning 
Placa de Petri de 100 mmVWR470210-568
Placa de Petri, 15 mmFB0875713A
Fisherbrand VWRSP70P
Microscopía electrónica de barrido (SEM)TESCAN Vega3 SBH
SonicatorVWR97043-936
Centrífuga de sobremesaFisher ScientificaccuSpin Micro 17
Centrífuga de sobremesa Centrífuga Eppendorf 5430
Agar de soja trípticoMP1010617
Caldo de soja trípticoSigma-Aldrich22092-500G
espectrofotómetro UV-Vis TecanInfinite 200 PROhttps://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10LVWRN/A
Defracción de potencia de rayos X  PanalyticalN/APANalytical Empyrean Series 2
351143351178351172 Medidor de pH de

Referencias

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