Los métodos para medir la actividad de ALDH1A1 en células vivas son críticos en la investigación del cáncer debido a su estado como biomarcador de tallo. En este estudio, empleamos una sonda fluorogénica selectiva de isoformas para determinar los niveles relativos de actividad de ALDH1A1 en un panel de cinco líneas celulares de cáncer de ovario.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Aplicación de AlDeSense para estratificar células de cáncer de ovario basadas en la actividad de aldehído deshidrogenasa 1A1
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La recaída después del tratamiento del cáncer a menudo se atribuye a la persistencia de una subpoblación de células tumorales conocidas como células madre cancerosas (CSC), que se caracterizan por su notable capacidad de iniciación y autorenovación tumoral. Dependiendo del origen del tumor (por ejemplo, ovarios), el perfil de biomarcadores de superficie de CSC puede variar drásticamente, lo que hace que la identificación de tales células a través de la tinción inmunohistoquímica sea un esfuerzo difícil. Por el contrario, la aldehído deshidrogenasa 1A1 (ALDH1A1) se ha convertido en un excelente marcador para identificar las CSC, debido a su perfil de expresión conservado en casi todas las células progenitoras, incluidas las CSC. La isoforma ALDH1A1 pertenece a una superfamilia de 19 enzimas que son responsables de la oxidación de varios aldehídos endógenos y xenobióticos a los productos de ácido carboxílico correspondientes. Chan et al. desarrollaron recientemente AlDeSense, una sonda de "encendido" selectiva de isoformas para la detección de la actividad de ALDH1A1, así como un reactivo de control de coincidencia no reactivo (Ctrl-AlDeSense) para tener en cuenta la tinción fuera del objetivo. Esta herramienta selectiva de isoformas ya ha demostrado ser una herramienta química versátil a través de la detección de la actividad de ALDH1A1 en células de leucemia mielógena K562, mamosferas y xenoinjertos CSC derivados del melanoma. En este artículo, la utilidad de la sonda se mostró a través de fluorimetría adicional, microscopía confocal y experimentos de citometría de flujo donde se determinó la actividad relativa de ALDH1A1 en un panel de cinco líneas celulares de cáncer de ovario.
Introducción
Las células madre cancerosas (CSC) son una subpoblación de células tumorales que exhiben propiedades similares a las células madre1. Al igual que sus contrapartes no cancerosas, las CSC poseen la extraordinaria capacidad de autorrenovarse y proliferar. Junto con otros mecanismos incorporados, como la regulación positiva de los transportadores de casetes de unión a ATP, las CSC a menudo se salvan de los esfuerzos quirúrgicos iniciales de citorreducción, así como de la terapia adyuvante posterior2. Debido a su papel crítico en la resistencia al tratamiento3, la recaída4 y la ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Medir la actividad total de ALDH1A1 en homogeneizados de células de cáncer de ovario a través de fluorimetría
- Descongelar 1 × 106 células en un matraz de cultivo celular T25 en 5 ml de los siguientes medios de cultivo celular:
- IGROV-1 y PEO4: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S).
- BG-1 y Caov-3: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) con 10% FBS y 1% P/S.
- OVCAR-3: RPMI 1640 con 20% FBS, 1% P/S y 0,01 mg/ml de insulina.
- Mantener las células en una incubadora a 37 °C y 5% deCO....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Actividad total de ALDH1A1 de los homogeneizados de células de cáncer de ovario
Los giros de pliegue promedio para cada línea celular obtenida de este ensayo son: BG-1 (1.12 ± 0.01); IGROV-1 (1,30 ± 0,03); Caov-3 (1,72 ± 0,06); PEO4 (2,51 ± 0,29); y OVCAR-3 (10,25 ± 1,46) (Figura 2).
Figura 2
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La panselectividad es una limitación importante de muchas sondas ALDH; Sin embargo, recientemente se han reportado varios ejemplos selectivos de isoformas 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. L.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Divulgamos una patente pendiente (US20200199092A1) para la tecnología AlDeSense.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R35GM133581 a JC) y el Centro de Cáncer en Illinois Graduate Scholarship (otorgado a SG). JC agradece el apoyo de la Fundación Camille y Henry Dreyfus. Los autores agradecen al Dr. Thomas E. Bearrood por su contribución inicial a la preparación de las existencias de AlDeSense y AlDeSense AM. Agradecemos al Sr. Oliver D. Pichardo Peguero y al Sr. Joseph A. Forzano por su ayuda en la preparación de diversos precursores sintéticos. Agradecemos al Prof. Erik Nelson (Departamento de Fisiología Molecular e Integrativa, UIUC) por las células Caov-3, IGROV-1 y PEO4. Agradecemos al Prof. Paul Hergenrother (Depart....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.25% Tripsina, 0.1% EDTA en HBSS sin Corning de Bicarbonato de Calcio, Magnesio y Sodio | 25-050-CI | ||
| 1x Tampón de fosfato solución | salina Corning | 21-040-CMX12 | |
| AccuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| AlDeSense | Sintetizado internamente | ||
| BG-1 | Un regalo proporcionado por el Prof. Paul Hergenrother Lab, Universidad de Illinois Urbana-Champaign | ||
| BioLite 25cm2 Matraz | Thermo Fisher Scientific | ||
| Armario de bioseguridad serie 1300 A2 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Caov-3 | Un regalo proporcionado por el Prof. Erik Nelson Lab, Universidad de Illinois Urbana-Champaign | ||
| Homogeneizador de células | Fisher Scientific | ||
| Centrifuge 5180R | Eppendorf | 22627040 | |
| Contrl-AlDeSense | DMEM sintetizado | ||
| internamente, 10% FBS, 1% P/S | Preparado por la célula UIUC | ||
| Tubos de ensayo de poliestireno de fondo redondo Falcon con tapón a presión de filtro de celdas, 5 ml | Corning | 352003 | |
| FCS Express 6 | proporcionado por UIUC Microscopio CMtO | ||
| FL | EVOS Fluorómetro EVOS | ||
| fotones | |||
| International Forma Series II CO2 con camisa de agua Incubadora | Fisher Scientific | 3110 | |
| IGROV-1 | Un regalo proporcionado por el Prof. Erik Nelson Lab, Universidad de Illinois Urbana-Champaign | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Innova 42R Incubado Shaker | |||
| LSM 700 | Zeiss | ||
| LSR II | BD | ||
| Sistema de cubreobjetos de borosicilato con cámara #1.0 de Nunc Lab-Tek | Thermo Fisher Scientific | ||
| OVCAR-3 | ATCC | HTB-161 | |
| PEO4 | Un regalo proporcionado por el Prof. Erik Nelson Lab, Universidad de Illinois Urbana-Champaign | ||
| Pierce Inhibidor de la proteasa Tabletas | Thermo Scientific | A32963 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Balancín | VWR | ||
| RPMI, 10% FBS, 1% P/S | Preparado por el centro de medios celulares | ||
| RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0,01 mg/mL Insulina | Preparada por el centro de medios celulares de la UIUC |
Referencias
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukaemia is organised as a heirarchy that originates from a primitive haematopoetic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC tr....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
