Métodos optimizados para la inmovilización superficial de colágenos y ensayos de unión de colágeno

Resumen

Este trabajo presenta un protocolo optimizado para inmovilizar y cuantificar de forma reproducible colágeno tipo I y III en microplacas, seguido de un protocolo mejorado de ensayo de unión in vitro para estudiar las interacciones colágeno-compuesto utilizando un método de fluorescencia resuelto en el tiempo. Se proporciona el posterior análisis de datos paso a paso y la interpretación de los datos.

Resumen

La fibrosis se produce en varios tejidos como respuesta reparadora a una lesión o daño. Sin embargo, si es excesiva, la fibrosis puede provocar cicatrices en los tejidos e insuficiencia orgánica, lo que se asocia con una alta morbilidad y mortalidad. El colágeno es un impulsor clave de la fibrosis, siendo el colágeno tipo I y tipo III los principales tipos involucrados en muchas enfermedades fibróticas. A diferencia de los protocolos convencionales utilizados para inmovilizar otras proteínas (por ejemplo, elastina, albúmina, fibronectina, etc.), no se dispone de protocolos completos para inmovilizar de forma reproducible diferentes tipos de colágeno con el fin de producir recubrimientos estables. La inmovilización del colágeno es sorprendentemente desafiante porque múltiples condiciones experimentales pueden afectar la eficiencia de la inmovilización, incluido el tipo de colágeno, el pH, la temperatura y el tipo de microplaca utilizada. Aquí, se proporciona un protocolo detallado para inmovilizar y cuantificar de manera reproducible los colágenos de tipo I y III, lo que da como resultado geles/películas estables y reproducibles. Además, este trabajo demuestra cómo realizar, analizar e interpretar estudios de unión a fluorescencia resueltos en el tiempo in vitro para investigar las interacciones entre los colágenos y los compuestos candidatos a unirse al colágeno (por ejemplo, un péptido conjugado con un quelato metálico que transporta, por ejemplo, europio [Eu(III)]). Este enfoque se puede aplicar universalmente a diversas aplicaciones biomédicas, incluido el campo de la imagen molecular para desarrollar sondas de imagen dirigidas, el desarrollo de fármacos, los estudios de toxicidad celular, los estudios de proliferación celular y los inmunoensayos.

Introducción

La acumulación de tejido conectivo fibroso como parte del proceso natural de cicatrización de heridas después de una lesión tisular se conoce como fibrosis. Sin embargo, si la deposición de tejido fibroso no termina y continúa más allá de lo necesario para la reparación del tejido, entonces la fibrosis se vuelve excesiva ^1,2. La fibrosis excesiva deteriora la fisiología y la función de los órganos y podría provocar daños en los órganos y, potencialmente, insuficiencia orgánica ^3,4,5. ....

Protocolo

NOTA: Toda la información del producto utilizada para este trabajo se presenta en la Tabla de Materiales.

1. Inmovilización de colágeno

NOTA: Asegúrese de que cada pocillo de la microplaca utilizada durante el ensayo de unión tenga pocillos adyacentes libres para evitar la fluorescencia cruzada. Realiza esta parte del protocolo con hielo porque el colágeno se autoensambla al aumentar las temperaturas y los niveles de pH. Realice este procedimiento en una campana de cultivo de tejidos y en condiciones estériles porque las microplacas se incuban posteriormente en una incubadora de cu....

Resultados

Evaluación de la estabilidad y concentración de colágeno tipo I y tipo III inmovilizado en geles/películas
La cuantificación de la concentración de colágeno inmovilizado por pocillo se realizó utilizando tres condiciones diferentes: a) en pocillos sin lavado con PBS después de inmovilizar las proteínas (sin lavado); b) en pocillos con una etapa de lavado (dos veces con PBS) después de la inmovilización para eliminar cualquier proteína no recubierta; c) en pocillos después de la incubación con PBS dura.......

Discusión

Este trabajo presenta un método reproducible para inmovilizar colágeno tipo I y tipo III. También se muestra un protocolo para adquirir, analizar e interpretar in vitro los datos de unión a TRF de Eu(III) para caracterizar las propiedades de unión de un ligando candidato hacia el colágeno de tipo I y III. Los protocolos de inmovilización de colágeno tipo I y tipo III que aquí se presentan se desarrollaron y optimizaron teniendo en cuenta trabajos publicados previamente sobre la .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10x PBS	Gibco	14200075	Úselo para hacer 1x PBS diluyendo en agua (1:10)
10x PBS	Gibco	14200075	Úselo para hacer 1x PBS diluyendo en agua (1:10)
2M HCL			Hecho internamente y los detalles están en el documento de respaldo
2M HCL			Hecho en casa y los detalles están en el documento de respaldo
2M Hidróxido de sodio +2M glicina			Hecho en casa y los detalles están en el documento de respaldo
2M Hidróxido de sodio +2M glicina			Hecho en casa y los detalles están en el documento de respaldo
Microplaca Cell-star 96 pocillos	Greiner Bio-One	655 160
Cell-star 96 pocillos  microplaca	Greiner Bio-One	655 160
Solución de mejora DELFIA	Perkin Elmer	1244-104
Solución de mejora DELFIA	Perkin Elmer	1244-104
Ice
Hielo
Lector de microplacas Infinite 200 PRO NanoQuant	TECAN
Infinite 200 PRO NanoQuant	Microplacas de
	Corning	3641
Microplacas de 96 pocillos no vinculantes (NBS)	Electrodo de	Corning 3641
Rutina Inlab	Mettler Toledo
Electrodo de pH Inlab Routine	Mettler Toledo		Medidor de
pH 51343050 (sevenCompact)	Mettler Toledo
Medidor de pH (sevenCompact)	Mettler Toledo
Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA	Thermofisher	23227
Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA	Thermofisher	23227
Incubadora de cultivo de tejidos (37 ° C, 5% CO2)
Colágeno bovino tipo I, 3 mg/mL	Corning	354231
Colágeno de placenta humana tipo III, 0,99 mg/mL	Advanced Biomatrix	5021

Lector de microplacas 96 pocillos no vinculantes (NBS) de TECAN pH 51343050