Artículo de método

Determinación de la absorción, translocación y distribución de imidacloprid en trigo

DOI:

10.3791/64741

⸱

28 de abril de 2023

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Agricultural Environment in Universities of Shandong, College of Resources and Environment, Shandong Agricultural University, 2College of Water Conservancy and Civil Engineering, Shandong Agricultural University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se presenta un protocolo para la determinación de la absorción, translocación y distribución de imidacloprid en trigo en condiciones hidropónicas utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS-MS). Los resultados mostraron que el imidacloprid puede ser absorbido por el trigo, y el imidacloprid se detectó tanto en las raíces como en las hojas del trigo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los neonicotinoides, una clase de insecticidas, son ampliamente utilizados debido a sus nuevos modos de acción, alta actividad insecticida y fuerte absorción de raíces. El imidacloprid, el insecticida más utilizado en todo el mundo, es un neonicotinoide representativo de primera generación y se utiliza en el control de plagas para cultivos, hortalizas y árboles frutales. Con una aplicación tan amplia de imidacloprid, su residuo en los cultivos ha atraído un escrutinio cada vez mayor. En el presente estudio, 15 plántulas de trigo se colocaron en un medio de cultivo que contenía 0,5 mg / L o 5 mg / L de imidacloprid para hidrocultivo. El contenido de imidacloprid en las raíces y hojas de trigo se determinó después de 1 día, 2 días y 3 días de hidrocultivo para explorar la migración y distribución de imidacloprid en el trigo. Los resultados mostraron que el imidacloprid se detectó tanto en las raíces como en las hojas de la planta de trigo, y el contenido de imidacloprid en las raíces fue mayor que en las hojas. Además, la concentración de imidacloprid en el trigo aumentó con el aumento del tiempo de exposición. Después de 3 días de exposición, las raíces y hojas del trigo en el grupo de tratamiento de 0,5 mg/L contenían 4,55 mg/kg ± 1,45 mg/kg y 1,30 mg/kg ± 0,08 mg/kg de imidacloprid, respectivamente, mientras que las raíces y hojas del grupo de tratamiento de 5 mg/L contenían 42,5 mg/kg ± 0,62 mg/kg y 8,71 mg/kg ± 0,14 mg/kg de imidacloprid, respectivamente. Los resultados del presente estudio permiten una mejor comprensión de los residuos de plaguicidas en los cultivos y proporcionan una referencia de datos para la evaluación del riesgo ambiental de los plaguicidas.

Introducción

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En la agronomía actual, el uso de pesticidas es esencial para aumentar el rendimiento de los cultivos. Los insecticidas neonicotinoides alteran el equilibrio del potencial de membrana al controlar los receptores nicotínicos de acetilcolina en el sistema nervioso del insecto, inhibiendo así la conducción normal del sistema nervioso central del insecto, lo que lleva a la parálisis y muerte de los insectos1. En comparación con los insecticidas tradicionales, los neonicotinoides tienen ventajas tales como nuevos modos de acción, alta actividad insecticida y fuerte absorción de raíces, lo que los hace altamente exitosos en el mercado de plaguicidas 2,3. Se informó que el volumen de ventas de neonicotinoides representó el 27% del mercado mundial de pesticidas en 2014. La tasa de crecimiento anual promedio de los neonicotinoides fue del 11,4% de 2005 a 2010, de los cuales alrededor del 7% se registró en China 4,5,6. Desde finales de 2016 hasta el primer semestre de 2017, las ventas de plaguicidas en China comenzaron a repuntar después de caer, y los precios de los plaguicidas continuaron aumentando, entre los cuales los insecticidas neonicotinoides mostraron un aumento significativo de precios7. Hasta ahora, se han desarrollado tres generaciones de insecticidas neonicotinoides, cada uno con cloruro de piridina, tiazolilo y grupos tetrahidrofuranos de nicotina, respectivamente8.

El imidacloprid representa la primera generación de insecticidas neonicotinoides, cuya fórmula molecular esC9H10ClN5O2, y es un cristal incoloro. El imidacloprid se utiliza principalmente para controlar plagas, como pulgones, saltamontes, gusanos de la harina y trips9 y se puede aplicar a cultivos como arroz, trigo, maíz, algodón y hortalizas como papas, así como árboles frutales. Debido a la aplicación a largo plazo, sustancial y continua de plaguicidas, tanto los insectos beneficiosos como los enemigos naturales de las plagas se han reducido rápidamente, y algunas plagas agrícolas se han vuelto resistentes a los plaguicidas, lo que resulta en un círculo vicioso de aplicación continua y creciente de pesticidas10. Además, la aplicación extensiva de plaguicidas ha provocado el deterioro de la calidad del suelo, la persistencia de residuos de plaguicidas en los productos agrícolas y otros problemas ecológicos, que no solo causan daños significativos al medio ambiente ecológico agrícola11 sino que también representan una grave amenaza para la salud humana12. La fumigación con pesticidas afecta gravemente el crecimiento y la calidad de los microbios del suelo y los animales del suelo13. El uso irrazonable o excesivo de plaguicidas ha causado riesgos significativos para la seguridad del medio ambiente del suelo y el agua, los animales y las plantas, e incluso la vida humana14. En los últimos años, el problema de los residuos excesivos de plaguicidas en los cultivos se ha agravado con la aplicación extensiva de plaguicidas. Cuando se utilizó imidacloprid para aumentar el rendimiento vegetal, la tasa de absorción de imidacloprid en los vegetales aumentó con el aumento en la cantidad y el residuo de imidacloprid15. Como cultivo alimentario importante, tanto la producción como la seguridad del trigo son críticas. Por lo tanto, es necesario aclarar las políticas de residuos y distribución de plaguicidas utilizados para el trigo.

En los últimos años, se han desarrollado muchos métodos para extraer residuos de imidacloprid del agua, el suelo y las plantas. El método QuEChERS (rápido, fácil, barato, eficaz, robusto y seguro) es un nuevo método que combina la tecnología de microextracción en fase sólida y la tecnología de extracción en fase sólida dispersa e implica el uso de acetonitrilo como disolvente de extracción y la eliminación de impurezas mixtas y agua en la muestra utilizando NaCl y MgSO anhidro4, respectivamente16. El método QuEChERS requiere un mínimo de cristalería y tiene pasos experimentales simples, lo que lo convierte en uno de los métodos de extracción de pesticidas más populares17. Para la detección de imidacloprid, se ha alcanzado un límite de detección tan bajo como 1 × 10−9 g18 con cromatografía líquida (LC), y 1 × 10−11 g 19 se ha logrado con cromatografía de gases (GC). Debido a su alta resolución y sensibilidad, LC-MS y GC-MS han mostrado límites de detección de imidacloprid aún más bajos de 1 × 10-13 a 1 × 10-14 g20,21; Estas técnicas son, por lo tanto, muy adecuadas para el análisis de trazas de residuos de imidacloprid.

En el presente estudio, el imidacloprid fue elegido como el contaminante objetivo, y el trigo fue seleccionado como el cultivo de prueba para estudiar la distribución de los residuos de imidacloprid en el trigo. Este protocolo detalla un método para el análisis exhaustivo del enriquecimiento y la transferencia del pesticida imidacloprid en el trigo mediante la exploración de la absorción y el almacenamiento de imidacloprid en diferentes partes de las plantas de trigo cultivadas en condiciones hidropónicas. El presente estudio tiene como objetivo proporcionar una base teórica para la evaluación del riesgo de los residuos de plaguicidas en el trigo, guiar la aplicación racional de plaguicidas en las actividades de producción agrícola para reducir los residuos de plaguicidas y mejorar la inocuidad de la producción de cultivos.

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Protocolo

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1. Germinación de semillas de trigo

  1. Seleccione 1.000 semillas de trigo (Jimai 20) con gránulos completos, embriones intactos y tamaño uniforme (longitud: 6 mm ± 0,5 mm).
  2. Transfiera 333,3 ml de solución de H2O2 al2 al 30% a un matraz aforado de 1 L y diluya con agua desionizada para preparar 1 L de solución deH2O2al10%. Sumerja las semillas de trigo en una solución deH2O2O2 al 10% durante 15 min para desinfectar la superficie de la semilla (Figura 1).
  3. Enjuague las semillas de trigo 5 veces con agua corriente estéril durante 10 s cada vez.
  4. Extienda las semillas de trigo uniformemente con los embriones apuntando hacia arriba en una placa de Petri de vidrio que contenga papel de filtro estéril húmedo (Figura 2). Coloque la placa de Petri en una incubadora de clima artificial a 30 °C y 80% de humedad relativa. Cultive las semillas de trigo en la oscuridad durante 3 días hasta que germinen y echen raíces.

figure-protocol-1
Figura 1: Desinfección de las semillas de trigo. Las semillas de trigo se remojaron en una solución deH2O2al 10% (en un vaso de precipitados) durante 15 minutos para desinfectar la superficie de la semilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Germinación de las semillas de trigo. Las semillas de trigo se extendieron uniformemente en una placa de Petri de vidrio que contenía papel de filtro estéril húmedo. La placa de Petri se colocó en una incubadora de clima artificial para germinar las semillas de trigo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Cultivo de plántulas de trigo

  1. Disolver 551 mg de la mezcla de sales basales de Hoagland en 1 L de agua desionizada para preparar 1/2 solución nutritiva de Hoagland (que contiene 0,75 mmol/L K2SO 4, 0,1 mmol/L KCl, 0,6 mmol/L MgSO 4, 4,0 × 10−2 mmol/L FeEDTA, 1,0 × 10−3 mmol/L H 3 BO3, 1,0 × 10−3 mmol/L MnSO4, 1.0 × 10−3 mmol/L ZnSO 4, 1.0 × 10−4 mmol/L CuSO 4, y 5.0 × 10−6 mmol/L Na2 MoO 4).
  2. Después de que las semillas de trigo (paso 1.4) hayan germinado, coloque 15 plántulas de trigo en equipos hidropónicos (consulte la Tabla de materiales) que contengan 100 ml de 1/2 solución nutritiva Hoagland para hidroponía (Figura 3). Colocar todo el aparato hidropónico en una incubadora de clima artificial (ver Tabla de materiales) e incubar durante 7 días a 25 °C y 80% de humedad relativa con un fotoperiodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad.

figure-protocol-3
Figura 3: Cultivo hidropónico de las plántulas de trigo. Las plántulas de trigo se cultivaron hidropónicamente durante 0 días, 3 días y 7 días en 100 ml de 1/2 solución nutritiva Hoagland. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Experimento exponiendo las plantas de trigo a la solución de imidacloprid

  1. Después de un período hidropónico de 7 días, transplante las plantas de trigo en 1/2 solución nutritiva Hoagland que contenga 0.5 mg / L o 5 mg / L de imidacloprid para realizar los experimentos de exposición a imidacloprid. Cultiva 15 plantas de trigo en cada dispositivo hidropónico. Establezca 15 dispositivos hidropónicos para cada grupo de concentración de imidacloprid para garantizar que se tomen muestras adecuadas durante el muestreo.
  2. Coloque todo el equipo hidropónico en una incubadora de clima artificial durante 3 días a 25 °C y 80% de humedad relativa con un fotoperiodo de 16 h claro/8 h oscuro.
  3. A lo largo del período de exposición, recolecte las raíces de trigo (0,2 g por planta de trigo) y las hojas (0,5 g por planta de trigo) diariamente. Integrar las muestras de trigo de cada quinto dispositivo hidropónico como un grupo paralelo y determinar el contenido de imidacloprid de las muestras.

4. Procedimiento para extraer imidacloprid del trigo

  1. Extracción de imidacloprid de raíces de trigo
    1. Para evitar errores experimentales, lave las raíces de trigo 4 veces con agua corriente estéril durante 10 s cada vez para eliminar cualquier imidacloprid adsorbido en la superficie de la raíz.
    2. Triturar las raíces de trigo en trozos de aproximadamente 1 cm con tijeras (Figura 4). Pesar 10,00 g de las raíces de trigo trituradas y colocar en un tubo de centrífuga de 50 ml.
    3. Agregue 10 ml de acetonitrilo al tubo de centrífuga y voltee el tubo en un vórtice durante 1 minuto. A continuación, añadir 4 g de MgSO anhidro4 y 1,5 g de NaCl al tubo de centrífuga y hacer vórtice el tubo inmediatamente durante 30 s. Centrifugar el tubo durante 5 min a 6.000 x g.
    4. Aspirar el sobrenadante con una jeringa desechable y pasarlo a través de un filtro de jeringa (tamaño de poro de 0,22 μm) para obtener la muestra.
  2. Extracción de imidacloprid de hojas de trigo (Figura 5)
    1. Triture las hojas frescas de trigo en trozos de aproximadamente 1 cm con tijeras (Figura 4). Pesar 10,00 g de las hojas de trigo trituradas y colocar en un tubo de centrífuga de 50 ml.
    2. Agregue 10 ml de acetonitrilo al tubo de centrífuga y vortex el tubo en un vórtice durante 1 minuto.
    3. Añadir 4 g de MgSOanhidro 4 y 1,5 g de NaCl al tubo de centrífuga y vortex el tubo inmediatamente durante 30 s.
    4. Centrifugar el tubo durante 5 min a 6.000 x g.
    5. Después de la centrifugación, añadir 2 ml del sobrenadante a un tubo de centrífuga de 5 ml que contenga 50 mg de negro de humo grafitizado (GCB) y 150 mg de MgSOanhidro 4 (para eliminar el pigmento y la humedad de la muestra), y vortex el tubo de centrífuga durante 30 s (Figura 6). Centrifugar el tubo durante 5 min a 6.000 x g.
    6. Aspirar el sobrenadante con una jeringa desechable y pasarlo a través de un filtro de jeringa (tamaño de poro de 0,22 μm) para obtener la muestra.

figure-protocol-4
Figura 4: Raíces y hojas de trigo trituradas. Las raíces y hojas frescas de trigo se trituraron con tijeras en trozos de aproximadamente 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-5
Figura 5: Extracción de imidacloprid en las hojas de trigo. El imidacloprid en las muestras se extrajo utilizando el método QuEChERS (pasos 4.2.1-4.2.4 del protocolo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-6
Figura 6: Purificación de imidacloprid en las hojas de trigo. El descontaminante fue de 50 mg GCB + 150 mgMgSO4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Cuantificación de imidacloprid

  1. Cuantificar el imidacloprid en la muestra mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS-MS), basada en una curva estándar (y = 696,61x + 56,411, R=1) obtenida a partir de concentraciones de 0,2-250 μg/L de imidacloprid. (Figura 7). El espectrómetro de masas estaba equipado con una columna C18 (100 mm x 2,1 mm, 3 μm) y una fuente de ionización por electrospray (ESI+). El programa de elución y los parámetros de la fuente de iones se muestran en la Tabla 1.

figure-protocol-7
Figura 7: Cromatograma y espectrograma de masas de imidacloprid en las hojas de trigo. El panel superior muestra un cromatograma de imidacloprid (tiempo de retención = 0,93 min). El panel inferior muestra el espectrograma de masas de imidacloprid a 0,93 min, mostrando la intensidad de respuesta de la producción (m/z = 208,8) de imidacloprid. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Temperatura de la columna40 °C
Disolvente A99,9% agua/0,1% ácido fórmico (v/v)
Disolvente Bacetonitrilo
Programa Elution0–0,5 min, A = 20%
0,5–2 min, A = 20%–50%
2–3 min, A = 50%
3–3,1 min, A = 50–20%
3.1–5 min, A=20%
Caudal (ml/min)0.3
Volumen de inyección (μL)5
Temperatura capilar (°C)330
Temperatura del vaporizador (°C)350
Caudal de gas de vaina (Arb)40
Caudal de gas auxiliar (Arb)20
Voltaje de pulverización (V)3900
Presión del gas de colisión (mTorr)1.5
Ion precursor256.1
Energía de iones del producto/colisión (eV)208.8/16

Tabla 1: Programa de elución y parámetros de la fuente de iones del método de cromatografía líquida-espectrometría de masas.

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Resultados

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El límite de detección (LOD) del instrumento de imidacloprid fue de 5,76 × 10−14 g, y el LOD del método de imidacloprid en la raíz u hoja de trigo fue de 0,01 μg/kg; No se observó ningún efecto matricial. Los rendimientos de recuperación de imidacloprid en trigo se muestran en la Tabla 2. Los rendimientos de recuperación de imidacloprid de las raíces de trigo expuestas a concentraciones de imidacloprid de 0,5 mg/L y 5 mg/L fueron 94,0%-97,6% y 98,8%-99,2%, respectivamente; Los coeficientes de ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En los últimos años, se han notificado con frecuencia métodos para el tratamiento previo y la detección de residuos del plaguicida imidacloprid. Badawy et al.23 utilizaron cromatografía líquida de alta resolución para determinar el contenido de imidacloprid en fruta de tomate cultivada en condiciones de invernadero y reportaron una buena linealidad para imidacloprid en el rango 0,0125-0,15 μg/mL. Zhai et al.24 utilizaron LC-MS-MS para estudiar el residuo de imidacloprid en ...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito. Este trabajo no ha sido publicado anteriormente, ni está siendo considerado por ninguna otra revista revisada por pares.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 42277039).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AcetonitriloSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd.01-06-1995Adecuado para HPLC, grado de gradiente, >99.9%
Balanza analíticaSartorius Lab Instruments Co.Ltd.GL124-1SCN
Incubadora de clima artificial   Shanghai Badian Equipo de Instrumentos Co., Ltd.HK320
Eppendorf China Co., Ltd.centrífuga5804
Jeringa desechableSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.Z116866Capacidad 5 mL, graduado 0,2 mL, ácido
fórmicoSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd.Y0001970Estándar de referencia de la farmacopea europea
Negro de humo grafitizado (GCB)Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd.V90005845 μ m
H2O2Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.3164230% (p/p)
Hoagland' s Mezcla de sales basales ShanghaiYu Bo Biotech Co. Ltd.NS1011Anhidro, equipo hidropónico de grado reactivo
Jiangsu Rongcheng Desarrollo de Ciencia y Tecnología Agrícola Co.Ltd.
Columna Hypersil BDS C18Thermo Fisher Scientific (China) Co. Ltd.28103-102130
ImidaclopridSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.Y0002028norma de referencia de la farmacopea europea
MgSO4Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd.208094Anhidro, grado reactivo, >97%
NaClSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.S9888Grado de reactivo, medidor de pH del 99%
Shanghai Thunder Magnetic Instrument FactoryPHSJ-3F
Phytotron boxHarbin Donglian Electronic Technology Co., Ltd.Pipetas HPG-280B
Eppendorf China Co., Ltd.Investigación más
filtro de jeringaSigma-Aldrich (Shanghái) Trading Co.Ltd.SLGV033NNylon, 0,22 y micro; m tamaño de poro, 33 mm, no estéril
Cromatografía líquida de ultra rendimiento Espectrometría de masas de triple cuadrupolo en tándemThermo Fisher Scientific (China) Co. Ltd.UltiMate 3000
TSQ Quantum Access MAX
Mezclador de vórticeShanghai Yetuo Technology Co., Ltd.Vortex-2
Semilla de trigoLuKe industriaJimai 20
Centrífuga no estéril SDZ04BD de semillas

Referencias

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