Este protocolo describe el aislamiento de macrófagos intersticiales pulmonares (MI) y su transferencia adoptiva después de la estimulación de IL-33 de los alvéolos pulmonares en un modelo de ratón, lo que puede facilitar el estudio in vivo de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI).
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Artículo de método
Transferencia adoptiva de macrófagos estimulados por IL-33 en modelos de ratón inducidos por bleomicina para estudiar su efecto sobre la fibrosis pulmonar idiopática in vivo
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Resumen
Resumen
La respuesta inflamatoria causada por la lesión pulmonar temprana es una de las causas importantes del desarrollo de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI), que se acompaña de la activación de células inflamatorias como macrófagos y neutrófilos, así como la liberación de factores inflamatorios como TNF-α, IL-1β e IL-6. Se sabe que la inflamación temprana causada por macrófagos intersticiales pulmonares (IM) activados en respuesta a la estimulación de IL-33 desempeña un papel vital en el proceso patológico de la FPI. Este protocolo describe la transferencia adoptiva de IMs estimulados por IL-33 a los pulmones de ratones para estudiar el desarrollo de FPI. Implica el aislamiento y cultivo de MI primarios de pulmones de ratón huésped, seguido de la transferencia adoptiva de MI estimulados a los alvéolos de ratones receptores de FPI inducidos por bleomicina (BLM) (que han sido previamente agotados de macrófagos alveolares por tratamiento con liposomas clodronatos), y la evaluación patológica de esos ratones. Los resultados representativos muestran que la transferencia adoptiva de macrófagos estimulados por IL-33 agrava la fibrosis pulmonar en ratones, lo que sugiere que el establecimiento del experimento de transferencia adoptiva de macrófagos es un buen medio técnico para estudiar la patología de la FPI.
Introducción
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad inflamatoria pulmonar difusa causada por muchos factores1. En el microambiente de citoquinas de la respuesta inmune Th1 y Th2, los macrófagos pueden polarizarse en macrófagos activados clásicamente (M1) y macrófagos activados alternativamente (M2). Los lipopolisacáridos (LPS) o la citoquina IFN-γ inducen a los macrófagos M1 a polarizarse y producir citoquinas proinflamatorias, incluyendo iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α e IL-12. En contraste, las citoquinas tipo II IL-4 e IL-13 impulsan la polarización de los macrófagos M2, que pueden producir diferentes factores promotores del crecimiento de fibroblastos, como TGF-β y PDGF, que promueven la fibrosis pulmonar2. El proceso patológico de la FPI se acompaña de activación e infiltración de macrófagos. La FPI media la reparación de lesiones, la inflamación y la fibrosis a través de la liberación de citoquinas3. Como solo se dispone de opciones terapéuticas limitadas, explorar los mecanismos patológicos moleculares de la FPI tiene gran importancia para desarrollar nuevas estrategias para la prevención y el tratamiento de la FPI. Estudios previos realizados por nuestro grupo y otros investigadores 4,5 han confirmado el aumento de la liberación de IL-33 en pacientes con FPI y en modelos de ratón con FPI inducida por bleomicina (BLM). La IL-33 es liberada por las células epiteliales y endoteliales durante la fibrosis y está involucrada en la activación de macrófagos, lo que resulta en la proliferación anormal de fibroblastos, la infiltración de leucocitos y la eventual pérdida de la función pulmonar5. El protocolo actual describe la transferencia adoptiva de macrófagos intersticiales (IM) estimulados por IL-33 en los alvéolos como un medio para estudiar el desarrollo de FPI en modelos de ratón. Aquí, los IM se aislaron del tejido pulmonar de ratones huéspedes, se cultivaron in vitro, se estimularon con IL-33 durante 24 h y luego se transfirieron adoptivamente a los alvéolos de los ratones receptores mediante inyección traqueal. Se encontró que la recolección directa de macrófagos de ratón estimulados y su transferencia adoptiva a los alvéolos receptores agrava el grado de fibrosis pulmonar y puede ilustrar más claramente la influencia de los factores estimulantes en la fibrosis en comparación con los estudios previos6. La técnica descrita en este documento puede permitir a los investigadores explorar la función de los macrófagos estimulados por citoquinas potenciales en el desarrollo de la FPI.
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Protocolo
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Bienestar Animal Experimental de la Universidad de Jiangnan (JN No. 20211130m1720615[501]).
NOTA: En total, se utilizaron 10 ratones machos C57BL / 6 de 6-8 semanas de edad y con un peso de 20-25 g en este estudio. Los tres grupos experimentales en el estudio incluyeron tres ratones receptores cada uno, y se utilizó un ratón huésped para el aislamiento IM.
1. Agotamiento de macrófagos pulmonares de ratón
- Saque el frasco de liposomas de clodronato (consulte la Tabla de materiales) del refrigerador con 30 minutos de anticipación, caliéntelo a temperatura ambiente e invierta varias veces para asegurar una mezcla uniforme.
NOTA: Los liposomas de clodronato encapsulan las moléculas hidrofílicas de bifosfonato de diclorometileno. Cuando estos liposomas son consumidos por los macrófagos, el clodronato es liberado gradualmente por la acción de la fosfatasa lisosoma, y su acumulación consecuentemente desencadena la apoptosis celular y el agotamiento de los macrófagos7. - Anestesiar ratones con isoflurano al 3%. Verifique la profundidad de la anestesia pellizcando un pie para verificar la conciencia. Aplique ungüento veterinario en ambos ojos para evitar la sequedad bajo anestesia.
- Aspirar 60 μL de liposomas de clodronato utilizando una pipeta con una punta de succión estéril. Administre el medicamento gota a gota en la cavidad nasal del ratón anestesiado, de modo que cuando el ratón inhala, el medicamento se inhala en la tráquea. Después de cada gota, asegúrese de que el ratón inhale el medicamento por completo y respire de manera uniforme. Administrar liposomas que contengan PBS solo como control8 (Figura 2).
- Coloque a los ratones en una tabla de temperatura constante de 38 ° C para recalentarlos y acelerar su recuperación. Monitoree a los ratones hasta que se despierten. Después de que los ratones se recuperen bien y logren la decúbito esternal, transfiéralos a la jaula.
- Utilice ratones con macrófagos alveolares agotados 2 días después del tratamiento con liposomas de clodronato como ratones receptores para el experimento de transferencia.
NOTA: En este estudio, el agotamiento de los macrófagos alveolares se confirmó mediante la comprobación de la expresión de los marcadores de macrófagos como se describió anteriormente 8,9 después de la administración de liposomas de clodronato por inhalación (ver Figura complementaria 1).
2. Aislamiento y cultivo de MIs
- Anestesiar al ratón huésped con una inyección intraperitoneal de ketamina (120 mg/kg) y xilazina (16 mg/kg). Confirme la profundidad de la anestesia a través de la pérdida del reflejo de pellizco del dedo del pie. Aplique ungüento veterinario en ambos ojos para evitar la sequedad bajo anestesia. Luego, desinfecte la piel del ratón anestesiado con 75% de alcohol y yodo. Use tijeras para cortar a través de la piel y exponer el tejido cardiopulmonar
- Aspirar 10 ml de 1x PBS en una jeringa con una aguja de 20 G e insertar la punta de la aguja en la aurícula derecha del ratón (Figura 3A). Corte la vena cava inferior del ratón con tijeras quirúrgicas y luego perfunda manualmente el ratón con PBS a una velocidad constante (10-20 ml / min) hasta que el tejido pulmonar se vuelva blanco. Extirpar el tejido pulmonar y transferirlo a PBS helado en una placa de cultivo (Figura 3B).
- Cortar el tejido pulmonar en fragmentos de aproximadamente 2 mm x 2 mm x 2 mm. Luego, agregue 15 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 1% de colagenasa A al tejido pulmonar para aislar los macrófagos. Incubar a 100 rpm durante 30 min en una mesa de agitación a 37 °C.
- Aspire la suspensión de tejido pulmonar a través de una jeringa de 10 ml al menos 20 veces para que sea lo más fina posible. Filtre esta suspensión a través de un filtro celular de 40 μm. Centrifugar el filtrado a 400 x g durante 10 min y desechar el sobrenadante.
- Lisar los glóbulos rojos en el gránulo agregando 3 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (ver Tabla de materiales) en hielo durante 2-3 minutos.
- Después de la centrifugación a 150 x g durante 5 min, resuspender el pellet celular con 10 ml de DMEM (que contiene 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina). Contar las células con un hemocitómetro.
- Sembrar las células en placas de cultivo celular adherente de 10 cm a 2 x 107 células/placa, e incubar durante 1 h a 37 °C y 5% deCO2. Esto permite que los IM pulmonares se adhieran al plato5. Después de 1 h, aspirar el sobrenadante y las células flotantes, y añadir 10 ml de medio de cultivo completo fresco (DMEM que contiene 10% FBS, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina). Incubar durante más de 8 h o durante la noche.
- Determinar la pureza de los IM obtenidos mediante citometría de flujo con tinción para los marcadores F4/80 y CD11c, como se describió anteriormente5 (ver Figura complementaria 1).
3. Transferencia adoptiva de IMs a los alvéolos pulmonares
- Sustituir el medio de cultivo de la placa que contiene los IM pulmonares aislados (paso 2.7) por un medio de cultivo completo que contenga 10 ng/ml de IL-33 para estimular los IM. Incubar durante 24 h a 37 °C y 5% deCO2. Utilice 1x PBS en lugar de IL-33 como control.
- Disociar los IM pulmonares tratándolos con 1 mL de tripsina al 0,25% durante 5 min. Luego, apague la digestión agregando 3 ml de medio completo de cultivo fresco y coseche los macrófagos pulmonares centrifugando la suspensión celular a 150 x g y 4 ° C durante 5 min. Contar las células con un hemocitómetro y resuspender las células en PBS hasta una concentración final de 5 x 105 células/50 μL.
- Anestesiar a los ratones receptores con gas isoflurano al 3%. Espere a que el ratón quede inconsciente (como en el paso 1.2) y luego fije las extremidades del ratón anestesiado en una placa vertical con cinta médica. Tire suavemente de la lengua del ratón hacia un lado con un hisopo de algodón.
- Encienda la lámpara de intubación y póngala en la garganta del ratón para que se pueda ver la tráquea. Verifique que la tráquea esté cerca de la base de la lengua, el esófago esté cerca de la parte posterior del cuello, pero la abertura del esófago no sea visible durante la operación.
- Utilice la lámpara de intubación (22 G) para ayudar a intubar el ratón. Guíe la cánula de la aguja permanente hacia la tráquea con un alambre guía (0,4 mm de diámetro). Retire el alambre guía y empuje la cánula en la tráquea del ratón para completar la intubación.
- Después de observar que la cánula entra en la tráquea, inyecte 50 μL de la suspensión celular (que contiene 5 x 105 IM) en el ratón receptor a través de la tráquea.
- Coloque los ratones en una almohadilla de calentamiento constante de 38 ° C para recalentarlos y acelerar la recuperación. Monitoree a los ratones hasta que se despierten. Después de que se recuperen bien y logren la decúbito esternal, transfiéralos a la jaula.
- Después de 24 h, administrar bleomicina (BLM) a través de la tráquea (utilizando el procedimiento en los pasos 3.3-3.5) a una dosis de 1,4 U/kg de peso corporal para inducir la FPI. Administrar un volumen igual de solución salina al grupo de control.
- Después de 21 días, determinar el grado de gravedad de la fibrosis pulmonar para los diferentes grupos de ratones que fueron transferidos adoptivamente con PBS o la suspensión IM estimulada por IL-33 evaluando la expresión de marcadores para fibrosis y las puntuaciones de Ashcroft10.
- Extraiga el ARN total del tejido pulmonar utilizando un reactivo de extracción de ARN (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: El análisis cuantitativo se realizó con un lector de microplacas. Si la relación OD260/OD280 es 1.8-2.0, la pureza del ARN es alta. Todas las muestras se almacenaron a -80 ° C. - Realizar PCR cuantitativa de fluorescencia para evaluar la expresión de actina del músculo α liso (AME) y fibronectina utilizando cebadores específicos.
NOTA: Los cebadores utilizados para α-SMA fueron 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' hacia adelante y hacia atrás 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3', y los cebadores utilizados para fibronectina fueron hacia adelante 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' y hacia atrás 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGTGT-3'.
- Extraiga el ARN total del tejido pulmonar utilizando un reactivo de extracción de ARN (consulte la Tabla de materiales).
- Realizar inmunohistoquímica como se describe a continuación.
- Deshidratar el pulmón izquierdo, incrustarlo y cortarlo con una cortadora de parafina hasta un espesor de 4 μm.
- Coloque las secciones de tejido en portaobjetos y hornee los portaobjetos en un horno a 65-70 ° C durante 30 min a 1 h. Desparafinar los portaobjetos con un porcentaje decreciente de alcohol (es decir, 100%, 95%, 90%, 80% y 70% de alcohol) durante 5 min.
- Manchar los portaobjetos en solución de colorante de hematoxilina (analíticamente pura) durante 5 min. Luego, lave los toboganes con agua del grifo. Remoje los portaobjetos en alcohol de ácido clorhídrico al 1% durante 3 s, lave el color flotante y sumérjase en agua corriente durante 5 minutos. Las secciones se volverán azules.
- Sumérjase en una solución de eosina durante 10 s a 1 min (determine el tiempo de teñido según el color), lave con agua del grifo y coloque en alcohol al 70%, 80%, 95%, 100% y 100%, respectivamente, durante 5 min cada uno. Luego coloque las diapositivas en soluciones de xileno I y xileno II durante 3 min. Después del secado, observe y tome fotos bajo el microscopio vertical con una película de sellado adhesiva neutra.
- Realizar la puntuación de Ashcroft en las secciones para indicar la gravedad de la fibrosis pulmonar10. Realizar análisis estadísticos de los datos utilizando una prueba t de dos muestras independientes.
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Resultados
El protocolo utilizado aquí se resume en el diagrama de flujo de la Figura 1. La inhalación de liposomas de clodronato a través de la nariz (Figura 2) se utilizó para agotar los macrófagos pulmonares de ratones adultos C57BL / 6, y esto produjo un buen modelo de ratón receptor. Los IM pulmonares se aislaron de otro ratón no tratado (huésped) (Figura 3A, B) y se cultivaron in vitro. Los macrófagos aislados ...
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Discusión
Este estudio proporciona un método eficaz para agotar, aislar, cultivar y transferir macrófagos, lo que puede ayudar a estudiar los mecanismos de la fibrosis pulmonar en ratones. Existen muchos métodos para el agotamiento de macrófagos en ratones, como la administración traqueal, la inyección de venas de la cola y la inhalación nasal11. Este estudio optimizó el método de inhalación nasal, que es fácil de operar y puede agotar eficazmente los macrófagos pulmonares 8,9
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores reconocen el tema especial de gestión de laboratorio de la Universidad de Jiangnan: construcción de una biblioteca digital basada en muestras patológicas (JDSYS202223) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81800065).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life technologies Biotechnology,EE. UU. | 1508012 | |
| Aguja arterial permanente | B Braun Melsingen AG,Alemania | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson, EE. UU. | ||
| Bleomicina | Biotang, EE. UU | Ab9465 | |
| Incubadora de dióxido de carbono | Thermo Forma, EE. UU. | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R& D Sistemas, EE. UU. | 1124F | |
| CD11c | R& D Systems, EE. UU. | N418 | |
| Placa de cultivo celular | Thermo Forma, EE. UU | ||
| Liposomas de clodronato | Liposomas de clodronato,Países Bajos | CI-150-150 | |
| Colagenasa A | Sigma-Aldrich, EE. UU. | 10103578001 | |
| F4/80 | R& D Systems, EE. UU. | 521204 | |
| Filtro de células de halcón | Becton, Dickinson and Company, EE. UU | 352340 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Tecnologías de vida, EE. UU | 1047571 | |
| Hematoxilina eosina | Tecnología de Nanjing Jiancheng, China | 06-570 | |
| LightCycler 480 Sistema de detección de PCR | Roche, EE. UU. | ||
| Factor recombinante murino IL-33 | Peprotech, EE. UU. | 210-33 | |
| Microscopio Nikon | Nikon Corporation, Japón | 941185 | |
| Penicilina, estreptomicina | Tecnologías de la vida, EE. UU | ||
| tampón (PBS) | Guangdong Huankai Tecnología microbiana, China | 1535882 | |
| tampón de lisis RBC | Beyotime Biotechnology Company, China | C3702 | |
| ARN Isolater | Vazyme company, China | R401-01-AA | Reactivo de extracción de ARN total |
| RWD Máquina de anestesia por inhalación | Shenzhen Rayward Life Technology, China | R500 | |
| Parafina semiautomática cortadora | Leica, Alemania | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japón | 410800 | |
| Tripsina 0.25% | Life Technologies, Estados Unidos | 1627172 |
Referencias
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- Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
An erratum was issued for: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. The Protocol section was updated.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
to:
Anesthetize the host mouse with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
