Este protocolo describe el aislamiento de macrófagos intersticiales pulmonares (MI) y su transferencia adoptiva después de la estimulación de IL-33 de los alvéolos pulmonares en un modelo de ratón, lo que puede facilitar el estudio in vivo de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI).
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Artículo de método
Transferencia adoptiva de macrófagos estimulados por IL-33 en modelos de ratón inducidos por bleomicina para estudiar su efecto sobre la fibrosis pulmonar idiopática in vivo
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Resumen
Resumen
La respuesta inflamatoria causada por la lesión pulmonar temprana es una de las causas importantes del desarrollo de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI), que se acompaña de la activación de células inflamatorias como macrófagos y neutrófilos, así como la liberación de factores inflamatorios como TNF-α, IL-1β e IL-6. Se sabe que la inflamación temprana causada por macrófagos intersticiales pulmonares (IM) activados en respuesta a la estimulación de IL-33 desempeña un papel vital en el proceso patológico de la FPI. Este protocolo describe la transferencia adoptiva de IMs estimulados por IL-33 a los pulmones de ratones para estudiar el desarrollo de FPI. Implica el aislamiento y cultivo de MI primarios de pulmones de ratón huésped, seguido de la transferencia adoptiva de MI estimulados a los alvéolos de ratones receptores de FPI inducidos por bleomicina (BLM) (que han sido previamente agotados de macrófagos alveolares por tratamiento con liposomas clodronatos), y la evaluación patológica de esos ratones. Los resultados representativos muestran que la transferencia adoptiva de macrófagos estimulados por IL-33 agrava la fibrosis pulmonar en ratones, lo que sugiere que el establecimiento del experimento de transferencia adoptiva de macrófagos es un buen medio técnico para estudiar la patología de la FPI.
Introducción
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad inflamatoria pulmonar difusa causada por muchos factores1. En el microambiente de citoquinas de la respuesta inmune Th1 y Th2, los macrófagos pueden polarizarse en macrófagos activados clásicamente (M1) y macrófagos activados alternativamente (M2). Los lipopolisacáridos (LPS) o la citoquina IFN-γ inducen a los macrófagos M1 a polarizarse y producir citoquinas proinflamatorias, incluyendo iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α e IL-12. En contraste, las citoquinas tipo II IL-4 e IL-13 impulsan la polarización de los macrófagos M2, que pueden producir diferentes factores promotores del crecimiento de fibro....
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Protocolo
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Bienestar Animal Experimental de la Universidad de Jiangnan (JN No. 20211130m1720615[501]).
NOTA: En total, se utilizaron 10 ratones machos C57BL / 6 de 6-8 semanas de edad y con un peso de 20-25 g en este estudio. Los tres grupos experimentales en el estudio incluyeron tres ratones receptores cada uno, y se utilizó un ratón huésped para el aislamiento IM.
1. Agotamiento de macrófagos pulmonares de ratón
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Resultados
El protocolo utilizado aquí se resume en el diagrama de flujo de la Figura 1. La inhalación de liposomas de clodronato a través de la nariz (Figura 2) se utilizó para agotar los macrófagos pulmonares de ratones adultos C57BL / 6, y esto produjo un buen modelo de ratón receptor. Los IM pulmonares se aislaron de otro ratón no tratado (huésped) (Figura 3A, B) y se cultivaron in vitro. Los macrófagos aislados .......
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Discusión
Este estudio proporciona un método eficaz para agotar, aislar, cultivar y transferir macrófagos, lo que puede ayudar a estudiar los mecanismos de la fibrosis pulmonar en ratones. Existen muchos métodos para el agotamiento de macrófagos en ratones, como la administración traqueal, la inyección de venas de la cola y la inhalación nasal11. Este estudio optimizó el método de inhalación nasal, que es fácil de operar y puede agotar eficazmente los macrófagos pulmonares 8,9
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores reconocen el tema especial de gestión de laboratorio de la Universidad de Jiangnan: construcción de una biblioteca digital basada en muestras patológicas (JDSYS202223) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81800065).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life technologies Biotechnology,EE. UU. | 1508012 | |
| Aguja arterial permanente | B Braun Melsingen AG,Alemania | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson, EE. UU. | ||
| Bleomicina | Biotang, EE. UU | Ab9465 | |
| Incubadora de dióxido de carbono | Thermo Forma, EE. UU. | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R& D Sistemas, EE. UU. | 1124F | |
| CD11c | R& D Systems, EE. UU. | N418 | |
| Placa de cultivo celular | Thermo Forma, EE. UU | ||
| Liposomas de clodronato | Liposomas de clodronato,Países Bajos | CI-150-150 | |
| Colagenasa A | Sigma-Aldrich, EE. UU. | 10103578001 | |
| F4/80 | R& D Systems, EE. UU. | 521204 | |
| Filtro de células de halcón | Becton, Dickinson and Company, EE. UU | 352340 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Tecnologías de vida, EE. UU | 1047571 | |
| Hematoxilina eosina | Tecnología de Nanjing Jiancheng, China | 06-570 | |
| LightCycler 480 Sistema de detección de PCR | Roche, EE. UU. | ||
| Factor recombinante murino IL-33 | Peprotech, EE. UU. | 210-33 | |
| Microscopio Nikon | Nikon Corporation, Japón | 941185 | |
| Penicilina, estreptomicina | Tecnologías de la vida, EE. UU | ||
| tampón (PBS) | Guangdong Huankai Tecnología microbiana, China | 1535882 | |
| tampón de lisis RBC | Beyotime Biotechnology Company, China | C3702 | |
| ARN Isolater | Vazyme company, China | R401-01-AA | Reactivo de extracción de ARN total |
| RWD Máquina de anestesia por inhalación | Shenzhen Rayward Life Technology, China | R500 | |
| Parafina semiautomática cortadora | Leica, Alemania | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japón | 410800 | |
| Tripsina 0.25% | Life Technologies, Estados Unidos | 1627172 |
Referencias
- Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray an....
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
An erratum was issued for: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. The Protocol section was updated.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
to:
Anesthetize the host mouse with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
