La necesidad de nuevos enfoques para estudiar los sitios de contacto de membrana (MCS) ha crecido debido al creciente interés en el estudio de estas estructuras celulares y sus componentes. Aquí, presentamos un protocolo que integra tecnologías de microscopía previamente disponibles para identificar y cuantificar complejos de proteínas intra-orgánulos e inter-orgánulos que residen en los SQM.
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Artículo de método
Visualización y cuantificación de las interacciones endógenas de proteínas intraorgánulas en los sitios de contacto ER-mitocondrias mediante ensayos de ligadura de proximidad
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Resumen
Resumen
Los sitios de contacto de membrana (MCS) son áreas de proximidad cercana a la membrana que permiten y regulan el intercambio dinámico de diversas biomoléculas (es decir, calcio y lípidos) entre los orgánulos yuxtapuestos sin involucrar la fusión de la membrana. Las SQM son esenciales para la homeostasis celular, y sus funciones están aseguradas por los componentes residentes, que a menudo existen como complejos de proteínas multiméricas. Las SQM a menudo involucran el retículo endoplásmico (RE), un sitio importante de síntesis de lípidos y almacenamiento de calcio celular, y son particularmente importantes para los orgánulos, como las mitocondrias, que están excluidos de las vías clásicas de transporte vesicular. En los últimos años, las SQM entre el RE y las mitocondrias han sido ampliamente estudiadas, ya que sus funciones tienen un fuerte impacto en el metabolismo/bioenergética celular. Se han comenzado a identificar varias proteínas en estos sitios de contacto, incluidas las ataduras de membrana, los canales de calcio y las proteínas de transferencia de lípidos, lo que plantea la necesidad de nuevas metodologías y enfoques técnicos para estudiar estos componentes de la SQM. Aquí, describimos un protocolo que consiste en enfoques técnicos combinados, que incluyen el ensayo de ligadura de proximidad (PLA), la tinción de mitocondrias y la segmentación por imágenes 3D, que permite la detección de proteínas que están físicamente cerca (>40 nm) entre sí y que residen en la misma membrana en los MCS ER-mitocondrias. Por ejemplo, utilizamos dos proteínas de transferencia de lípidos ancladas al RE, ORP5 y ORP8, que previamente se ha demostrado que interactúan y se localizan en las MCS de la mitocondria del RE y de la membrana plasmática del RE. Al asociar el PLA ORP5-ORP8 con el análisis de software de imágenes celulares, fue posible estimar la distancia del complejo ORP5-ORP8 desde la superficie mitocondrial y determinar que aproximadamente el 50% de la interacción ORP5-ORP8 PLA ocurre en los subdominios RE en las proximidades de las mitocondrias.
Introducción
La comunicación entre orgánulos es una característica definitoria de las células eucariotas. Una forma en que los orgánulos se comunican es mediante la formación de sitios de contacto de membrana (MCS), que son oposiciones de membrana cercanas entre dos orgánulos que son mantenidas por proteínas estructurales y funcionales, como ataduras, proteínas de transferencia de lípidos y canales de calcio1. Los SQM pueden establecerse entre orgánulos similares o diferentes, y median el intercambio de componentes celulares, lo cual es importante para mantener la homeostasis celular. Hasta la fecha, se han identificado varias SQM, incluidos los contactos d....
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Protocolo
1. Tinción mitocondrial y ensayo de ligadura de proximidad (PLA)
- Placa 0,5 x 10 5-2 x 10 5 5 células HeLa, mantenidas en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de aminoácidos no esenciales a 37 °C con 5% de CO2, en cubreobjetos de vidrio de 13 mm en placas de1,5 en 24 pocillos a una dilución que permite una confluencia celular del 75%-90% el día del procedimiento.
NOTA: Cabe destacar que las células HeLa pueden someterse a tratamientos adicionales, como el tratamiento con siRNA y/o la transfección de plásmidos de ADN, antes de la tinción ....
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Resultados
Utilizando el protocolo descrito anteriormente, detectamos los sitios de interacción de dos proteínas de transferencia de lípidos ancladas al RE, ORP5 y ORP8, y evaluamos su ocurrencia en los subdominios de la membrana del RE en contacto con otros orgánulos, en particular, con las mitocondrias. Para ello, se tiñó la red mitocondrial en las células HeLa con un marcador mitocondrial rojo, y se detectaron puntos verdes de PLA ORP5-ORP8 después de la fijación utilizando los anticuerpos primarios anti-ORP5 y anti-ORP8, cuya e.......
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Discusión
Este protocolo fue diseñado para identificar y cuantificar las interacciones de PLA entre las proteínas de los orgánulos en los SQM, en particular en los MERCS. La novedad del protocolo es que combina el PLA con el marcaje de múltiples orgánulos, la microscopía confocal y el análisis de imágenes 3D para localizar y cuantificar las interacciones del PLA entre dos proteínas que residen en la misma membrana, en este caso dentro de la membrana del RE en estrecha proximidad con la membrana de las mitocondrias (MAM) o con el M.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo contó con el apoyo de la ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), el Programa ATIP-Avenir, la Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) y la Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), la I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Ciencias de las Plantas Saclay).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1X Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1X DPBS) | Gibco | 14190-094 | |
| Cloruro de amonio (NH4Cl) | VWR | 21236.291 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Cubreobjetos de vidrio circulares 13mm n.º 1.5 | Agar Scientific | L46R13-15 | |
| CMXRos rojo MitoTracker | Invitrogen | M7512 | marcador mitocondrial rojo |
| Microscopio confocal invertido SP8-X | Leica | DMI 6000 | |
| Corning Costar TC Placas de 24 pocillos | Merck | CLS3526 | |
| Duolink Reactivos de detección in situ Green | in situ Sigma | DUO92002 | |
| Duolink con DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink Sonda PLA in situ Anti-Ratón MINUS | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink Sonda PLA in situ Anti-Rabbit PLUS | Sigma | DUO92014 | |
| Duolink Tampones de lavado in situ, fluorescencia | Sigma | DUO82049 | |
| Gibco Opti-MEM I Medio Suero Reducido, Suplemento GlutaMAX | Gibco | 51985026 | medio libre de suero |
| Imaris software v 9.3 | Bitplane | N/A | software de imagen celular |
| Incubadora UINCU-line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Portaobjetos de microscopio StarFrost (3" x 1") | Knittel Ratón de cristal | ||
| anti-ORP8 | Santa Cruz | 134409 | |
| Paraformaldehído (PFA) | Sigma | P6148 | |
| conejo anti-ORP5 | Sigma | HAP038712 | |
| Saponina | Sigma | 84510 | |
| Agua Destilada Ultra Pura, libre de DNasa/RNasa | Invitrogen | 10977-035 |
Referencias
- Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10, 1287(2019).
- Vance, J. E. MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond. Bi....
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Reimpresiones y permisos
