Artículo de método

Ablación láser y microscopía intravital para estudiar la remodelación intestinal

DOI:

10.3791/64756

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9 de junio de 2023

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1Department of Molecular Pathology, The Netherlands Cancer Institute, 2Oncode Institute, 3Animal Laboratory Facility, The Netherlands Cancer Institute

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un método para obtener imágenes del intestino tras heridas inducidas por láser. Al exponer el intestino del ratón a un láser multifotónico, la pérdida de una o varias criptas se induce localmente. Al obtener imágenes repetidas del área dañada durante meses, se captura la dinámica en tiempo real de la recuperación intestinal.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Investigar la recuperación intestinal in vivo es un reto técnico exquisito. La falta de protocolos de imagen longitudinales ha impedido una visión más profunda de la dinámica de la escala celular y tisular que orquesta la regeneración intestinal. Aquí, describimos un método de microscopía intravital que induce localmente daño tisular a escala de cripta única y sigue la respuesta regenerativa del epitelio intestinal en ratones vivos. Las criptas individuales o los campos intestinales más grandes fueron ablacionados por un láser infrarrojo multifotón de alta intensidad de una manera controlada por el tiempo y el espacio. Las imágenes intravitales repetitivas posteriores a largo plazo permitieron el seguimiento de las áreas dañadas a lo largo del tiempo y permitieron el monitoreo de la dinámica de la cripta durante la recuperación del tejido durante un período de varias semanas. Se observaron eventos de remodelación de criptas como fisión, fusión y desaparición de criptas en el tejido vecino tras daños inducidos por láser. Este protocolo permite el estudio de la dinámica de las criptas tanto en entornos homeostáticos como fisiopatológicos, como el envejecimiento y la iniciación tumoral.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El revestimiento epitelial del intestino es desafiado constantemente por ácidos gástricos, toxinas y microbiota que pueden causar la interrupción de la barrera epitelial. La estructura intestinal y la organización de los tejidos están especializadas para renovarse y reparar constantemente los daños. El epitelio de una sola capa del intestino delgado está organizado en unidades cripta-vellosidades1. En la homeostasis, las células madre intestinales Lgr5+ autorrenovadoras que residen en la base de la cripta dan lugar a una progenie diferenciada. Las células hijas diferenciadas viajan a la punta del eje de las vellosidades en forma de cinta transportadora, donde se desprenden para que el revestimiento intestinal se reponga en 3-5 días 2,3. A largo plazo, no todas las células Lgr5+ contribuyen por igual a la renovación tisular, ya que esto también depende de la capacidad de las células para moverse contra la cinta transportadora hacia la base de la cripta (es decir, movimiento retrógrado)4,5. De hecho, tras la ablación de las células Lgr5+ mediante, por ejemplo, radiación, las células progenitoras fuera de la base de la cripta se mueven hacia la base para desdiferenciarse y reponer el conjunto de células madre 6,7,8.

La inflamación aguda puede causar la pérdida de células madre Lgr5+ 9,10. Además de la pérdida de células madre, muchos factores externos pueden causar daño agudo al epitelio a escala de cripta. Se ha demostrado que la radiación, los tratamientos químicos y los antibióticos dañan las criptas intestinales y las vellosidades11. Los campos más grandes de criptas y vellosidades pueden verse afectados por infecciones bacterianas, virales y parasitarias12. El intestino posee una notable capacidad para recuperarse del daño interno y externo a escala de cripta por fisión de cripta (una división de una cripta en dos)13. Tras la herida, las criptas en el área adyacente al daño se someten a fisión para reponer los números de la cripta. Este fenómeno también ocurre, aunque en menor medida, durante la homeostasis14,15. Para contrarrestar un aumento potencial en el número de criptas durante la homeostasis, las criptas también pueden fusionarse (fusionando dos criptas en una)16,17. Se desconoce si la fusión de criptas también juega un papel en el restablecimiento de los números de cripta después de la herida. Además, la dinámica y los factores reguladores de este proceso aún no se han dilucidado.

Los modelos de lesión son indispensables para estudiar la regeneración tisular in vivo. Se han utilizado varios modelos de lesiones para estudiar la regeneración del tejido intestinal. Las estrategias experimentales anteriores emplearon altas dosis de radiación para agotar las reservas de células madre18 o el tratamiento con sulfato de dextrano sódico (DSS) para inducir colitis crónica y aguda y pérdida de criptas en ratones19,20. La ablación unicelular por medios genéticos u ópticos ha sido utilizada para refinar el daño tisular y considerada una herramienta atractiva para desentrañar el papel de las células madre y progenitoras 21,22 y estudiar la regeneración vascular23. Además, se ha desarrollado un sistema de biopsia-lesión para inducir daños en campos más grandes de varias criptas y vellosidades24. Es importante destacar que la respuesta al insulto dañino puede variar a lo largo del eje proximal-distal del intestino, como se informó para la radiación, que causó más daño en el intestino delgado que en el colon25. Esto resalta la necesidad de métodos específicos que controlen tanto el alcance del insulto dañino como su localización en el tracto intestinal.

La extensión del daño y la recuperación se han evaluado convencionalmente por medios estáticos, que proporcionan información limitada sobre la dinámica de la recuperación del tejido. La microscopía intravital (MIV) ha abierto oportunidades únicas para cuantificar el comportamiento de las células madre, la remodelación epitelial y la regeneración en muchos órganos 26,27,28,29,30, y ha proporcionado información impactante sobre la biología intestinal 4,5,21,31,32,33,34, 35,36.

Aquí, describimos un método para causar daño intestinal definido espacio-temporal y capturar la recuperación del revestimiento epitelial intestinal. Utilizamos dos ablaciones láser basadas en fotones para dañar las criptas intestinales y seguir la respuesta inmediata de la herida y la recuperación a largo plazo mediante microscopía intravital repetitiva. Nuestro protocolo permite mapear la remodelación regenerativa de la arquitectura del tejido intestinal en respuesta al daño tisular local. La dinámica de la cripta, incluidos los eventos de fisión y fusión, se puede cuantificar y rastrear fácilmente a lo largo del tiempo. La aplicación de la ablación con láser y las imágenes intravitales repetitivas se pueden utilizar como una plataforma para investigar la dinámica a escala tisular de la arquitectura intestinal durante la homeostasis y la fisiopatología, como la iniciación tumoral.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los experimentos con animales descritos en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y la aprobación del Organismo de Bienestar Animal (AWB) del Instituto del Cáncer de los Países Bajos (NKI).

NOTA: Consulte al comité de ética animal del instituto antes de realizar cualquier experimento con animales.

1. Preparación para la cirugía y la imagen intravital

  1. Tratamientos prequirúrgicos
    1. Inducir K19-CreERT237 de 8-12 semanas de edad: Rosa26-mTmG 38 y Lgr5eGFP-IRES-CreERT218: Rosa26-Confetti39 ratones inyectando tamoxifeno disuelto en aceite de girasol por vía intraperitoneal 4-6 semanas antes de la cirugía (Figura 1).
    2. Aplicar analgesia. Inyectar 200 μL de buprenorfina (0,1 mg/kg de peso corporal) diluido en NaCl 0,9% por 30 g de ratón por vía subcutánea 30 min antes de la cirugía. Administrar carprofeno (0,067 mg/ml) en un frasco que contenga 125 ml de agua potable esterilizada en autoclave no acidificada 24 h antes de la cirugía. Alternativamente, administrar una inyección de carprofeno por vía subcutánea (5 mg/kg) 30 minutos antes del inicio de la cirugía.
  2. Preparación para la cirugía
    1. Introduzca herramientas quirúrgicas estériles esterilizadas en autoclave en el gabinete de riesgo biológico.
    2. Encienda la almohadilla térmica y ajuste la temperatura a 37 °C.
  3. Preparación para imágenes intravitales
    1. Encienda la cámara de temperatura controlada del microscopio al menos 4 h antes de obtener imágenes para permitir tiempo suficiente para la estabilización de la temperatura.
      NOTA: El tiempo necesario puede variar dependiendo de la máquina utilizada.
    2. Mantener estable la temperatura dentro de la cámara climática a 37 °C.
    3. Encienda el microscopio de dos fotones, el escáner y el láser.
    4. Inicie el software de imágenes.
    5. Sintoniza la longitud de onda del láser a 960 nm y abre el obturador.

2. Cirugía e imagen intravital

  1. Exposición quirúrgica del intestino
    1. Anestesiar al ratón con isoflurano al 2% -3% y colocarlo en una almohadilla térmica, cubierta con un paño estéril. Compruebe la profundidad de la anestesia evaluando la frecuencia y la calidad de la respiración (una respiración/segundo) y comprobando el reflejo del ratón.
    2. Cubra los ojos del ratón con ungüento para los ojos.
    3. Inyecte 200 μL de solución salina estéril precalentada por vía subcutánea.
    4. Afeitar el abdomen y eliminar el vello. Cambie el paño estéril en el área quirúrgica.
    5. Inserte una sonda rectal para controlar la temperatura del ratón.
      NOTA: La temperatura debe ser de aproximadamente 37 °C.
    6. Póngase un nuevo par de guantes estériles.
    7. Limpie el área quirúrgica de forma circular con exfoliantes alternos de solución antiséptica seguida de etanol al 80% tres veces. Elimine el exceso de etanol con un hisopo de algodón estéril.
      NOTA: Es fundamental controlar el ratón para detectar hipotermia en este punto.
    8. Cubra el ratón con una cortina quirúrgica estéril.
    9. Compruebe el reflejo del ratón.
    10. Haga una incisión vertical de ~ 10 mm en la línea media a través de la piel con un bisturí estéril.
    11. Incise la línea alba usando tijeras para separar los músculos rectos abdominales y abrir el abdomen.
    12. Encuentra el ciego del ratón usando hisopos de algodón estériles empapados en solución salina estéril precalentada para usarlo como punto de referencia.
    13. Haga un pequeño corte en un trozo de gasa estéril, humedézcalo en solución salina estéril precalentada y colóquelo por encima de la incisión.
    14. Saque el intestino con hisopos de algodón estériles empapados en solución salina estéril precalentada. Mantenga el intestino hidratado agregando solución salina estéril precalentada.
    15. Coloque una cámara de imágenes estéril hecha a medida junto al mouse.
    16. Transfiera el ratón a la caja de imágenes estéril precalentada.
    17. Coloque el intestino en el vidrio estéril de la caja de imágenes. Coloque la cabeza del ratón dentro del tubo de inhalación de la caja de imágenes, como se muestra en la Figura 1.
    18. Si es necesario, asegure el ratón con una película flexible estéril y cinta adhesiva.
    19. Coloque la caja de imágenes que contiene el ratón en la cámara del microscopio.
  2. Imágenes intravitales
    1. Controle al ratón durante la obtención de imágenes comprobando la frecuencia y la profundidad de la respiración y la temperatura a través de una sonda rectal cada 15 minutos. El porcentaje de isoflurano debe mantenerse entre 1% -2%. Ajuste si es necesario.
    2. Encuentre una región en el intestino usando el ocular del microscopio.
    3. Obtenga una vista de campo amplio de la región de interés utilizando la cámara interna del microscopio, como se ve en la Figura 2A.
    4. Imagen de la región de interés utilizando el láser de 960 nm del microscopio multifotónico. Ajuste la potencia del láser y la longitud de onda de acuerdo con los fluoróforos utilizados en el experimento.
    5. Adquiera una pila z de 10-20 pasos de 3 μm de la región de interés.
  3. Ablación con láser
    1. Elija una sola posición o varias posiciones del mosaico fotografiado anteriormente.
    2. Utilice la función de calibración del punto de lejía en el software de imágenes con un zoom de 32 y una resolución de 124 x 124 píxeles con una velocidad de escaneo de 400 Hz, utilizando la propiedad de escaneo bidireccional para 3-10 s, dependiendo del tamaño del daño al que se pretenda. El inicio del daño en el área de la cripta se puede reconocer por un aumento en la autofluorescencia en los canales verde y rojo.
    3. Repita los dos pasos anteriores para varias regiones en el mismo ratón.
    4. Después de la ablación, adquiera pilas z de las regiones dañadas para confirmar la ubicación y el alcance del daño.
  4. Cierre del sitio quirúrgico
    1. Coloque el ratón, mientras aún está bajo anestesia, en un área de sutura estéril.
    2. Inserte el intestino expuesto de nuevo en el abdomen usando hisopos de algodón estériles empapados en solución salina estéril precalentada.
    3. Suturar la línea alba realizando una sutura continua simple utilizando una sutura absorbible 5-0. Cierre las extremidades de la sutura con nudos quirúrgicos.
    4. Repita el mismo paso con la capa de piel.
    5. Apague la estación de isoflurano y limpie y esterilice la caja de imágenes y la incrustación.
    6. Limpie las herramientas quirúrgicas con el limpiador de instrumentos quirúrgicos, el limpiador enzimático y el lubricante de instrumentos quirúrgicos. Cuando esté seco, esterilice las herramientas quirúrgicas junto con la caja de cirugía en el autoclave.
  5. Atención postoperatoria
    1. Deje que el ratón se recupere de la cirugía mientras la jaula se coloca en la almohadilla térmica durante ~ 1 h.
      NOTA: Coloque el ratón con otros compañeros de jaula si es posible. La vivienda solitaria no es necesaria para la recuperación.
    2. Compruebe la temperatura del ratón cada 15 minutos durante la recuperación.
    3. Inyectar 200 μL de buprenorfina (0,1 mg/kg de peso vivo) diluido en NaCl 0,9% por 30 g de ratón por vía subcutánea 6-12 h después de la cirugía.
    4. Administrar carprofeno (0,067 mg/ml) en un frasco que contenga 125 ml de agua potable esterilizada en autoclave no acidificada durante 72 h después de la cirugía.
    5. Pese el ratón y controle el bienestar todos los días durante 1 semana después de la cirugía.

3. Cirugía repetitiva e imagen intravital

  1. Cirugía
    1. En el segundo punto temporal (al menos 1 semana después de la primera sesión de diagnóstico por imágenes), repita los pasos 1.1.2, 1.2, 1.3 y 2.1.
  2. Imágenes intravitales
    1. Repita los pasos 2.2.1-2.2.3.
    2. Utilice el patrón de vasos sanguíneos para encontrar las mismas regiones de interés fotografiadas en el primer punto de tiempo.
    3. Repita los pasos 2.2.4 y 2.2.5.
  3. Cierre del sitio quirúrgico
    1. Repita el paso 2.4.1.
    2. Si el ratón no está destinado a ser fotografiado en otro punto de tiempo, sacrifique el ratón realizando la dislocación cervical bajo anestesia terminal. De lo contrario, continúe con el siguiente paso.
      NOTA: De acuerdo con las directrices de la Directiva de la UE 2010/63 / UE, apéndice IV, la luxación cervical es un método aceptable.
    3. Repita los pasos 2.4.2-2.4.6.
  4. Atención postoperatoria
    1. Repita los pasos 2.5.1-2.5.5.

Resultados

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Para demostrar el tipo de resultados que se pueden obtener del método de ablación láser combinado con imágenes intravitales, realizamos un experimento como se muestra en la Figura 1. Primero, inyectamos K19-CreERT2;mTmG (K19cre-mTmG) y Lgr5eGFP-IRES-CreERT2; Ratones Rosa26-Confetti (Lgr5cre-Confetti) con tamoxifeno para etiquetar estocásticamente las células con uno de los colores Confetti (o proteína verde fluorescente [GFP] en el caso de ratones mTmG). K19-cre induce el rastreo del linaje de todas las células epiteliales, mientras que Lgr5-cre induce el rastreo de las células madre solo 8,18,37. La inyección de tamoxifeno se administró 4-6 semanas antes de la cirugía y la primera sesión de imagen con el fin de obtener criptas en las que todas las células son monoclonales para un determinado color. La identificación robusta de las mismas regiones de tejido durante varias semanas es esencial para rastrear el destino de las mismas criptas a lo largo del tiempo. Las características arquitectónicas inherentes del tejido, como la vasculatura, se pueden usar como puntos de referencia de tejido confiables, y se registraron aquí con la cámara interna del microscopio. Además, etiquetar una pequeña fracción de criptas con (al menos dos) colores diferentes ayudó a reconocer las mismas criptas en cada sesión de imágenes y seguir su comportamiento durante el proceso regenerativo después del daño del láser. Al exponer quirúrgicamente el intestino del ratón y adquirir imágenes fluorescentes y de la cámara de la región de interés (Figura 2A), se pueden usar los ajustes del punto de lejía del láser multifotón para extirpar una o más criptas (Figura 2B, C). El inicio del daño podría reconocerse por un aumento de la autofluorescencia tanto en el canal verde como en el rojo. Para estudiar la dinámica de la recuperación de la cripta, la cirugía y el procedimiento de imagen se repitieron semanas/meses después de la primera sesión de imágenes y las estructuras inherentes al tejido (vasculatura y patrones de criptas marcadas clonalmente) se utilizaron como puntos de referencia para encontrar exactamente la misma ubicación de la lesión (Figura 2). Cuando este método se aplicó en ratones Lgr5Cre-Confetti, donde Lgr5-eGFP se expresa de manera irregular, se pudieron capturar cambios en los números y formas de la cripta después del daño inducido por el láser (Figura 3). Mientras que algunas regiones no mostraron cambios en el número y la estructura de las criptas (Figura 3B), otras regiones mostraron una extensa remodelación de criptas, como se ve en el número de eventos de fisión y fusión de criptas (Figura 3C) y la pérdida de criptas 2 semanas después de la lesión inducida por láser (Figura 3D). Al introducir diferentes tamaños de daño y cuantificar los eventos de fisión, fusión y desaparición después de la ablación, como en el ejemplo que se muestra en (Figura 3E), la dinámica de la regeneración inducida por lesiones se puede mapear en diferentes modelos de ratón.

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Figura 1: Representación esquemática de la configuración experimental. El marcado in vivo de las células intestinales se logra inyectando tamoxifeno por vía intraperitoneal en modelos de ratón modificados genéticamente para inducir la recombinación mediada por Cre en criptas intestinales. Después de días o semanas (cuando las criptas son monoclonales para un cierto color), el intestino se expone quirúrgicamente y se somete a ablación láser utilizando un microscopio multifotón con una cámara de temperatura controlada. El alcance del daño de la cripta se caracteriza inmediatamente después de la ablación y se permite que el mouse se recupere del procedimiento. La exposición quirúrgica repetida y la MIV se utilizan para controlar la recuperación intestinal a lo largo del tiempo. El patrón y la distribución de la vasculatura sanguínea y las criptas de diferentes colores se utilizan para encontrar las mismas regiones semanas o meses después de la ablación. La remodelación de la cripta (por ejemplo, fisión o fusión) se puede observar en el sitio del daño semanas después de la ablación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Imágenes longitudinales de la regeneración tisular tras el daño inducido por láser en el intestino. Cuando el intestino se coloca exactamente de la misma manera, los vasos sanguíneos del intestino se pueden usar como un mapa para encontrar e imágenes de las mismas regiones. (A) Imágenes de visión general de la cámara del intestino. Las líneas blancas discontinuas representan el patrón de la vasculatura vecina al sitio del daño (caja blanca), utilizada como un punto de referencia para encontrar la misma región ablacionada con láser en otro punto de tiempo. Las dos imágenes inferiores muestran la vista ampliada de la caja blanca. La flecha representa el sitio exacto de la ablación con láser en el día 1 y 1 mes después. (B) Imágenes fluorescentes de un solo daño de cripta capturadas por microscopio multifotónico. La flecha en el cuadro azul muestra el sitio del daño en el día 1 y 1 mes después. (C) Imágenes fluorescentes de un campo dañado de criptas. Las flechas en el cuadro azul marcan la región del daño en el día 1 y 1 mes después. Barras de escala: 1 mm (A, arriba); 0,25 mm (A, abajo); 200 μm (gran visión general B y C); y 50 μm (imágenes ampliadas B y C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Imágenes intravitales de los destinos de las criptas después de la ablación con láser. (A) Usando el modelo de confeti, las criptas etiquetadas con diferentes colores se pueden seguir a lo largo del tiempo para mapear la dinámica de la recuperación. La flecha blanca representa el sitio de la ablación con láser. La caja amarilla representa una región vecina (<100 μm del sitio del daño), mientras que las cajas azul y púrpura representan regiones alejadas (>100 μm) de la región ablacionada por láser. Se observan diferentes modos de regeneración. (B) Algunas regiones permanecen sin cambios como en el compartimento púrpura. (C) Otras regiones exhiben remodelación de criptas en forma de fisión o fusión de criptas; Las líneas blancas discontinuas y las flechas representan eventos de fisión de criptas y las líneas y flechas discontinuas naranjas representan eventos de fusión de criptas. (D) En algunas regiones, se observa la desaparición de la cripta, como en el cuadro amarillo donde la cripta resaltada con una línea discontinua naranja desapareció. (E) Un ejemplo de cuantificación que muestra el número de eventos de remodelación de criptas observados en las áreas vecinas (es decir, menos de 100 μm) y lejos (es decir, más de 100 μm) del sitio dañado. Barras de escala: 200 μm (A); 50 μm (B-D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo combina la ablación microscópica con láser y la microscopía intravital longitudinal para seguir la regeneración intestinal desde la respuesta temprana al daño hasta la remodelación tisular a largo plazo. La técnica se ha establecido en estricto apego a las consideraciones éticas para inducir e imagen de la ablación microscópica con láser, y cuando se sigue con precisión mantendrá el bienestar animal. Durante la cirugía, es importante asegurarse de que la integridad del intestino esté bien preservada. Esto se puede lograr manejando suavemente el tejido con hisopos de algodón húmedos estériles, lo que evita el sangrado o la sequedad del tejido. La extensión del daño microscópico inducido por láser también debe evaluarse cuidadosamente mediante imágenes de las diferentes capas intestinales del área después de la ablación con láser. Si el investigador desea adaptar la frecuencia de los pasos experimentales descritos en este protocolo, se debe consultar al comité de ética animal del instituto antes del experimento para establecer las consecuencias sobre el bienestar.

La microscopía intravital repetitiva permite monitorear la recuperación del tejido en el mismo ratón a lo largo del tiempo. La exposición quirúrgica repetida del intestino otorga fácilmente acceso óptico a todo el tracto intestinal. Las características inherentes al tejido, como la vasculatura, sirven como puntos de referencia para identificar las mismas regiones intestinales en cada sesión de imágenes. Por lo tanto, se puede obtener una imagen de la misma región de tejido durante varias semanas, lo que permite cuantificar la regeneración tisular a largo plazo en la misma área intestinal en el mismo ratón. El control espaciotemporal ofrecido por el método combinado de cirugía e imagen trae la ventaja de que el mismo órgano puede ser fotografiado bajo condiciones homeostáticas y regeneradoras en el mismo ratón, lo que contrasta con los modelos anteriores de daño de órganos completos donde los controles y las muestras regeneradoras se originaron en diferentes ratones 11,12,18,19,20 . Por lo tanto, nuestro entorno experimental minimiza el número requerido de animales necesarios para el experimento y reduce la variación intraanimal.

La solución de problemas del protocolo debe comenzar con una revisión de la técnica de manejo del ratón y el intestino, y un control del equipo y la configuración de microscopía. Hay muchos pasos críticos en este protocolo que requieren atención adicional. En primer lugar, para garantizar el bienestar de los animales y una alta calidad continua de los datos, todo el trabajo debe llevarse a cabo en un entorno limpio y estéril utilizando una técnica aséptica, y la temperatura del ratón debe mantenerse durante la cirugía y cada sesión de imagen. Mantener el tejido hidratado con solución salina estéril precalentada durante las imágenes es esencial y previene la fibrosis tisular.

Para garantizar que el experimento se lleve a cabo de manera reproducible, es importante alinear los láseres antes de su uso para una adquisición óptima y medir la potencia de salida del láser multifotón al comienzo de cada sesión. Parámetros como el tipo de objetivo, la ampliación, el tiempo de permanencia, la potencia del láser y la longitud de onda influyen en el alcance de la ablación láser microscópica y deben considerarse. En este estudio, tanto la ablación láser como la obtención de imágenes se realizan con una potencia láser de 1,2 W (fuera de la lente) a una longitud de onda de 960 nm a través de un objetivo Fluotar VISIR 25x/0.95 WATER. Cambiar la longitud de onda o las propiedades de escaneo óptico afecta la extensión del daño microscópico. Una longitud de onda más baja (como 840 nm) se traduce en fotones de mayor energía y, a menudo, en una mayor salida del láser, y puede aumentar el daño microscópico. Un zoom más alto da como resultado más energía por región y, por lo tanto, menos tiempo para extirpar criptas, y viceversa. El tiempo de permanencia de los píxeles también se puede aumentar o disminuir para cambiar la velocidad de ablación y el alcance del daño. Cuando el tejido fotografiado no es estable (p. ej., debido a movimientos peristálticos), la ablación debe realizarse rápidamente. Para este propósito, la velocidad de ablación debe optimizarse, por ejemplo, aumentando el zoom y / o la salida del láser.

Encontrar la misma región intestinal en múltiples sesiones de imágenes es otro paso crítico que debe ejecutarse correctamente para garantizar el éxito del experimento. Para hacerlo, el intestino debe colocarse exactamente de la misma manera en todos los puntos temporales. Recomendamos utilizar siempre el ciego como punto de referencia para encontrar las mismas regiones en el intestino delgado y grueso. El estiramiento suave del tejido de interés con hisopos de algodón asegura que la región de interés esté dentro del rango de la distancia de trabajo objetivo y maximiza el número de regiones que se pueden rastrear. Además, recomendamos siempre ablacionar y obtener imágenes de múltiples posiciones microscópicas en cada ratón para tener en cuenta las regiones que pueden no estar localizadas en una sesión de imagen posterior. Si no se pueden encontrar las regiones, aunque el posicionamiento del intestino sea correcto, puede ayudar a reposicionar el ratón y cambiar la orientación del área expuesta. El seguimiento de criptas a lo largo del tiempo puede ser engorroso para experimentos donde se ablacionan campos intestinales más grandes de varias criptas adyacentes. Tales insultos dañinos pueden evocar la remodelación del tejido más allá de la monocapa epitelial, que puede culminar en la modificación de los puntos de referencia del tejido utilizados para el seguimiento de la región a lo largo del tiempo. Elegir puntos de referencia a una distancia suficiente del sitio dañado y capturar campos de visión más grandes que superen el área dañada en varios cientos de micrómetros aumenta la posibilidad de experimentos exitosos a largo plazo. Además del posicionamiento incorrecto del intestino en la etapa del microscopio, los movimientos peristálticos del tracto gastrointestinal pueden interferir con las imágenes. Este problema puede mejorarse de dos maneras. Si la frecuencia de los movimientos no es demasiado alta, el proceso puede repetirse en la misma región con un mayor tiempo de exposición. Alternativamente, se pueden usar cantidades más altas de anestesia para disminuir el peristaltismo. Se recomienda limitar las dosis más altas de isoflurano a ajustes cortos. En conjunto, las sesiones de imagen deben mantenerse lo más cortas posible, óptimamente por debajo de 3 h, para garantizar una recuperación rápida.

El enfoque combinado de ablación láser y microscopía intravital longitudinal tiene varias ventajas en comparación con otros modelos de daño. Los modelos anteriores de daño (químico) carecían de la capacidad de confinar localmente el insulto dañino 6,11,12,19,20. La ablación con láser supera esta deficiencia al restringir el daño a una región de interés definida. Esto permite a los investigadores controlar la ubicación de la lesión, así como la extensión del daño. La gravedad del daño se puede modular para extirpar criptas o campos intestinales microscópicos completos para informar sobre las respuestas regenerativas a escala de cripta. Además del control espacial, la ablación con láser también permite cronometrar con precisión el inicio del daño, superando así la precisión de los modelos anteriores de medicamentos, químicos e infecciones 9,10,11,12,19,20. Nuestro protocolo amplía estudios previos que utilizaron la ablación térmica inducida por láser como método para inducir daño localizado en el intestino21,23. Los modelos anteriores de daño inducido por láser tomaron imágenes de áreas locales en el intestino delgado21 o la superficie luminal del colon distal23. El enfoque combinado de cirugía y ablación con láser permite visualizar el epitelio intestinal (criptas en particular) a alta resolución, y realizar ablación con láser e imágenes de seguimiento de la recuperación del tejido en cualquier posición del intestino delgado, ciego y colon proximal. Captura la recuperación de las mismas regiones intestinales a lo largo del tiempo, lo que permite visualizar diferentes capas del intestino (mucosa, submucosa, muscularis y serosa) según la configuración experimental. Nuestra técnica está diseñada principalmente para imágenes repetidas a largo plazo durante un período de varias semanas / meses. Para estudiar la dinámica de recuperación a corto plazo de las criptas (por ejemplo, durante varios días consecutivos después del daño), el enfoque de ablación con láser descrito aquí se puede combinar con ventanas de imágenes intravitales27,28,40.

Este protocolo se puede utilizar para una multitud de aplicaciones de investigación de diversas áreas científicas que abarcan la regeneración, la inmunología y la investigación del cáncer. Las imágenes longitudinales de la regeneración intestinal arrojan luz sobre la dinámica celular que preserva la integridad epitelial y la función de barrera, permite la defensa del huésped contra los patógenos en la luz intestinal y que subyace a la eliminación y propagación de mutaciones oncogénicas. Cada pregunta científica arrojará demandas únicas sobre el alcance del daño inducido por el láser y la duración de las imágenes. Los ratones reporteros fluorescentes y los tintes inyectados pueden expandir y refinar drásticamente los datos que se pueden adquirir al permitir la visualización de cualquier célula y estructura de interés. Por ejemplo, un ratón Lgr5-CreERt2:Rosa26-Confetti se puede utilizar para visualizar progenies de células madre, mientras que el reportero Rosa26-mTmG informa sobre la arquitectura del tejido. Juntos, estos recientes avances tecnológicos hacen de la experimentación intestinal intravital una herramienta lucrativa para avanzar en nuestra comprensión de la biología intestinal y la enfermedad.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este estudio fue apoyado por la Organización Holandesa de Investigación Científica NWO (subvención Vici 09150182110004 a J.v.R. y Veni grant 09150161910151 a H.A.M.), la OCENW. GROOT.2019.085 (a J.v.R), y una beca postdoctoral EMBO (subvención ALTF 452-2019 a H.A.M).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Caja de inducción para anestesiaVeterinary Technics
AutoclaveCertoclav
BetadineMylan202809
Pañal (almohadilla)Absorin comfort
Pinzas DumontFine Scientific Tools11255-20 o 11272-40Inox, estilo #55, utilizado para sujetar el peritoneo
Enzimático limpiador de instrumentosRobozEC-1000
Etanol 80%caseroNA
Pomada para los ojosDuratears Z (Alcon)288/28282-6
Tijeras Finas Rectas 9 cmFine Scientific Tools14060-09Se utiliza para cortar la piel y el peritoneo del ratón
Gasa 5 cmX5 cmCutisoft (Bsn medical)45847-00
Graefe Pinzas Curvas dentadasFine Scientific Tools11051-10Se utilizan para sujetar la piel
Hartman Hemostat StraightFine Scientific Tools13002-10Se utilizan para suturar
Almohadilla térmicaComfortT5-5000
Caja de imágenesHecho a medida
Película de incisiónNobafilm
Multifotón invertido microscopio con platina automatizadaLeica MicrosystemsNA
Isoflurano (vetflurano)Pharmachemie BV, Haarlem, Países Bajos305788
Vaporizador de isofluranoPenlon sigma delta
Cinta de papel MicroporeMicropore
NaCl 0.9%BraunOtras marcas disponibles
Aguja 25GBD300600
Cinta de papel tesaTesaNA
ParafilmBemisPM-994semitransparente
Hojas de afeitarSupermax aceromarcas disponibles
Sonda rectalKent Scientific20250-91
Rimadyl Cattle (carprofeno)Zoetis B.VRegistro# REG NL 10130
Estudiante Tijeras Finas Rectas 11,5 cmHerramientas Científicas Finas91460-11Se utiliza para cortar gasas
Limpiador de instrumental quirúrgicoRobozIC-1000
Lubricante para instrumental quirúrgicoRobozIL-1000
Jeringas (1 ml)BD303172Otras marcas disponibles
TamoxifenoSigmaT5648
Temgesic (clorhidrato de buprenorfina)Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser HealthcareRegistration# RVG 08725
Vicryl sutura de poliglactina 5-0 FS-2 agujaEthiconV292ZH
VirkonSBio-servicessolución antiséptica
Hisopo de algodón de madera (estéril)Klinion531530Otras marcas disponibles
172215 cinta inoxidable Otras

Referencias

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