Aquí describimos un método específico en el tiempo para manipular eficazmente las vías críticas de desarrollo en la placenta del ratón in vivo. Esto se realiza mediante la inyección y electroporación de plásmidos CRISPR en las placentas de madres embarazadas en el día embrionario 12.5.
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Artículo de método
Manipulación CRISPR placentaria dirigida a ratones en vivo
En este artículo
Resumen
Resumen
La placenta es un órgano esencial que regula y mantiene el desarrollo de los mamíferos en el útero. La placenta es responsable de la transferencia de nutrientes y desechos entre la madre y el feto y la producción y entrega de factores de crecimiento y hormonas. Las manipulaciones genéticas placentarias en ratones son fundamentales para comprender el papel específico de la placenta en el desarrollo prenatal. Los ratones transgénicos que expresan Cre específicos de la placenta tienen una efectividad variable, y otros métodos para la manipulación de genes placentarios pueden ser alternativas útiles. Este documento describe una técnica para alterar directamente la expresión génica placentaria utilizando la manipulación del gen CRISPR, que se puede utilizar para modificar la expresión de genes específicos. Utilizando un enfoque quirúrgico relativamente avanzado, las madres embarazadas se someten a una laparotomía en el día embrionario 12.5 (E12.5), y un plásmido CRISPR se administra mediante una micropipeta de vidrio en las placentas individuales. El plásmido se electropora inmediatamente después de cada inyección. Después de la recuperación de la madre, las placentas y los embriones pueden continuar el desarrollo hasta la evaluación en un momento posterior. La evaluación de la placenta y la descendencia después del uso de esta técnica puede determinar el papel de la función placentaria específica en el tiempo en el desarrollo. Este tipo de manipulación permitirá una mejor comprensión de cómo la genética placentaria y la función afectan el crecimiento y desarrollo fetal en múltiples contextos de enfermedades.
Introducción
La placenta es un órgano esencial implicado en el desarrollo del feto. El papel principal de la placenta es proporcionar factores esenciales y regular la transferencia de nutrientes y desechos hacia y desde el feto. Las placentas de mamíferos están compuestas por tejido fetal y materno, que constituye la interfaz fetal-materna y, por lo tanto, la genética de la madre y el feto impactan la función1. Las anomalías genéticas o la función deteriorada de la placenta pueden alterar drásticamente el desarrollo fetal. Trabajos anteriores han demostrado que la genética y el desarrollo de la placenta están asociados con el desarrollo alterado de sistemas....
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Protocolo
Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo y cumplimiento con las regulaciones federales y la política de la Universidad de Iowa y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
1. Animales y cría
- Mantener a los animales en un ciclo de luz diurna de 12 h con comida y agua ad libitum.
- Use ratones hembra CD-1 de 8 a 15 semanas. Utilice la presencia de un tapón copulatorio para identificar E0.5.
- En E0.5, casa sola las presas preñadas.
2. Calibración de la micropipeta
NOTA: La ca....
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Resultados
Resultados generales del procedimiento (Figura 6)
En el estudio, hubo tres grupos manipulados. Estos incluyeron placentas inyectadas con un plásmido de control CRISPR Cas9 general (Cas9 Control), un plásmido CRISPR de control de activación (Act Control) o un plásmido de activación SAM IGF-1 (Igf1-OE). El Cas9 Control es más adecuado para plásmidos knockout, y el control de activación es más adecuado para plásmidos de sobreexpresión/activación. Pa.......
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Discusión
La placenta es un regulador primario del crecimiento fetal y, como se señaló anteriormente, los cambios en la expresión o función génica de la placenta pueden afectar significativamente el desarrollo fetal6. El protocolo descrito aquí se puede utilizar para realizar una manipulación CRISPR in vivo dirigida de la placenta del ratón utilizando un enfoque quirúrgico relativamente avanzado. Esta técnica permite un rendimiento significativo de embriones viables y sus correspondientes placentas.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocen las siguientes fuentes de financiamiento: R01 MH122435, NIH T32GM008629 y NIH T32GM145441. Los autores agradecen a los laboratorios del Dr. Val Sheffield y el Dr. Calvin Carter en la Universidad de Iowa por el uso de su sala de cirugía y equipo, así como al Dr. Eric Van Otterloo, el Dr. Nandakumar Narayanan y el Dr. Matthew Weber por su ayuda con la microscopía. Sara Maurer, Maya Evans y Sreelekha Kundu por su ayuda con las cirugías piloto.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de 1,5 ml | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% de paraformelfehído (PFA) en PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899. | |
| 96 Placa de pocillos | Cornings | 3598 | para kit |
| BCA Almohadillas absorbentes | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Plásmido de control de activación | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Agua sin dnasa proporcionada para dilución |
| AMV Transcriptasa inversa | New England Biolabs | M0277L Uso | para la síntesis de ADNc |
| Anestésico Vaporizador de gas | Vetamac | VAD-601TT | Vaporizador compacto VAD-Artifical |
| Gel de lágrimas | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Kit de ensayo de proteínas | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Cuantificación de proteínas |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Homogeneizador de tejidos portátil |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Procesamiento de imágenes a imágenes FISH. |
| Centrífuga 5810 | Eppendorf | EP022628168 | centrífuga de placas |
| Cloroformo | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP Aislamiento de | ARN |
| Aplicadores con punta de algodón | ProAdvantage | 77100 | Esterilizar antes de usar |
| Plásmido de control CRISPR/Cas9 | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Agua sin ADN suministrada para dilución |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Leica | M125 C | Se utiliza para la obtención de imágenes posteriores a la necroscopia | |
| Suturas solubles | Med Vet International | J385H | |
| Agua destilada | Gibco | 15230162 | |
| solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcio; (-) Magnesio |
| ECM 830 Electro Electro Electroporator (Máquina de Electroporación) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Solo |
| generador Maquinilla de afeitar eléctrica | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Paletas de electroporación/Tpinezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | paletas de 3 mm de diámetro; cables incluidos |
| Casete de inclusión: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Casetes de inclusión de placenta |
| Etanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Exceso de filtro de isoflurano |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Disolver a 1 μ g/ml y filtro; proteger de la luz |
| Fotómetro de microplacas basado en filtro (lector de placas) | Fisher Scientific | 14377576 | Se puede utilizar para BCA y ELISA |
| Pinzas | VWR | 82027-386 | Puntas finas, rectas, dentadas |
| Solución de formalina, tamponada neutra, 10% | Sigma Aldrich | ||
| Capilares de vidrio - Vidrio de borosilicato (micropipeta) | Instrumento | SutterB150-86-10 | Diámetro exterior: 1,5 mm, diámetro interior: 0,86 mm, 10 cm de longitud |
| Cóctel de proteasa e inhibidores de fosfotasa Halt (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Tampón de homogeneización de proteínas |
| Almohadilla térmica | Thermotech | S766D | Almohadilla térmica húmeda digital |
| Hemostáticos | VWR | 10806-188 | Mordaza totalmente sobrerrateada; curvo |
| Baño de agua caliente | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 Plásmido SAM (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Agua libre de dnasa proporcionada para dilución |
| Cámara de inducción | Vetamac | 941443 | No se requiere un tamaño de litro específico |
| Isoflurano | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isopropón/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 Aislamiento de | ARN |
| Ketamina HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Cloruro Sigma | Aldrich | 63069-100ML | 1M. Tampón de homogeneización de proteínas |
| MicroAmp™ Placa de reacción óptica de 384 pocillos con código de barras | Fisher Scientific | 4309849 No se requieren placas con código de barras | |
| Punta microcapilar | Eppendorf | 5196082001 | acoplada al microinyector BTX Microinyector |
| Aparato BTX Harvard | 45-0766 Soporte de | pipeta de acero inoxidable, 130 mm de longitud, para pipetas de 1 a 1,5 mm | |
| Microject 1000A (máquina de inyección) | Aparato BTX Harvard | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Extractor de micropipetas modelo P-97 | Sutter Instrument | P-97 Tirador de | micropipetas de tipo flameado/marrón |
| Mezclador de microplacas (agitador de placas) | scilogex | 822000049999 | |
| Ratón/Rata IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Agujas | BD - Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0,3 mm x 13 mm) |
| Tanque de nitrógeno | Linde | 7727-37-9 | Cualquier gas interno |
| Medicamento antiinflamatorio no esteroideo (AINE) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesguisos como Meloxicam |
| Cono de nariz | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Colorante de detección Opal 620 | SKU de Akoya Biosciences | FP1495001KT | utiliza para FISH |
| Temperatura de corte óptima (O.C.T) Compuesto | Sakura | 4583 | |
| Tanque | de oxígeno Linde | 7782 - 44 - 7 | Oxígeno de grado médico |
| Majles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidona Solución de Yodo, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Energía SYBR&comercio; Mezcla maestra de PCR verde | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Uso para |
| hexámeros aleatorios de qPCR (cebadores aleatorios) | New England Biolabs | S1330S | Uso para la síntesis de ADNc |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| Kit de limpieza de ARN & Concentrador | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contiene todos los reactivos necesarios para la hibridación fluorescente in situ. Las sondas se venden por separado. |
| ARNscope&comercio; Sonda- mm-Prl8A8-C2 | Diagnóstico avanzado de células | 528641-C2 | |
| ARNascopio&comercio; Sonda- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Diagnóstico avanzado de células | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Horno seco para hibridación in situ |
| Tijeras | VWR | 82027-578 | Tijeras de disección, punta afilada, 4¹/? |
| Cloruro de sodio (solución salina) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Estéril, 0.9% |
| Citrato de sodio, sal trisódica, dihidratado, [ácido cítrico, dihidrato trisódico] | Producto de investigación internacional | 03-04-6132 | |
| Concentrado de hidróxido de sodio 1N, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Tampón de homogeneización de proteínas |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Paño quirúrgico estéril | Busse | 696 | Esterilizar antes |
| de usar Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cubierta de vidrio 24x60 | Jeringas Leica | 3800160 | |
| BD - Becton, Dickson and Company | 309659 | BD Luer Jeringa de punta deslizante estéril, de un solo uso, 1 mL | |
| Thermo Scientific&comercio; Invitrogen&comercio; Nanodrop&comercio; Un espectrofotómetro con WiFi y Qubit™ 4 Fluorímetro | Fisher Scientific | 13-400-525 | Esta configuración viene con fluorímetro Qubit 4. No se requiere cuantificación de cúbits. |
| Adhesivo para tejidos | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Tampón de homogeneización de proteínas |
| TRIzol™ Reactivo | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | Aislamiento de ARN |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Se utiliza para diluir el colorante de detección Opal 620 |
| Circuito F universal | Vetamac | 40200 | Acoplado al vaporizador y accesorios del vaporizador |
| Microscopio vertical de fluorescencia compuesta | Olympus | BX61VS | Se utiliza para la obtención de imágenes FISH |
| Vectorshield con medios de montaje DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip |
| Sistema de PCR en tiempo real 7 con bloque de 384 pocillos | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | Esto es para la detección de bloques de 384 pocillos SYBR. TaqMan y/o bloques más pequeños disponibles |
| Wet n Wild Esmalte de uñas Wild Shine, Clear Nail Protector, Color de uñas | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased 343730_RX |
Referencias
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
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