Aquí describimos un método específico en el tiempo para manipular eficazmente las vías críticas de desarrollo en la placenta del ratón in vivo. Esto se realiza mediante la inyección y electroporación de plásmidos CRISPR en las placentas de madres embarazadas en el día embrionario 12.5.
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Artículo de método
Manipulación CRISPR placentaria dirigida a ratones en vivo
En este artículo
Resumen
Resumen
La placenta es un órgano esencial que regula y mantiene el desarrollo de los mamíferos en el útero. La placenta es responsable de la transferencia de nutrientes y desechos entre la madre y el feto y la producción y entrega de factores de crecimiento y hormonas. Las manipulaciones genéticas placentarias en ratones son fundamentales para comprender el papel específico de la placenta en el desarrollo prenatal. Los ratones transgénicos que expresan Cre específicos de la placenta tienen una efectividad variable, y otros métodos para la manipulación de genes placentarios pueden ser alternativas útiles. Este documento describe una técnica para alterar directamente la expresión génica placentaria utilizando la manipulación del gen CRISPR, que se puede utilizar para modificar la expresión de genes específicos. Utilizando un enfoque quirúrgico relativamente avanzado, las madres embarazadas se someten a una laparotomía en el día embrionario 12.5 (E12.5), y un plásmido CRISPR se administra mediante una micropipeta de vidrio en las placentas individuales. El plásmido se electropora inmediatamente después de cada inyección. Después de la recuperación de la madre, las placentas y los embriones pueden continuar el desarrollo hasta la evaluación en un momento posterior. La evaluación de la placenta y la descendencia después del uso de esta técnica puede determinar el papel de la función placentaria específica en el tiempo en el desarrollo. Este tipo de manipulación permitirá una mejor comprensión de cómo la genética placentaria y la función afectan el crecimiento y desarrollo fetal en múltiples contextos de enfermedades.
Introducción
La placenta es un órgano esencial implicado en el desarrollo del feto. El papel principal de la placenta es proporcionar factores esenciales y regular la transferencia de nutrientes y desechos hacia y desde el feto. Las placentas de mamíferos están compuestas por tejido fetal y materno, que constituye la interfaz fetal-materna y, por lo tanto, la genética de la madre y el feto impactan la función1. Las anomalías genéticas o la función deteriorada de la placenta pueden alterar drásticamente el desarrollo fetal. Trabajos anteriores han demostrado que la genética y el desarrollo de la placenta están asociados con el desarrollo alterado de sistemas de órganos específicos en el feto. En particular, las anomalías en la placenta están relacionadas con cambios en el cerebro, el corazón y el sistema vascular fetales 2,3,4,5.
El transporte de hormonas, factores de crecimiento y otras moléculas de la placenta al feto juega un papel importante en el desarrollo fetal6. Se ha demostrado que alterar la producción placentaria de moléculas específicas puede alterar el neurodesarrollo. La inflamación materna puede aumentar la producción de serotonina al alterar la expresión génica metabólica del triptófano (TRP) en la placenta, lo que posteriormente crea una acumulación de serotonina en el cerebro fetal7. Otros estudios han encontrado anomalías placentarias junto con defectos cardíacos. Se cree que las anomalías en la placenta contribuyen a los defectos cardíacos congénitos, el defecto congénito más común en los seres humanos8. Un estudio reciente ha identificado varios genes que tienen vías celulares similares tanto en la placenta como en el corazón. Si se interrumpen, estas vías podrían causar defectos en ambos órganos9. Los defectos en la placenta pueden exacerbar los defectos cardíacos congénitos. El papel de la genética placentaria y la función en el desarrollo de sistemas específicos de órganos fetales es un campo de estudio emergente.
Los ratones tienen placentas hemocoriales y otras características de las placentas humanas, lo que los convierte en modelos muy útiles para estudiar enfermedades humanas1. A pesar de la importancia de la placenta, actualmente hay una falta de manipulaciones genéticas in vivo dirigidas. Además, actualmente hay más opciones disponibles para knockouts o knockdowns que manipulaciones de sobreexpresión o ganancia de función en la placenta10. Hay varias líneas transgénicas que expresan Cre para la manipulación placentaria específica, cada una en diferentes linajes de trofoblastos en diferentes puntos de tiempo. Estos incluyen Cyp19-Cre, Ada / Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER y Gcm1-Cre 11,12,13,14. Si bien estos transgenes Cre son eficientes, es posible que no sean capaces de manipular algunos genes en puntos de tiempo específicos. Otro método comúnmente utilizado para noquear o sobreexpresar la expresión génica placentaria es la inserción de vectores lentivirales en el cultivo de blastocisto, lo que causa una manipulación genética específica del trofoblasto15,16. Esta técnica permite un cambio robusto en la expresión génica placentaria al principio del desarrollo. El uso de la interferencia de ARN in vivo se ha utilizado escasamente en la placenta. La inserción de plásmidos de ARNsh se puede realizar de manera similar a la técnica CRIPSR descrita en este artículo. Esto se ha hecho en E13.5 para disminuir con éxito la expresión de PlGF en la placenta, con impactos en la vasculatura cerebral de la descendencia17.
Además de las técnicas que se utilizan principalmente para knockout o knockdown, la inducción de la sobreexpresión se realiza comúnmente con adenovirus o la inserción de una proteína exógena. Las técnicas utilizadas para la sobreexpresión tienen diferentes tasas de éxito y en su mayoría se han realizado más tarde en la gestación. Para investigar el papel del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) en la función placentaria, se realizó una transferencia génica placentaria mediada por adenovirus para inducir la sobreexpresión del gen IGF-1 18,19. Esto se realizó al final de la gestación del ratón en E18.5 mediante inyección placentaria directa. Para proporcionar opciones adicionales y eludir posibles fallos de manipulaciones genéticas placentarias establecidas, como fallos de combinación Cre-Lox, la posible toxicidad de adenovirus y los efectos fuera del objetivo del ARNsh, se puede utilizar la manipulación directa in vivo de CRISPR de la placenta20,21,22. Este modelo fue desarrollado para abordar la falta de modelos de sobreexpresión y para crear un modelo con flexibilidad.
Esta técnica se basa en el trabajo de Lecuyer et al., en el que los plásmidos shRNA y CRISPR fueron dirigidos directamente in vivo a placentas de ratón para alterar la expresión de PlGF 17. Esta técnica se puede utilizar para alterar directamente la expresión génica placentaria mediante la manipulación CRISPR en múltiples puntos de tiempo; para este trabajo, se seleccionó E12.5. La placenta ha madurado en este punto y es lo suficientemente grande como para manipularla, lo que permite la inserción de un plásmido CRISPR específico en E12.5, que puede tener un impacto significativo en el desarrollo fetal desde mediados hasta finales del embarazo23,24. A diferencia de los enfoques transgénicos, pero similares a las inducciones virales o la interferencia de ARN, esta técnica permite la sobreexpresión o el knockout en puntos de tiempo particulares utilizando un enfoque quirúrgico relativamente avanzado, evitando así posibles alteraciones de la placenta o letalidad embrionaria de cambios anteriores. Como solo unas pocas placentas reciben el plásmido experimental o de control dentro de una camada, el enfoque permite dos tipos de controles internos. Estos controles son los inyectados y electroporados con el plásmido de control adecuado y los que no reciben manipulación directa. Esta técnica se optimizó para crear una sobreexpresión del gen IGF-1 en la placenta del ratón a través de un plásmido CRISPR mediador de activación sinérgico (SAM). Se eligió el gen IGF-1, ya que el IGF-1 es una hormona de crecimiento esencial entregada al feto que se produce principalmente en la placenta antes del nacimiento25,26. Esta nueva técnica CRISPR dirigida a la placenta permitirá la manipulación directa para ayudar a definir la conexión entre la función placentaria y el desarrollo fetal.
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Protocolo
Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo y cumplimiento con las regulaciones federales y la política de la Universidad de Iowa y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
1. Animales y cría
- Mantener a los animales en un ciclo de luz diurna de 12 h con comida y agua ad libitum.
- Use ratones hembra CD-1 de 8 a 15 semanas. Utilice la presencia de un tapón copulatorio para identificar E0.5.
- En E0.5, casa sola las presas preñadas.
2. Calibración de la micropipeta
NOTA: La calibración de la micropipeta debe realizarse antes de la cirugía cuando sea posible.
- Antes de hacer y calibrar la micropipeta, diluir todos los plásmidos a la concentración recomendada (0,1 μg/μL) en agua libre de DNasa. Mezclar el plásmido con el colorante verde rápido adecuadamente diluido (1 μg/μL en PBS) (concentración final del plásmido: 0,06 μg/μL).
- Tire de micropipetas utilizando capilares de vidrio de 10 cm con un diámetro exterior de 1,5 mm y un diámetro interior de 0,86 mm con un extractor de micropipetas.
- Rompa con cuidado la punta de una micropipeta (2-3 mm) con pinzas estériles.
- Cargue la micropipeta en una punta microcapilar conectada a un microinyector. Asegúrese de que el microinyector esté conectado a la máquina de microinyección y que haya niveles suficientes de nitrógeno para calibrar la micropipeta.
- Una vez que la micropipeta esté conectada al microinyector, cárguela con la solución de colorante Fast Green para realizar la calibración (1 μg/μL en PBS). Calibrar la micropipeta para inyectar un volumen de aproximadamente 3,5 μL. Vacíe ("limpie") la micropipeta en preparación para cargar las soluciones plásmidas como se muestra a continuación.
NOTA: Cada micropipeta será ligeramente diferente. Para evitar dañar la placenta durante la inyección, el tiempo de inyección debe establecerse entre 0,5-1,5 s. La presión debe establecerse entre 1-8.5 psi. Calibrar cada micropipeta por separado; Si la micropipeta no se puede calibrar dentro de estos parámetros, entonces no debe utilizarse.
3. Cirugía (Figura 1A)
NOTA: Para preparar, limpie las superficies de las áreas de preparación y quirúrgicas con etanol al 70%. Coloque una almohadilla absorbente en el área de preparación. En el área de la cirugía, coloque una almohadilla térmica hacia abajo y luego coloque una almohadilla interna absorbente encima de esta. Esterilice todas las herramientas antes de la cirugía. El tiempo que la presa está bajo anestesia debe ser inferior a 1 h.
- Anestesia
- Administrar 5 mg/kg de AINE (meloxicam) u otro analgésico aprobado a la madre embarazada de 30 min a 1 h antes de la cirugía.
- Coloque la madre embarazada en una cámara de inducción conectada a un vaporizador de isoflurano.
- Ajuste el vaporizador al 4% de isoflurano y 3,5 L/min de oxígeno.
- Una vez que la anestesia ha sido confirmada por la falta de respuesta a un pellizco en el dedo del pie y una frecuencia respiratoria reducida, retire la presa de la cámara de inducción al área de preparación.
- Preparación quirúrgica
- En el área de preparación, coloque la presa supina con un cono nasal.
- Reduzca el vaporizador al 2% de isoflurano y 3,5 L/min de oxígeno mientras la presa está en el cono de la nariz.
- Afeite bien el abdomen de la presa y elimine el exceso de pelaje. Alterne el recubrimiento del abdomen afeitado con solución de povidona y etanol al 70% tres veces usando aplicadores estériles con punta de algodón. Aplique la capa final de la solución de povidona. Para evitar el secado de la córnea, coloque gel lagrimal artificial sobre ambos ojos de la presa (Figura 2A, B).
- Después de la preparación, mueva la presa con el cono de la nariz al área de cirugía designada.
- Laparotomía uterina
NOTA: Use guantes estériles durante todo el procedimiento quirúrgico. Cambie los guantes si entra en contacto alguna superficie no estéril.- En el área de la cirugía, coloque la madre supina y asegure el cono nasal en su lugar con cinta adhesiva. Ajuste la almohadilla térmica debajo de la almohadilla absorbente a 45 °C.
- Usando fórceps y tijeras, haga una incisión de aproximadamente 2 cm en la línea media a través de la piel. Use fórceps para colocar la piel en la carpa y haga una incisión vertical en la piel. Después de esto, haga otra incisión de tamaño similar a través del peritoneo para exponer los cuernos uterinos. Con fórceps, coloque el peritoneo mientras realiza la incisión vertical (Figura 2C, D).
NOTA: Si no se coloca correctamente la tienda de campaña mientras se incide el peritoneo, puede provocar una incisión fatal en los intestinos. - Masajee suavemente los cuernos uterinos a través de la incisión presionando los lados del abdomen. Haga esto guiando cuidadosamente el útero sin herramientas, usando solo los dedos para evitar lesiones accidentales. Coloque el útero expuesto encima de una cortina quirúrgica estéril que cubra el abdomen de la presa y manténgalo húmedo durante toda la cirugía con gotas de solución salina estéril, que se puede calentar a 30 ° C antes de usar según sea necesario (Figura 2E, F).
NOTA: Los cuernos uterinos pueden ser identificados como se describe en Wang et al.27. - Una vez que el útero está expuesto, seleccione tres pares de placentas para su manipulación.
NOTA: Las placentas pueden ser identificadas como lo describen Elmore et al.24. Para maximizar la supervivencia de los embriones, no se deben tratar más de 6 placentas. Si hay menos de 12 embriones presentes, no se deben inyectar más de 4 placentas. Seleccione dos placentas adyacentes para que una reciba una inyección de control y la otra reciba el plásmido experimental. El uso de dos placentas adyacentes permite una mejor comparación de placentas en lugares similares en el útero y también permite una mayor tasa de supervivencia. Los pares placentarios seleccionados se eligen al azar y se espacian a lo largo de ambos cuernos uterinos (Figura 1B). - Registre la ubicación de las manipulaciones placentarias y la organización de los embriones dentro de los cuernos uterinos para que los embriones y las placentas puedan identificarse durante la recolección, ya que una madre llevará placentas / embriones controlados y tratados experimentalmente.
- Inyección placentaria y electroporación del plásmido control
NOTA: Para mantener una técnica aséptica, esterilice las paletas de electroporación y el microinyector con un esterilizante frío antes de su uso. Cambie los guantes si entra en contacto con alguna superficie no estéril.- Utilizando la micropipeta calibrada, cargar una cantidad suficiente del plásmido de control adecuado para tres inyecciones. Realice todas las inyecciones a una profundidad de ~0.5 mm lateralmente en la placenta entre la decidua (blanco) y la zona de unión (rojo oscuro) (Figura 3A-F).
- Realizar inyecciones en las tres placentas de control.
NOTA: Realice todas las inyecciones de plásmidos de control antes de las inyecciones experimentales para evitar la contaminación cruzada de los plásmidos con la micropipeta. Esto permitirá utilizar la misma micropipeta, ya que cambiar las micropipetas y el tiempo de calibración aumenta drásticamente el tiempo de cirugía y disminuye la supervivencia de la madre. - Realizar la electroporación de las placentas inyectadas con plásmidos de control dentro de los 2 minutos posteriores a la inyección.
- Para la electroporación, utilice un par de paletas de 3 mm conectadas a una máquina de electroporación. Para garantizar la eficiencia de incorporación de CRISPR y la viabilidad de los embriones, utilice los siguientes ajustes de electroporación: 2 pulsos, 30 V, pulso de 30 ms, pulso de 970 ms apagado, unipolar.
- Después de la inyección, pero inmediatamente antes de la electroporación, cubra los lugares de contacto con solución salina estéril, aplicando la solución salina con precisión en los tres sitios de la pared uterina y las paletas con un gotero o jeringa.
- Presione suavemente las paletas de electroporación en los lados laterales de la placenta. Coloque la paleta del ánodo sobre el lugar de inyección y el cátodo directamente opuesto (Figura 4A-C).
- Presione el pulso en la máquina de electroporación y espere a que se completen los dos pulsos antes de retirar las paletas de electroporación.
NOTA: A menudo se ve una pequeña cantidad de espuma blanca entre las paletas y la placenta durante los pulsos. Si esto no ocurre, verifique el voltaje de las paletas con un voltímetro antes de seguir usándolo. Si la lectura en el voltímetro no coincide con la configuración de voltaje de electroporación, las paletas no funcionan.
- Inyección placentaria y electroporación del plásmido experimental
- Siga las mismas instrucciones del paso 3.4.1. al paso 3.4.2. utilizando el plásmido experimental en lugar del plásmido de control.
- Realizar la electroporación de las tres placentas inyectadas experimentales dentro de los 2 minutos posteriores a la inyección. Esto debe realizarse de la misma manera que para aquellos inyectados con los plásmidos de control. Siga el paso 3.4.4. al paso 3.4.7.
- Finalización de la cirugía
- Una vez que se complete la manipulación placentaria, masajee suavemente los cuernos uterinos dentro de la cavidad abdominal usando solo los dedos (Figura 5A).
- Primero, realice suturas simples de doble nudo en la capa de peritoneo utilizando suturas solubles recubiertas y trenzadas que tengan 45 cm de largo con una aleación de aguja de 13 mm 3/8c. Espaciar las suturas a 2-3 mm de distancia (Figura 5B).
- Después de suturar la capa de peritoneo, suture la piel con suturas solubles. Anude tres veces las suturas simples separadas por 2-3 mm para garantizar que la presa no pueda deshacer la sutura (Figura 5C).
- Una vez completada la sutura, ajustar el isoflurano al 1% y el oxígeno a 3,5 L/min, y aplicar adhesivo tisular a las suturas sobre la piel (Figura 5D).
NOTA: El adhesivo tisular es opcional, pero se recomienda para evitar la reapertura de la incisión debido a la masticación de la presa. - Cuando el adhesivo tisular se haya secado, apague el vaporizador y retire la presa del área de la cirugía. Coloque la presa en una jaula de apoyo sobre su espalda.
4. Atención y seguimiento postoperatorio
- Permita que la madre preñada se recupere en una jaula limpia bajo supervisión durante un mínimo de 30 minutos para garantizar que no haya complicaciones inmediatas de la cirugía. Observe hasta que esté completamente ambulatorio y pueda voltearse sobre sus pies sin ayuda. Individualmente casa la presa post-cirugía.
- Seguir el cuidado postoperatorio institucional y el seguimiento hasta la recolección de embriones. Registre el peso de la presa y controle las suturas y el sitio de la incisión diariamente.
5. Recolección placentaria E14.5
- En E14.5, anestesiar profundamente la presa con un cóctel de ketamina/xilazina (1 mg/ml de ketamina y 0,1 mg/ml de xilazina), y luego dislocar cervicamente la presa.
- Haga una incisión en forma de V en el abdomen de la presa con tijeras y retire el útero. Colocar inmediatamente sobre una placa de Petri de 5 cm sobre hielo. Con fórceps, retire cuidadosamente el embrión y la placenta correspondiente del útero.
NOTA: Mantenga un registro de la ubicación del embrión y la placenta correspondiente en los cuernos uterinos para determinar cuál recibió la manipulación directa durante la cirugía. - Registre los pesos de la placenta. Usando fórceps y cuchillas de afeitar sin ARNasa, corte la placenta por la mitad en la línea media. Poner la mitad en PFA al 4% a 4 °C. Cortar la mitad restante por la mitad de nuevo, y almacenar los dos cuartos restantes a -80 °C en dos tubos, uno con reactivo de almacenamiento de ARN.
NOTA: Los embriones y otros tejidos maternos pueden almacenarse de la colección a -80 °C para su uso futuro.
6. Análisis de expresión génica placentaria
- Utilice la cuarta parte de la placenta almacenada a -80 °C en un reactivo de almacenamiento de ARN.
- Procesar las placentas para qPCR como se describe en Elser et al. utilizando el método Trizol para el aislamiento de ARN, un espectrofotómetro para la concentración de ARN, un kit de síntesis de ADNc y qPCR con SYBR Green Master Mix28. En lugar de la DNAsa del kit Turbo DNAfree a la que se hace referencia en Elser et al., use un kit RNAcleanup después del aislamiento de ARN Trizol para asegurarse de que las muestras no contengan contaminantes28.
NOTA: Lea la hoja de datos de seguridad de materiales (MSDS) de Trizol y úsela en una campana extractora de humos químicos. - Evaluar la inserción del plásmido control con cebadores GFP y del plásmido experimental con cebadores BLAST (cebadores enumerados en la Tabla suplementaria 1). Utilice el valor de TC para determinar la presencia del plásmido.
NOTA: Los valores de TC superiores a 35 son falsos positivos, y solo los inferiores a 35 deben considerarse un indicador positivo de que el plásmido se insertó correctamente. - Evaluar la expresión placentaria de IGF-1 normalizada al gen de mantenimiento 18s (cebadores enumerados en la Tabla suplementaria 1). Utilice el método ddCT para calcular el cambio de pliegue y, a continuación, calcule el cambio de pliegue normalizado de las muestras experimentales al cambio medio de pliegue de las muestras de control.
7. Análisis del nivel de proteína placentaria
- Utilice el cuarto de la placenta que se ha almacenado a -80 °C. Homogeneizar el tejido en una solución tampón hecha de 11,5 mM de Tris HCl, 5 mM de MgCl2 y 10 mM de inhibidor de la proteasa endiH2Ocon un pH final de 7,4. Use un homogeneizador de mano y un mortero para romper el tejido.
NOTA: La muestra no debe exceder el 10% del volumen del tampón. - Diluir las muestras homogeneizadas en el tampón a 1:12, de modo que estén dentro del rango detectable de un kit de ensayo de ácido bicinchonínico (BCA). Realice el ensayo de BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cuantifique la proteína total utilizando un lector de placas.
- Después de realizar el ensayo de BCA, normalizar todas las muestras a la misma concentración total de proteína de 2 mg/mL para el ELISA de IGF-1, como se hizo en Gumusoglu et al.29.
- Realice el ELISA IGF-1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cuantifique los niveles de proteína IGF-1 con un lector de placas utilizando una curva de concentración estándar.
8. Verificación espacial de CRIPSR mediante etiquetado fluorescente de hibridación in situ
- Después de que las mitades placentarias se hayan fijado adecuadamente en PFA al 4% a 4 °C durante 1-3 días, moverlas a sacarosa al 20% a 4 °C antes de congelarlas en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT).
- Dividir en serie las mitades de la placenta incrustada en OCT en un criostato de −20 °C en secciones de 10 μm, y colocarlas en portaobjetos para etiquetarlas. Secciona la placenta a la mitad para que las tres subregiones sean visibles. Conservar los portaobjetos a -80 °C hasta su uso para la hibridación in situ .
- Realizar el etiquetado de hibridación fluorescente in situ (FISH) siguiendo los protocolos del fabricante. Hibridar un portaobjetos con una sonda dCas9-3xNLS-VP64 y un segundo portaobjetos "hermano" de la misma placenta con una sonda Prl8a8.
NOTA: La sonda dCas9-3xNLS-VP64 detecta la presencia del plásmido de sobreexpresión. La sonda Prl8a8 resalta los espongiotrofoblastos de la zona de unión, lo que permite identificar las subregiones de la placenta. Estas dos sondas están etiquetadas en portaobjetos "hermanos" separados para evitar la interferencia de la fluorescencia multicanal con la autofluorescencia verde en las placentas. - Etiquete ambas sondas con el tinte de detección (Opal 620). Después de completar el protocolo del fabricante para FISH, aplique el medio de montaje DAPI y coloque un cubreobjetos en la corredera. Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.
- Tome imágenes de los portaobjetos en un microscopio de fluorescencia compuesto vertical y procese utilizando un software de procesamiento de imágenes apropiado. Aquí, se utilizó el software CellSens.
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Resultados
Resultados generales del procedimiento (Figura 6)
En el estudio, hubo tres grupos manipulados. Estos incluyeron placentas inyectadas con un plásmido de control CRISPR Cas9 general (Cas9 Control), un plásmido CRISPR de control de activación (Act Control) o un plásmido de activación SAM IGF-1 (Igf1-OE). El Cas9 Control es más adecuado para plásmidos knockout, y el control de activación es más adecuado para plásmidos de sobreexpresión/activación. Pa...
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Discusión
La placenta es un regulador primario del crecimiento fetal y, como se señaló anteriormente, los cambios en la expresión o función génica de la placenta pueden afectar significativamente el desarrollo fetal6. El protocolo descrito aquí se puede utilizar para realizar una manipulación CRISPR in vivo dirigida de la placenta del ratón utilizando un enfoque quirúrgico relativamente avanzado. Esta técnica permite un rendimiento significativo de embriones viables y sus correspondientes placentas...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocen las siguientes fuentes de financiamiento: R01 MH122435, NIH T32GM008629 y NIH T32GM145441. Los autores agradecen a los laboratorios del Dr. Val Sheffield y el Dr. Calvin Carter en la Universidad de Iowa por el uso de su sala de cirugía y equipo, así como al Dr. Eric Van Otterloo, el Dr. Nandakumar Narayanan y el Dr. Matthew Weber por su ayuda con la microscopía. Sara Maurer, Maya Evans y Sreelekha Kundu por su ayuda con las cirugías piloto.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de 1,5 ml | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% de paraformelfehído (PFA) en PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899. | |
| 96 Placa de pocillos | Cornings | 3598 | para kit |
| BCA Almohadillas absorbentes | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Plásmido de control de activación | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Agua sin dnasa proporcionada para dilución |
| AMV Transcriptasa inversa | New England Biolabs | M0277L Uso | para la síntesis de ADNc |
| Anestésico Vaporizador de gas | Vetamac | VAD-601TT | Vaporizador compacto VAD-Artifical |
| Gel de lágrimas | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Kit de ensayo de proteínas | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Cuantificación de proteínas |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Homogeneizador de tejidos portátil |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Procesamiento de imágenes a imágenes FISH. |
| Centrífuga 5810 | Eppendorf | EP022628168 | centrífuga de placas |
| Cloroformo | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP Aislamiento de | ARN |
| Aplicadores con punta de algodón | ProAdvantage | 77100 | Esterilizar antes de usar |
| Plásmido de control CRISPR/Cas9 | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Agua sin ADN suministrada para dilución |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Leica | M125 C | Se utiliza para la obtención de imágenes posteriores a la necroscopia | |
| Suturas solubles | Med Vet International | J385H | |
| Agua destilada | Gibco | 15230162 | |
| solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcio; (-) Magnesio |
| ECM 830 Electro Electro Electroporator (Máquina de Electroporación) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Solo |
| generador Maquinilla de afeitar eléctrica | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Paletas de electroporación/Tpinezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | paletas de 3 mm de diámetro; cables incluidos |
| Casete de inclusión: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Casetes de inclusión de placenta |
| Etanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Exceso de filtro de isoflurano |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Disolver a 1 μ g/ml y filtro; proteger de la luz |
| Fotómetro de microplacas basado en filtro (lector de placas) | Fisher Scientific | 14377576 | Se puede utilizar para BCA y ELISA |
| Pinzas | VWR | 82027-386 | Puntas finas, rectas, dentadas |
| Solución de formalina, tamponada neutra, 10% | Sigma Aldrich | ||
| Capilares de vidrio - Vidrio de borosilicato (micropipeta) | Instrumento | SutterB150-86-10 | Diámetro exterior: 1,5 mm, diámetro interior: 0,86 mm, 10 cm de longitud |
| Cóctel de proteasa e inhibidores de fosfotasa Halt (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Tampón de homogeneización de proteínas |
| Almohadilla térmica | Thermotech | S766D | Almohadilla térmica húmeda digital |
| Hemostáticos | VWR | 10806-188 | Mordaza totalmente sobrerrateada; curvo |
| Baño de agua caliente | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 Plásmido SAM (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Agua libre de dnasa proporcionada para dilución |
| Cámara de inducción | Vetamac | 941443 | No se requiere un tamaño de litro específico |
| Isoflurano | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isopropón/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 Aislamiento de | ARN |
| Ketamina HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Cloruro Sigma | Aldrich | 63069-100ML | 1M. Tampón de homogeneización de proteínas |
| MicroAmp™ Placa de reacción óptica de 384 pocillos con código de barras | Fisher Scientific | 4309849 No se requieren placas con código de barras | |
| Punta microcapilar | Eppendorf | 5196082001 | acoplada al microinyector BTX Microinyector |
| Aparato BTX Harvard | 45-0766 Soporte de | pipeta de acero inoxidable, 130 mm de longitud, para pipetas de 1 a 1,5 mm | |
| Microject 1000A (máquina de inyección) | Aparato BTX Harvard | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Extractor de micropipetas modelo P-97 | Sutter Instrument | P-97 Tirador de | micropipetas de tipo flameado/marrón |
| Mezclador de microplacas (agitador de placas) | scilogex | 822000049999 | |
| Ratón/Rata IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Agujas | BD - Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0,3 mm x 13 mm) |
| Tanque de nitrógeno | Linde | 7727-37-9 | Cualquier gas interno |
| Medicamento antiinflamatorio no esteroideo (AINE) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesguisos como Meloxicam |
| Cono de nariz | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Colorante de detección Opal 620 | SKU de Akoya Biosciences | FP1495001KT | utiliza para FISH |
| Temperatura de corte óptima (O.C.T) Compuesto | Sakura | 4583 | |
| Tanque | de oxígeno Linde | 7782 - 44 - 7 | Oxígeno de grado médico |
| Majles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidona Solución de Yodo, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Energía SYBR&comercio; Mezcla maestra de PCR verde | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Uso para |
| hexámeros aleatorios de qPCR (cebadores aleatorios) | New England Biolabs | S1330S | Uso para la síntesis de ADNc |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| Kit de limpieza de ARN & Concentrador | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contiene todos los reactivos necesarios para la hibridación fluorescente in situ. Las sondas se venden por separado. |
| ARNscope&comercio; Sonda- mm-Prl8A8-C2 | Diagnóstico avanzado de células | 528641-C2 | |
| ARNascopio&comercio; Sonda- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Diagnóstico avanzado de células | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Horno seco para hibridación in situ |
| Tijeras | VWR | 82027-578 | Tijeras de disección, punta afilada, 4¹/? |
| Cloruro de sodio (solución salina) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Estéril, 0.9% |
| Citrato de sodio, sal trisódica, dihidratado, [ácido cítrico, dihidrato trisódico] | Producto de investigación internacional | 03-04-6132 | |
| Concentrado de hidróxido de sodio 1N, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Tampón de homogeneización de proteínas |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Paño quirúrgico estéril | Busse | 696 | Esterilizar antes |
| de usar Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cubierta de vidrio 24x60 | Jeringas Leica | 3800160 | |
| BD - Becton, Dickson and Company | 309659 | BD Luer Jeringa de punta deslizante estéril, de un solo uso, 1 mL | |
| Thermo Scientific&comercio; Invitrogen&comercio; Nanodrop&comercio; Un espectrofotómetro con WiFi y Qubit™ 4 Fluorímetro | Fisher Scientific | 13-400-525 | Esta configuración viene con fluorímetro Qubit 4. No se requiere cuantificación de cúbits. |
| Adhesivo para tejidos | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Tampón de homogeneización de proteínas |
| TRIzol™ Reactivo | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | Aislamiento de ARN |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Se utiliza para diluir el colorante de detección Opal 620 |
| Circuito F universal | Vetamac | 40200 | Acoplado al vaporizador y accesorios del vaporizador |
| Microscopio vertical de fluorescencia compuesta | Olympus | BX61VS | Se utiliza para la obtención de imágenes FISH |
| Vectorshield con medios de montaje DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip |
| Sistema de PCR en tiempo real 7 con bloque de 384 pocillos | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | Esto es para la detección de bloques de 384 pocillos SYBR. TaqMan y/o bloques más pequeños disponibles |
| Wet n Wild Esmalte de uñas Wild Shine, Clear Nail Protector, Color de uñas | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased 343730_RX |
Referencias
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