En el sistema de cocultivo de los ganglios de la raíz dorsal y las células de Schwann, se puede estudiar la mielinización del sistema nervioso periférico. Este modelo proporciona oportunidades experimentales para observar y cuantificar la mielinización periférica y estudiar los efectos de compuestos de interés en la vaina de mielina.
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Artículo de método
Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de Schwann
En este artículo
Resumen
Resumen
El proceso de mielinización es esencial para permitir una transducción de señal rápida y suficiente en el sistema nervioso. En el sistema nervioso periférico, las neuronas y las células de Schwann participan en una interacción compleja para controlar la mielinización de los axones. Las alteraciones de esta interacción y la ruptura de la vaina de mielina son características de las neuropatías inflamatorias y ocurren secundariamente en trastornos neurodegenerativos. Aquí, presentamos un modelo de cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal y células de Schwann, que desarrolla una mielinización robusta de axones periféricos para investigar el proceso de mielinización en el sistema nervioso periférico, estudiar las interacciones axón-célula de Schwann y evaluar los efectos potenciales de los agentes terapéuticos en cada tipo de célula por separado. Metodológicamente, los ganglios de la raíz dorsal de ratas embrionarias (E13.5) fueron cosechados, disociados de su tejido circundante y cultivados como explantes enteros durante 3 días. Las células de Schwann se aislaron de ratas adultas de 3 semanas de edad, y los nervios ciáticos se digirieron enzimáticamente. Las células de Schwann resultantes se purificaron mediante clasificación celular activada magnéticamente y se cultivaron en condiciones enriquecidas con neuregulina y forskolina. Después de 3 días de cultivo de explante del ganglio de la raíz dorsal, se agregaron 30,000 células de Schwann a un explante del ganglio de la raíz dorsal en un medio que contenía ácido ascórbico. Los primeros signos de mielinización se detectaron en el día 10 de cocultivo, a través de señales dispersas para la proteína básica de mielina en la tinción inmunocitoquímica. A partir del día 14, se formaron vainas de mielina y se propagaron a lo largo de los axones. La mielinización se puede cuantificar mediante tinción de proteínas básicas de mielina como una relación entre el área de mielinización y el área del axón, para tener en cuenta las diferencias en la densidad axonal. Este modelo proporciona oportunidades experimentales para estudiar diversos aspectos de la mielinización periférica in vitro, lo cual es crucial para comprender la patología y las posibles oportunidades de tratamiento para la desmielinización y la neurodegeneración en enfermedades inflamatorias y neurodegenerativas del sistema nervioso periférico.
Introducción
En el sistema nervioso periférico (SNP), la transducción rápida de información está mediada por axones envueltos en mielina. La mielinización de los axones es esencial para permitir la rápida propagación de los impulsos eléctricos, ya que la velocidad de conducción de las fibras nerviosas se correlaciona con el diámetro del axón y el grosor de la mielina1. La señalización sensorial desde la periferia hasta el sistema nervioso central (SNC) se basa en la activación de neuronas sensoriales de primer orden que residen en agrandamientos de la raíz dorsal, denominados ganglios de la raíz dorsal (GRD). Para la formación y el mantenimiento de la mieli....
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Protocolo
Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. Cultivo celular de Schwann
- Recubrimiento para cultivo celular de Schwann
- Cubra las placas de cultivo celular en condiciones estériles. Aplicar 2 ml de poli-L-lisina (PLL) al 0,01% en dos placas de cultivo de tejidos (CT) de 60 mm cada una e incubar durante la noche a 4 °C.
- Retirar el PLL, lavar los platos TC 2x con agua destilada e incubar con 2 mL de laminina 1 μg/cm2 durante la noche a 4 °C. Lave los platos TC 2x con aqua....
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Resultados
La mielinización en el cocultivo se evaluó en los días 10, 12, 14, 16, 18 y 20. Los explantes de DRG y las células de Schwann se tiñeron para MBP, βIII-tubulina y DAPI. La red axonal en el cocultivo fue densa y no cambió visiblemente en el curso temporal de la observación. Los primeros signos de mielina, en forma de pequeños fragmentos, fueron detectables el día 10 y aumentaron el día 12 (Figura 2). Las áreas positivas para MBP aumentaron con el tiempo hasta el día 20 de cultura. La mieliniz.......
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Discusión
Aquí, presentamos un protocolo rápido y fácil para la generación de mielinización in vitro mediante la fusión de dos cultivos de tipo celular separados, células de Schwann y explantes ganglionares de la raíz dorsal.
Un paso crítico del protocolo es el cultivo de explantes DRG, especialmente en los primeros días de cultivo. Los DRG son muy frágiles antes de que se construya una red axonal fuerte y deben manejarse con mucho cuidado, por ejemplo, cuando se sacan de la incubadora o durant.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos al Prof. Dr. Ralf Gold y a la PD Dra. Gisa Ellrichmann por sus consejos y apoyo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anti-MBP, conejo | Novus Biologicals, Centannial, EE. UU. | ABIN446360 | |
| Anti-ß III-tubulina, ratón | Biolegend, San Diego, EE. UU | 657402 | |
| Ácido ascórbico | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania | A4403-100MG | |
| B27-suplemento | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania | 17504-044 | |
| Punta de filtro de biosfera, 100 y micro; L | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemania | ||
| Punta de filtro Biosphere, 1250 y micro; L | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemania | ||
| Punta de filtro Biosphere, 20 y micro; L | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemania | ||
| Punta de filtro Biosphere, 300 y micro; L | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemania | ||
| Albúmina sérica bovina | Carl Roth, Karlsruhe, Alemania | 8076.4 | |
| Colador de células, 100 y micro; M | BD Bioscience, Heidelberg, Alemania | 352360 | |
| Centrífuga 5810-R | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania | 5811000015 | |
| CO2 Incubadora Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Alemania | ||
| Cubreobjetos 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Alemania | P231.1 | |
| Pinzas finas curvadas | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemania | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Alemania | SBA-0100-20 | |
| Dispasa II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania | ||
| Agua destilada (sistema de purificación de agua) | Millipore, Molsheim, Francia | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania | ||
| DPBS (sin Ca2+ y sin Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania | D8537-6X500ML | |
| Etanol | VWR, Radnor, Estados Unidos | ||
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania | F7524 | FCS debe probarse para el cultivo de células de Schwann |
| Pinzas finas (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemania | 11252-20 | |
| Pinzas | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemania | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania | F6886-10MG | |
| Gelatina | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania | G1393-20ML | |
| Gentamicina | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania | 5710064 | |
| Cabra anti-ratón IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania | A11036 | |
| Cabra anti-conejo IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania | A11001 | |
| HBSS (sin Ca2+ y sin Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania | ||
| Incubadora HERAcell | Heraeus Instruments, Hanau, Alemania | ||
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania | ||
| Suero de caballo | Pan-Biotech, Aidenbach, Alemania | P30-0712 | |
| Imagen J Software | HIH, Bethesda, EE. UU. | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania | L2020-1MG | |
| Leibovitz&agudo; s L-15 Medio | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania | ||
| L-Glutamina 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania | ||
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemania | 15000-08 | |
| Microscopio | Motic, Wetzlar, Alemania | Motic BA 400 | |
| Microscopio Axio observador 7 | Zeiss, Oberkochen, Alemania | 491917-0001-000 | |
| Portaobjetos de microscopio | VWR, Radnor, EE. UU. | 630-1985 | |
| Separador MiniMACS | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania | 130091632 | |
| Columnas MS | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-042-201 | |
| Cámara de recuento Neubauer | Asistente, Erlangen, Alemania | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, EE. UU | 100-03 | |
| Medio neurobasal | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania | ||
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania | N1408 | |
| Suero de cabra normal | Biozol, Eching, Alemania | S-1000 | |
| Nunclon & Delta; multiplatos, 4 pocillos | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania | D6789 | |
| Paraformaldehído | Acros Organics, Nueva Jersey, EE. UU. | ||
| Penicilina/estreptomicina | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania | 4430000018 | |
| Pipetas | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania | P4707-50ML | |
| Tubos de reacción, 15 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemania | ||
| Tubos de reacción, 50 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemania | ||
| Recipientes de reacción, 1,5 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemania | ||
| armario de seguridad S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania | ||
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemania | 14083-08 | |
| Pipeta serológica, 10 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemania | ||
| Pipeta serológica, 25 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemania | ||
| Pipeta serológica, 5 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemania | ||
| Espátula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemania | 10094-13 | |
| Descubrimiento de microscopio estereoscópico.V8 | Zeiss, Oberkochen, Alemania | 495015-0012-000 | |
| Tijeras quirúrgicas | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemania | 14007-14 | |
| TC dish 100, célula + | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemania | ||
| Plato TC 35, celda + | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemania | ||
| Plato TC 60, celda + | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemania | ||
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania | X100-500ML | |
| Solución de Azul de Tripán 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania | ||
| tripsina (2,5%), rojo sin fenol | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania | 15090-046 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania | 25300-054 | |
| Colagenasa tipo I | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania | C1639 | |
| Baño de agua tipo 1008 | GFL, Burgwedel, Alemania | 4285 |
Referencias
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C.
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Reimpresiones y permisos
