Este es un protocolo sencillo de un ensayo de vaina de hoja de cebada que utiliza reactivos mínimos y equipo de laboratorio común (incluido un teléfono inteligente básico). El propósito es visualizar el proceso de infección temprana de la enfermedad blástica en laboratorios sin acceso a equipos avanzados de microscopía.
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Artículo de método
Visualización de los sitios de infección temprana de la enfermedad por explosión de arroz (Magnaporthe oryzae) en cebada (Hordeum vulgare) usando un microscopio básico y un teléfono inteligente
En este artículo
Resumen
Resumen
Comprender cómo interactúan las plantas y los patógenos, y si esa interacción culmina en defensa o enfermedad, es necesario para desarrollar estrategias más sólidas y sostenibles para la salud de las plantas. Los avances en los métodos que obtienen imágenes más efectivas de muestras de patógenos de plantas durante la infección y la colonización han producido herramientas como el ensayo de la vaina de la hoja de arroz, que ha sido útil para monitorear la infección y los eventos de colonización temprana entre el arroz y el patógeno fúngico, Magnaporthe oryzae. Este patógeno hemi-biotrófico causa una pérdida grave de enfermedades en el arroz y las monocotiledóneas relacionadas, incluyendo el mijo, el centeno, la cebada y, más recientemente, el trigo. El ensayo de la vaina de la hoja, cuando se realiza correctamente, produce una sección de planta ópticamente clara, de varias capas de espesor, que permite a los investigadores realizar imágenes de células vivas durante el ataque de patógenos o generar muestras fijas teñidas para características específicas. Las investigaciones celulares detalladas sobre la interacción cebada-M. oryzae se han quedado atrás de las del huésped del arroz, a pesar de la creciente importancia de este grano como fuente de alimento para animales y humanos y como bebidas fermentadas. Aquí se informa el desarrollo de un ensayo de vaina de hoja de cebada para estudios intrincados de las interacciones de M. oryzae durante las primeras 48 h después de la inoculación. El ensayo de la vaina de la hoja, independientemente de la especie que se esté estudiando, es delicado; Se proporciona un protocolo que cubre todo, desde las condiciones de crecimiento de la cebada y la obtención de una vaina foliar, hasta la inoculación, incubación e imágenes del patógeno en las hojas de las plantas. Este protocolo se puede optimizar para la detección de alto rendimiento utilizando algo tan simple como un teléfono inteligente para fines de imagen.
Introducción
Magnaporthe oryzae, el hongo de la explosión del arroz, infecta una variedad de cultivos de granos, incluyendo cebada, trigo y arroz1. Este patógeno causa enfermedades devastadoras y representa una amenaza mundial para estos valiosos cultivos, causando la pérdida completa de cultivos si no se controla. Muchos laboratorios de todo el mundo se centran en la enfermedad por la explosión del arroz debido a su amenaza global y sus atributos como un excelente modelo para las interacciones planta-hongos2. Ha sido completamente secuenciado, y la genética de su ciclo infeccioso, particularmente los eventos tempranos, se h....
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Protocolo
1. Preparación de materiales experimentales
- Prepare agar de avena (OMA) mezclando harina de avena hasta que sea un polvo fino. Añadir 25 g de avena en polvo y 15 g de agar a 500 ml deddH2O, y el autoclave en el ciclo del medio (alternativamente llevar a ebullición durante 20 min). Vierta el medio en placas de Petri estériles de 60 mm.
NOTA: Otros tipos de medios que inducen esporulación, como el agar V8, son aceptables para este protocolo. - La placa M. oryzae filtra las existencias directamente sobre las placas OMA utilizando pinzas estériles y les permite cubrir toda la placa (9-12 días). Colocar las placas e....
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Resultados
En la figura 1 se muestra una representación del flujo de trabajo inicial para esta técnica. Las vainas se cosecharon de plantas de cebada susceptibles "Lacey" de 14 días de edad (H. vulgare). Los conidios se cosecharon de placas esporuladas de M. oryzae OMA de 10 días de edad, con una suspensión conidial preparada utilizando ddH2O estéril para una concentración final de 5 x 104 esporas por mL. La suspensión del inóculo se aplicó directamente a las vai.......
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Discusión
Hay muchos ensayos comúnmente utilizados disponibles para probar cepas de M. oryzae que proporcionan una visión a nivel macroscópico de una respuesta de infección compatible o incompatible, como las inoculaciones en aerosol o gotitas, y el uso de sistemas de clasificación para cuantificar el tamaño de las lesiones13,14. Otro ensayo común para M. oryzae es probar la capacidad del patógeno para formar su estructura de penetración especializada, el.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocen la financiación del premio USDA-NIFA 2016-67013-24816.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido acético | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Teléfono celular | Pixel 4A | Cualquier teléfono inteligente con una cámara trasera que se pueda montar en un soporte será suficiente. | |
| Adaptador de microscopio para teléfono móvil | Vankey B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63& sr=8-2 -spons& psc = 1 y spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscopio | AmScope | FM690TC | 40x– 2500x Microscopio de epifluorescencia vertical trinocular |
| Avena copos de avena a la antigua Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 & hvadid=312253390021& hvpos= & hvnetw=g& hvrand=98212627704 6839544& hvpone=& hvptwo=& hvq mt=& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint =& hvlocphy=9007494& hvtargid =pla-568492637928& psc=1 | |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Cubreobjetos rectangulares | Corning | CLS2975245 | |
| Portaobjetos, microscopio | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Micrómetro de etapa | OMAX | A36CALM7 | 0,1 mm y 0,01 mm Portaobjetos de calibración para microscopio |
| Trypan azul | Sigma-Aldrich | T6146 |
Referencias
- Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
- Dean, R., et al. The Top 10 fun....
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Reimpresiones y permisos
