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Summary

Este es un protocolo sencillo de un ensayo de vaina de hoja de cebada que utiliza reactivos mínimos y equipo de laboratorio común (incluido un teléfono inteligente básico). El propósito es visualizar el proceso de infección temprana de la enfermedad blástica en laboratorios sin acceso a equipos avanzados de microscopía.

Abstract

Comprender cómo interactúan las plantas y los patógenos, y si esa interacción culmina en defensa o enfermedad, es necesario para desarrollar estrategias más sólidas y sostenibles para la salud de las plantas. Los avances en los métodos que obtienen imágenes más efectivas de muestras de patógenos de plantas durante la infección y la colonización han producido herramientas como el ensayo de la vaina de la hoja de arroz, que ha sido útil para monitorear la infección y los eventos de colonización temprana entre el arroz y el patógeno fúngico, Magnaporthe oryzae. Este patógeno hemi-biotrófico causa una pérdida grave de enfermedades en el arroz y las monocotiledóneas relacionadas, incluyendo el mijo, el centeno, la cebada y, más recientemente, el trigo. El ensayo de la vaina de la hoja, cuando se realiza correctamente, produce una sección de planta ópticamente clara, de varias capas de espesor, que permite a los investigadores realizar imágenes de células vivas durante el ataque de patógenos o generar muestras fijas teñidas para características específicas. Las investigaciones celulares detalladas sobre la interacción cebada-M. oryzae se han quedado atrás de las del huésped del arroz, a pesar de la creciente importancia de este grano como fuente de alimento para animales y humanos y como bebidas fermentadas. Aquí se informa el desarrollo de un ensayo de vaina de hoja de cebada para estudios intrincados de las interacciones de M. oryzae durante las primeras 48 h después de la inoculación. El ensayo de la vaina de la hoja, independientemente de la especie que se esté estudiando, es delicado; Se proporciona un protocolo que cubre todo, desde las condiciones de crecimiento de la cebada y la obtención de una vaina foliar, hasta la inoculación, incubación e imágenes del patógeno en las hojas de las plantas. Este protocolo se puede optimizar para la detección de alto rendimiento utilizando algo tan simple como un teléfono inteligente para fines de imagen.

Introduction

Magnaporthe oryzae, el hongo de la explosión del arroz, infecta una variedad de cultivos de granos, incluyendo cebada, trigo y arroz¹. Este patógeno causa enfermedades devastadoras y representa una amenaza mundial para estos valiosos cultivos, causando la pérdida completa de cultivos si no se controla. Muchos laboratorios de todo el mundo se centran en la enfermedad por la explosión del arroz debido a su amenaza global y sus atributos como un excelente modelo para las interacciones planta-hongos². Ha sido completamente secuenciado, y la genética de su ciclo infeccioso, particularmente los eventos tempranos, se han establecido ^3,4. El ciclo de vida comienza con una espora que germina en la superficie de una hoja, formando la estructura de penetración especializada llamada appressorium. El appressorium penetra en el tejido foliar y la infección continúa con el desarrollo de lesiones que inician el proceso de esporulación y diseminan la enfermedad⁴. La prevención de cualquiera de estos eventos tempranos inhibiría drásticamente esta enfermedad devastadora. En consecuencia, la mayoría de las investigaciones actuales sobre la enfermedad blástica se han centrado en los pasos tempranos de la infección, desde los conidios germinados que forman un appressorium hasta el desarrollo de las hifas invasivas y el complejo interfacial biotrófico (BIC)⁵.

La gran cantidad de investigación sobre la enfermedad blástica se ha llevado a cabo en el arroz, a pesar de que M. oryzae es un patógeno importante para una variedad de cultivos, y las cepas recién evolucionadas están emergiendo como una amenaza global para el trigo⁶. Si bien el arroz es uno de los tres principales cultivos básicos utilizados para alimentar a la población, junto con el trigo y el maíz, la cebada es el cuarto grano de cereal en términos de alimentación para el ganado y producción de cerveza⁷. A medida que la industria de la cerveza artesanal crece, también lo hace el valor económico de la cebada. Existen claras ventajas de utilizar M. oryzae y cebada como patosistema para estudiar la enfermedad blástica. Primero, hay cepas de M. oryzae que infectan solo cebada, así como cepas que pueden infectar múltiples especies de pasto. Por ejemplo, 4091-5-8 infecta principalmente solo cebada, mientras que Guy11 y 70-15 pueden infectar tanto a la cebada como al arroz⁸. Estas cepas son genéticamente similares, y el proceso de infección es comparable⁹. En segundo lugar, en condiciones estándar de laboratorio e invernadero, la cebada es más fácil de cultivar, ya que no tiene los complicados requisitos del arroz (control conciso de la temperatura, alta humedad, espectros de luz específicos). También hay desafíos de imagen con el arroz debido a la hidrofobicidad de la superficie de la hoja, que la cebada no exhibe¹⁰.

Este protocolo presenta un método simple para aislar y utilizar eficazmente las vainas de hojas de cebada para el análisis microscópico de múltiples etapas de infección, utilizando suministros de laboratorio comunes y un teléfono inteligente para la recopilación de datos. Este método para el ensayo de vaina de hoja de cebada es adaptable para laboratorios de todo el mundo, ya que requiere suministros mínimos y, sin embargo, proporciona una imagen clara de la interacción microscópica entre el patógeno y las primeras células que infecta. Mientras que los ensayos de patogenicidad, como un aerosol o la inoculación de gotitas, pueden proporcionar una visión macro de la capacidad del patógeno para formar lesiones, este ensayo permite al investigador visualizar pasos específicos de infección temprana, desde eventos previos a la penetración hasta la colonización de células epidérmicas. Además, los investigadores pueden comparar fácilmente la infección con el hongo de tipo salvaje con la infección con un mutante reducido en virulencia.

Protocol

1. Preparación de materiales experimentales Prepare agar de avena (OMA) mezclando harina de avena hasta que sea un polvo fino. Añadir 25 g de avena en polvo y 15 g de agar a 500 ml deddH2O, y el autoclave en el ciclo del medio (alternativamente llevar a ebullición durante 20 min). Vierta el medio en placas de Petri estériles de 60 mm.NOTA: Otros tipos de medios que inducen esporulación, como el agar V8, son aceptables para este protocolo. La placa M. oryzae filtra las existencias directamente sobre las placas OMA utilizando pinzas estériles y les permite cubrir toda la placa (9-12 días). Colocar las placas en una incubadora de crecimiento a 25 °C con ciclos día:noche de 12:12 h para ayudar a inducir la esporulación.NOTA: Algunos mutantes crecen más lentamente y requieren cuidados adicionales (por ejemplo, medios completos primero, luego una transferencia al OMA), y podrían tomar una semana adicional para producir suficientes conidios. Plante directamente semillas de cebada (Hordeum vulgare Lacey) en un medio de crecimiento húmedo (por ejemplo, medios para macetas sin suelo) con 10-15 semillas por maceta de 6 pulgadas. Coloque las macetas en bandejas con 1-2 pulgadas de agua. Ajuste las condiciones de la cámara de cultivo de cebada como 22 °C durante 12 h (luz del día) y 19 °C durante 12 h (oscura) al 60% de humedad relativa. Continúe regando desde el fondo para no molestar las semillas. Cultivar la cebada hasta la segunda etapa de hoja, aproximadamente durante 14 días. Usando tijeras estériles, corte la planta de cebada justo por encima de la línea del suelo. Usando fórceps y una navaja de afeitar / bisturí, corte cuidadosamente la vaina de la hoja de la primera hoja que está abierta longitudinalmente, y usando las pinzas, retírela de la base de la segunda hoja.NOTA: Limpie las herramientas (fórceps, bisturí, etc.) antes de usarlas con etanol al 75% -80%. La vaina es la capa delgada de la epidermis que proporciona la unión de la primera a la segunda hoja (segunda a tercera hoja, etc.; ver Figura 1). Coloque la primera hoja plana en una placa de Petri estéril de 60 mm, que contenga una toalla de papel húmeda para mantener la humedad dentro de la placa. Usando el bisturí, corte la mayor parte de la primera hoja lejos de la vaina, dejando solo 0.5 pulgadas del tejido de la hoja para el montaje. Pegue el tejido de la hoja en la parte inferior de la placa de Petri.NOTA: La vaina se riza, pero esto es aceptable ya que una vaina rizada sostiene la gota conidial más fácilmente. Recoja las placas de M. oryzae de 9 a 12 días de edad y agregue 0.5-2 ml de agua estéril a las placas. Usando un bucle de inoculación estéril, raspe suavemente el micelio para liberar los conidios adjuntos. Pipetear cuidadosamente la suspensión conidial en un tubo de microcentrífuga que contenga un pequeño trozo de gasa para filtrar cualquier trozo grande de micelio de la suspensión conidial.NOTA: Las esporas se pueden recolectar tan pronto como 7 días, si el crecimiento y la esporulación son suficientes para alcanzar la concentración de esporas deseada. La recolección puede retrasarse no más de 14 días si se trabaja con un mutante genético de crecimiento lento La concentración de esporas deseada es de 5 x 10 4 esporas por ml, pero un rango (1 x 10 4-1 x 10 5) es aceptable. Una concentración demasiado alta hace que las imágenes de los sitios de infección individuales sean un desafío; Diluir la concentración de esporas con agua estéril si es necesario. Pipetear cuidadosamente la suspensión conidial dentro de la vaina de la hoja enrollada. Comience con 25 μL (el tamaño de la gota se puede aumentar dependiendo del tamaño de la vaina, hasta 50 μL).NOTA: Se recomienda realizar de tres a cinco réplicas de cada cepa mutante o línea de cebada. Es común que se produzcan daños durante el proceso de tinción, por lo tanto, se recomiendan réplicas adicionales de la funda. Llene cuatro o cinco vasos de precipitados de 500 ml conddH2O, y caliente hasta que cocine al vapor (usando un microondas o placa eléctrica). Tenga cuidado al mover los vasos de agua caliente. Sostenga la tapa de la placa de Petri sobre uno de los vasos humeantes para atrapar la humedad dentro del plato. Apile las placas de la vaina de la hoja infectada y rodéelas con los vasos calientes restantes. Esto crea un ambiente húmedo y húmedo, necesario para que las esporas germinen.NOTA: Tenga cuidado al cocer al vapor las tapas para asegurarse de que no haya agua caliente o vapor que toque las fundas. Proteja las vainas de las hojas de la luz, cúbralas con una caja de goma o plástico de color sólido (preferiblemente negro) y déjelas reposar durante 48 h o el punto de tiempo deseado para la obtención de imágenes.NOTA: Una caja de cartón no es adecuada porque no bloquea la humedad y absorbe el vapor de los vasos de agua caliente. Una tina de plástico con cerradura funciona bien para contener la humedad, y se puede cubrir con tela negra o un recipiente oscuro más grande para bloquear la luz. 2. Proceso de tinción Prepare la mancha de la siguiente manera: prepare una dilución fresca de ácido acético al 45% y agregue azul de tripano al 0,1% v / v. Alícuota 1 ml de la solución colorante en tubos de microcentrífuga. Ajuste un bloque de calor o baño de agua a 40 °C. Con cuidado, con una navaja de afeitar o bisturí, corte la vaina de la hoja lejos de la cinta. Con fórceps, coloque la vaina en el tubo de microcentrífuga y asegúrese de que esté completamente sumergida en la solución de tinte. Deje 2 h para que el tinte penetre en la hoja. Calentar las muestras a 40 °C durante el tiempo del proceso de tinción en un bloque de calor o baño de agua para aumentar la penetración del tinte.NOTA: Las vainas intentan flotar en el tubo de microcentrífuga; Para evitar bolsas de tejido foliar sin teñir, llene los tubos, sumerja las vainas y cierre el tubo. No coloque varias fundas en el mismo tubo de microcentrífuga. Enjuague las vainas de las hojas cuidadosamente con glicerol al 60% para eliminar el tinte adicional. Tres enjuagues (cada uno en glicerol fresco) son generalmente suficientes. Mantenga la vaina en glicerol hasta que esté lista para montarla en portaobjetos. 3. Proceso de montaje e imagen Coloque la funda en un portaobjetos de vidrio limpio y agregue unas gotas de glicerol al 60%. Usando un microscopio de disección y dos pares de fórceps, desenrolle cuidadosamente la vaina, dejando el centro inoculado hacia arriba. Mantenga la vaina abierta con los fórceps y coloque el cubreobjetos en la parte superior para evitar que la vaina se enrosque y bloquee el sitio de infección.NOTA: La vaina de la hoja es muy frágil, y estos pasos deben hacerse con cuidado para evitar daños a la vaina. Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas para el almacenamiento a largo plazo, o cinta adhesiva para el almacenamiento a corto plazo. Observe las diapositivas bajo un microscopio de luz compuesta. Tome imágenes básicas usando un microscopio y un teléfono celular. Aquí, las imágenes fueron tomadas con un soporte adaptador de teléfono celular y un teléfono inteligente. Para dispositivos Android, ajuste la aplicación de la cámara a los siguientes ajustes: flashear, desactivar Top Shot, desactivar el ajuste automático de brillo y sombras, y establecer la resolución de la foto en completa.NOTA: El uso de la aplicación de la cámara en el teléfono disminuye la duración de la batería más rápido de lo habitual, por lo que se recomienda tener alimentación externa. Una vez que el teléfono celular esté montado en el microscopio, tome una imagen de un micrómetro a escala con el objetivo que se utilizará para adquirir los datos. Los datos en este estudio se adquirieron en un objetivo de aire de 40x 0.65 NA, y el adaptador de teléfono se montó en un ocular 10x. Ajuste el zoom del teléfono a 2.5x y manténgalo consistente para mantener un tamaño de píxel constante. El centro de la vaina alberga la mayor concentración de esporas y appressoria infectante; Por lo tanto, apunte a 9-12 imágenes de cada vaina para obtener números significativos para el análisis estadístico. El número de esporas y appressorias varía según la concentración de esporas aplicadas. 4. Evaluación y conteo de imágenes usando ImageJ (FIJI) Transfiera las imágenes a un equipo que ejecute ImageJ (FIJI). Para abrir las imágenes, arrastre y suelte los archivos en la barra ImageJ. Establezca la escala de las imágenes cargando la imagen micrométrica del escenario y dibujando una línea recta entre dos marcas para la escala. Abra Establecer escala, escriba la Distancia conocida para la línea medida y escriba la unidad para la escala. En el micrómetro, en este ejemplo, la línea más pequeña era de 10 μm. Marque la casilla Establecer global y presione OK. Todas las imágenes posteriores cargadas tendrán la misma escala. Para contar appressoria, esporas u otros objetos, seleccione la herramienta Punto . A continuación, abra el Administrador de ROI. Haga clic en la tecla T del teclado para agregar puntos a la lista. Estas regiones de interés se pueden guardar si es necesario y volver a cargar en la misma imagen. Dependiendo de los objetivos experimentales, realice mediciones adicionales, como la longitud de la espora, el tamaño de la appressoria y la longitud del tubo germinal.

Representative Results

En la figura 1 se muestra una representación del flujo de trabajo inicial para esta técnica. Las vainas se cosecharon de plantas de cebada susceptibles “Lacey” de 14 días de edad (H. vulgare). Los conidios se cosecharon de placas esporuladas de M. oryzae OMA de 10 días de edad, con una suspensión conidial preparada utilizando ddH2O estéril para una concentración final de 5 x 104 esporas por mL. La suspensión del inóculo se aplicó directamente…

Discussion

Hay muchos ensayos comúnmente utilizados disponibles para probar cepas de M. oryzae que proporcionan una visión a nivel macroscópico de una respuesta de infección compatible o incompatible, como las inoculaciones en aerosol o gotitas, y el uso de sistemas de clasificación para cuantificar el tamaño de las lesiones^13,14. Otro ensayo común para M. oryzae es probar la capacidad del patógeno para formar su estructura de penetración especial…

Materials

Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Cell phone	Google	Pixel 4A	Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice.
Cell phone Microscope adapter	Vankey	B01788LT3S	https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microscope	AmScope	FM690TC	40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope
Oatmeal old fashioned rolled oats	Quaker	N/A	https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1
ProMix BX	ProMix	1038500RG
Rectangular coverglass	Corning	CLS2975245
Slides, microscope	Sigma-Aldrich	S8902
Stage micrometer	OMAX	A36CALM7	0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T6146