Análisis de expresión génica en folículos humanos

Summary

Aquí, describimos un protocolo que describe cómo aislar los folículos ováricos humanos del tejido cortical congelado-descongelado para realizar análisis de expresión génica.

Abstract

El ovario es un órgano heterogéneo compuesto por diferentes tipos de células. Para estudiar los mecanismos moleculares que ocurren durante la foliculogénesis, la localización de proteínas y la expresión génica se pueden realizar en tejido fijo. Sin embargo, para evaluar adecuadamente los niveles de expresión génica en un folículo humano, esta estructura compleja y delicada debe aislarse. Por lo tanto, se ha desarrollado un protocolo adaptado previamente descrito por el laboratorio de Woodruff para separar los folículos (el ovocito y las células de la granulosa) de su entorno circundante. El tejido cortical ovárico se procesa primero manualmente para obtener pequeños fragmentos utilizando dos herramientas: una cortadora de tejidos y una cortadora de tejidos. Luego, el tejido se digiere enzimáticamente con 0,2% de colagenasa y 0,02% de DNasa durante al menos 40 minutos. Esta etapa de digestión se realiza a 37 °C y 5% de_CO2 y se acompaña de pipeteo mecánico del medio cada 10 min. Después de la incubación, los folículos aislados se recogen manualmente utilizando una pipeta microcapilar calibrada bajo aumento al microscopio. Si los folículos todavía están presentes en las piezas de tejido, el procedimiento se completa con microdisección manual. Los folículos se recogen en hielo en un medio de cultivo y se enjuagan dos veces en gotitas de solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de digestión debe controlarse cuidadosamente para evitar el deterioro del folículo. Tan pronto como la estructura de los folículos parece estar comprometida o después de un máximo de 90 minutos, la reacción se detiene con una solución bloqueadora de 4 °C que contiene un 10% de suero bovino fetal. Se debe recolectar un mínimo de 20 folículos aislados (con un tamaño inferior a 75 μm) para obtener una cantidad adecuada de ARN total después de la extracción de ARN para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Después de la extracción, la cuantificación del ARN total de 20 folículos alcanza un valor medio de 5 ng / μL. El ARN total se transcribe en ADNc, y los genes de interés se analizan más a fondo utilizando RT-qPCR.

Introduction

El ovario es un órgano complejo compuesto de unidades funcionales y estructurales, incluidos los folículos dentro de la corteza y el estroma. La foliculogénesis, el proceso de activación, crecimiento y maduración del folículo desde un estado quiescente primordial hasta un folículo maduro capaz de ser fertilizado y apoyar el desarrollo embrionario temprano, se estudia ampliamente en la investigación¹. Desentrañar los mecanismos que impulsan este fenómeno podría mejorar la atención de la fertilidad para las mujeres². Los análisis en tejido humano fijo permiten evaluar la expresión proteica y la localización génica dentro d....

Protocol

Este proyecto fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Erasme (Bruselas, Bélgica). La paciente incluida en este protocolo se sometió a criopreservación de tejido ovárico (OTC) para la preservación de la fertilidad antes de la exposición a la quimioterapia en 2000. La paciente firmó un consentimiento informado por escrito para donar su tejido congelado residual a la investigación al final del período de almacenamiento.

1. Descongelación del tejido ovárico criopreservado

1. Prepare una placa de 6 pocillos que contenga cinco soluciones de descongelación. El primer pocillo contiene 5 ml de solución crioprotectora....

Results

Usando este procedimiento de aislamiento, el experimentador puede recuperar folículos del entorno estromal para realizar análisis específicos de expresión génica. Según el tamaño y la morfología de los folículos, es posible diferenciar las diferentes etapas de la foliculogénesis. El experimentador puede seleccionar folículos de interés según su tamaño utilizando una pipeta microcapilar adaptada. Mediante el uso de un microcapilar de máximo 75 μm, es posible discriminar folículos primordiales y primarios de folículos secu.......

Discussion

La criopreservación del tejido ovárico es un enfoque prometedor para preservar la fertilidad de los pacientes con cáncer. En la clínica, el tejido cortical descongelado es injertado de nuevo en la paciente después de la remisión, permitiendo la reanudación de la función ovárica y la fertilidad^19,20. Además del uso clínico, los fragmentos ováricos residuales también pueden ser donados para la investigación al final del período de almacenamiento para estudiar los m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placa de Petri cuadriculada de 2 mm	Corning	430196
2100 Instrumento bioanalizador	Agilent	G2939BA
2100 Software experto	Agilent	versión B.02.08.SI648
Placa de 4 pocillos	Sigma Aldrich	D6789
Placa de 6 pocillos	Carl Roth	EKX5.1
Agilent ARN total 6000 pico kit	Agilent	5067-1513
Ácido ascórbico	Sigma Aldrich	A4403
Conjuntos de tubos de aspiración para pipetas microcapilares	Sigma Aldrich	A5177
Centrífuga	Eppendorf	5424R
Colagenasa IV LifeTechnologies		17104-019
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
DNase	Sigma Aldrich	D4527-10kU
FBS	Gibco	10270-106
GoScript transcriptasa inversa	Promega	A5003
HSA	CAF DCF	LC4403-41-080
Leibovitz-15	LifeTechnologies	11415-049
L-Glutamina	Sigma Aldrich	G7513
McCoy' s 5A + bicarbonato + Hepes	LifeTechnologies	12330-031
Picadora de tejidos McIlwain	Stoelting	51350
Microcapilar RI EZ-Tips 200 µ m	CooperSurgical	7-72-2200/1
Microcapilar RI EZ-Tips 75 µ m	CooperSurgical	7-72-2075/1
NanoDrop 2000/2000c software operativo	ThermoFisher	versión 1.6
espectrofotómetro NanoDrop	ThermoFisher	2000/2000c
Penicilina G	Sigma Aldrich	P3032
PowerTrack SYBR mezcla maestra verde	ThermoFisher	A46109
Imprimaciones: GDF9			F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
Cartillas: HPRT			F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA
Imprimaciones: Kit Ligand			F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
Real-Time qPCR Quantstudio 3	ThermoFisher	A33779
Kit de aislamiento de ARN micro total acuoso	ThermoFisher	AM1931
Selenio	Sigma Aldrich	S9133
Piruvato de sodio	Sigma Aldrich	S8636
Microscopio estereoscópico	Nikon	SMZ800
Sulfato de estreptomicina	Sigma Aldrich	S1277
Sacarosa	Sigma Aldrich	S1888
Thermo Scientific Forma Series II  CO2  incubadoras	ThermoFisher	3110
Thomas Stadie-Riggs cortadora de tejidos	Thomas Scientific	6727C10
Transferrin	Roche