Artículo de método

Prueba de la eficiencia in vitro e in vivo de nanopartículas lipídicas de ARNm formuladas mediante mezcla microfluídica

DOI:

10.3791/64810

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20 de enero de 2023

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1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

En este artículo

Resumen

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Aquí, se presenta un protocolo para la formulación de nanopartículas lipídicas (LNPs) que encapsulan el ARNm que codifica la luciferasa de luciérnaga. La potencia de estos LNP se probó in vitro en células HepG2 e in vivo en ratones C57BL/6.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las nanopartículas lipídicas (LNP, por sus siglas en inglés) han atraído una amplia atención recientemente con el exitoso desarrollo de las vacunas de ARNm contra la COVID-19 por parte de Moderna y Pfizer/BioNTech. Estas vacunas han demostrado la eficacia de las terapias de ARNm-LNP y han abierto la puerta a futuras aplicaciones clínicas. En los sistemas ARNm-LNP, los LNP sirven como plataformas de administración que protegen la carga de ARNm de la degradación por nucleasas y median su entrega intracelular. Los LNP suelen estar compuestos por cuatro componentes: un lípido ionizable, un fosfolípido, colesterol y un conjugado de polietilenglicol (PEG) anclado a lípidos (lípido-PEG). En este caso, los LNP que encapsulan el ARNm que codifica la luciferasa de luciérnaga se formulan mediante la mezcla microfluídica de la fase orgánica que contiene los componentes lipídicos de LNP y la fase acuosa que contiene el ARNm. A continuación, estos ARNm-LNP se prueban in vitro para evaluar su eficacia de transfección en células HepG2 mediante un ensayo bioluminiscente basado en placas. Además, los ARNm-LNP se evalúan in vivo en ratones C57BL/6 después de una inyección intravenosa a través de la vena lateral de la cola. Las imágenes de bioluminiscencia de cuerpo entero se realizan mediante el uso de un sistema de imágenes in vivo . Se muestran resultados representativos de las características de ARNm-LNP, su eficiencia de transfección en células HepG2 y el flujo luminiscente total en ratones C57BL/6.

Introducción

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Las nanopartículas lipídicas (LNP) han demostrado ser muy prometedoras en los últimos años en el campo de la terapia génica no viral. En 2018, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) aprobó la primera terapia de ARN de interferencia (ARNi), Onpattro de Alnylam, para el tratamiento de la amiloidosis hereditaria por transtiretina 1,2,3,4. Este fue un importante paso adelante para las nanopartículas lipídicas y las terapias basadas en ARN. Más recientemente, Moderna y Pfizer/BioNTech recibieron la aprobación de la FDA para sus vacunas de ARNm-LNP contra el SARS-CoV-2 4,5. En cada una de estas terapias de ácidos nucleicos basadas en LNP, la LNP sirve para proteger su carga de la degradación por las nucleasas y facilitar una potente administración intracelular 6,7. Si bien las LNP han tenido éxito en las terapias de ARNi y en las aplicaciones de vacunas, también se han explorado las LNP de ARNm para su uso en terapias de reemplazo de proteínas8, así como para la administración conjunta de ARNm Cas9 y ARN guía para la administración del sistema CRISPR-Cas9 para la edición de genes9. Sin embargo, no existe una formulación específica que sea adecuada para todas las aplicaciones, y los cambios sutiles en los parámetros de formulación de LNP pueden afectar en gran medida la potencia y la biodistribución in vivo 8,10,11. Por lo tanto, se deben desarrollar y evaluar ARNm individuales para determinar la formulación óptima para cada terapia basada en LNP.

Los LNP se formulan comúnmente con cuatro componentes lipídicos: un lípido ionizable, un fosfolípido, colesterol y un conjugado de polietilenglicol (PEG) anclado a lípidos (lípido-PEG)11,12,13. La potente administración intracelular facilitada por las LNP depende, en parte, del componente lipídico ionizable12. Este componente es neutro a pH fisiológico, pero se carga positivamente en el ambiente ácido del endosoma11. Se cree que este cambio en la carga iónica es un factor clave que contribuye al escape endosomal12,14,15. Además del lípido ionizable, el componente fosfolípido (lípido auxiliar) mejora la encapsulación de la carga y ayuda en el escape endosomal, el colesterol ofrece estabilidad y mejora la fusión de la membrana, y el lípido-PEG minimiza la agregación y opsonización de LNP en circulación10,11,14,16. Para formular el LNP, estos componentes lipídicos se combinan en una fase orgánica, típicamente etanol, y se mezclan con una fase acuosa que contiene la carga de ácido nucleico. El proceso de formulación de LNP es muy versátil, ya que permite sustituir y combinar fácilmente diferentes componentes en diferentes proporciones molares para formular muchas formulaciones de LNP con multitud de propiedades fisicoquímicas10,17. Sin embargo, al explorar esta gran variedad de LNP, es crucial que cada formulación se evalúe utilizando un procedimiento estandarizado para medir con precisión las diferencias en la caracterización y el rendimiento.

Aquí, se describe el flujo de trabajo completo para la formulación de ARNm-LNP y la evaluación de su rendimiento en células y animales.

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Protocolo

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NOTA: Mantenga siempre las condiciones libres de ARNasa cuando formule ARNm-LNP limpiando las superficies y el equipo con un descontaminante de superficie para ARNasas y ADN. Utilice únicamente puntas y reactivos sin RNasa.

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Pensilvania y un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Pensilvania.

1. Preparación previa a la formulación

  1. Llene un vaso de precipitados limpio de 4 L con 200-300 ml de solución salina fresca tamponada con fosfato (PBS) 10x.
    1. Diluir el 10x PBS en el vaso de precipitados 10 veces con agua ultrapura para obtener un vaso de precipitados de 1x PBS. Asegúrese de que el volumen final del 1x PBS esté entre 2-3 L.
    2. Coloque los casetes de diálisis (punto de corte de peso molecular de 20 kDa [MWCO]) de la capacidad adecuada para la formulación de LNP en el vaso de precipitados lleno para hidratarlos.
      NOTA: Los casetes de diálisis requieren un mínimo de 2 minutos para hidratarse antes de su uso.
    3. Coloque una barra para revolver en el vaso de precipitados y cúbralo con papel de aluminio.
    4. Coloque el vaso de precipitados cubierto sobre una placa magnética para agitar. Encienda la placa de agitación y configúrela para que gire a 300-400 rpm.
  2. Diluir 100 mM de tampón de ácido cítrico (pH 3) 10 veces con agua ultrapura para crear el tampón de ácido cítrico de 10 mM utilizado para la dilución del ARNm.
  3. Prepare soluciones madre de lípidos ionizables C12-200, lípidos auxiliares, colesterol y PEG anclados a lípidos (lipid-PEG) disolviendo cada lípido en etanol al 100 %. Las concentraciones de los componentes lipídicos se detallan en la Tabla 1.
    1. Calentar y mezclar las soluciones madre a 37 °C para asegurarse de que se disuelven por completo.

2. Preparación de las mezclas de lípidos y ácidos nucleicos

  1. Calcule los volúmenes requeridos de lípidos ionizables, lípidos auxiliares, colesterol y lípidos-PEG en función de la relación molar deseada y la relación entre el peso de lípidos ionizables y ARNm (Tabla 1). Prepare un 10% de volumen adicional de la fase orgánica para tener en cuenta el volumen muerto en las jeringas durante la formulación.
    1. Combinar los volúmenes calculados de los diferentes componentes lipídicos en un tubo cónico.
    2. Diluir los lípidos con etanol al 100% hasta un volumen final, V, que representa el 25% del volumen final de LNP.
  2. Calcule la cantidad de ARNm necesaria para la formulación en función de la relación entre el peso de los lípidos ionizables y el ARNm y el volumen total de ARNm-LNP necesario (Tabla 1).
    1. Descongele el ARNm que codifica la luciferasa de la luciferasa de la luciérnaga en hielo.
    2. Diluir el ARNm hasta un volumen final, 3V, tres veces el volumen de la fase orgánica, en tampón de ácido cítrico de 10 mM.
      NOTA: Cada volumen de lípido, V, debe contener suficiente lípido ionizable para el ARNm diluido en 3 V. Esto corresponde a la relación deseada entre el peso de los lípidos ionizables y el ARNm.

3. Formulación microfluídica de ARNm-LNPs

  1. Rocíe una toallita delicada con un descontaminante de superficies para RNasas y ADN, y limpie bien el interior del instrumento microfluídico.
    1. Abra un nuevo cartucho microfluídico e insértelo con los canales de entrada hacia abajo y hacia afuera.
    2. Asegúrese de que el brazo del tubo cónico contenga dos tubos cónicos de 15 ml y esté en la posición más alejada hacia la derecha.
    3. Configure dos tubos cónicos estériles de 15 ml en el soporte sin tapas.
  2. Llene una jeringa de 5 ml con la solución de ARNm que contiene ARNm diluido en tampón de ácido cítrico de 10 mM.
    1. Llene una jeringa de 3 ml con la solución lipídica que contiene los lípidos diluidos en etanol puro al 100%.
    2. Levante el soporte del cartucho del dispositivo microfluídico.
    3. Inserte la jeringa de 5 ml, sin la aguja, que contiene ARNm en la entrada izquierda del cartucho.
    4. Inserte la jeringa de 3 ml, sin la aguja, que contiene lípidos en la entrada derecha del cartucho.
    5. Vuelva a bajar el soporte del cartucho y cierre la tapa del instrumento microfluídico.
  3. Encienda el instrumento microfluídico utilizando el interruptor ubicado en la parte posterior del instrumento.
    1. Seleccione Ejecución rápida.
    2. Seleccione los tipos de jeringa correctos para las jeringas de 5 mL y 3 mL insertadas.
    3. Introduzca los parámetros para la formulación de ARNm-LNP en una relación de caudal acuoso-orgánico de 3:1, como se describe en la Tabla 2.
    4. Presione el botón Siguiente para ir a la siguiente pantalla.
    5. Confirme que se han introducido los parámetros correctos.
    6. Presione el botón Inicio para formular los ARNm-LNP.

4. Procesamiento posterior a la formulación y caracterización de los ARNm-LNPs

  1. Cargue los ARNm-LNP recogidos en el tubo cónico derecho en los casetes de diálisis previamente hidratados.
    NOTA: No perfore ni dañe la membrana del casete cuando cargue los ARNm-LNP. Si la membrana está dañada, los ARNm-LNP se perderán al cargarse.
    1. Vuelva a colocar los casetes de diálisis que contienen los ARNm-LNP en el vaso de precipitados que contiene 1x PBS y déjelos dializar durante un mínimo de 2 h.
    2. Después de la diálisis, lleve los casetes de diálisis que contienen los ARNm-LNP a un gabinete de bioseguridad estéril y extraiga los ARNm-LNP con una jeringa con una aguja.
    3. Filtrar estérilmente los ARNm-LNP con un filtro de jeringa de 0,22 μm y recogerlos en un tubo cónico estéril.
    4. Colocar 65 μL de la solución de ARNm-LNP en un microtubo de 1,5 mL para fines de caracterización.
  2. Diluir 10 μL de ARNm-LNPs 1:100 en 990 μL de 1x PBS en una cubeta para la medición del tamaño hidrodinámico y el índice de polidispersidad utilizando dispersión dinámica de la luz.
  3. Evaluar la concentración y la eficiencia de encapsulación de los ARNm-LNP mediante un ensayo de fluorescencia (es decir, RiboGreen).
    1. Prepare una solución madre de 1x tampón TE diluyendo 20x tampón TE con agua de biología molecular.
    2. Prepare una solución madre de tampón Triton X-100 al 1% diluyendo Triton X-100 con 1x tampón TE.
    3. Prepare el reactivo fluorescente diluyendo el stock de reactivo 1:200 con 1x tampón TE.
    4. Diluir los ARNm-LNPs 1:100 en tampón TE 1x y tampón Triton X-100 al 1% en una placa de 96 pocillos de fondo negro de pared negra en 100 μL.
    5. Prepare una curva estándar de rango bajo diluyendo el estándar de ARN según las instrucciones del fabricante y coloque la curva estándar en la placa de 96 pocillos.
    6. Añadir 100 μL de reactivo fluorescente diluido a cada pocillo que contenga ARNm-LNP diluido o patrón diluido.
    7. Coloque la placa de 96 pocillos dentro de un lector de placas y agite durante 1 minuto, seguido de una espera de 4 minutos.
    8. Mida la intensidad de fluorescencia de cada pocillo de acuerdo con el protocolo del fabricante a una excitación/emisión de 480 nm/520 nm.
  4. Utilice la curva estándar para convertir los valores de fluorescencia en concentraciones.
    1. Calcular la eficiencia de encapsulación restando el valor obtenido de diluir las LNPs en tampón TE (ARNm no encapsulado) del valor obtenido de diluir las LNPs en Triton X-100 al 1% (ARNm total) y dividiéndolo por el valor obtenido de diluir las LNPs en Triton X-100 al 1%, según la ecuación 4.4.
    2. Calcular la concentración de ARNm-LNP utilizada para estudios celulares y animales restando el valor obtenido de la dilución de LNPs en tampón TE (ARNm no encapsulado) del valor obtenido de la dilución de LNPs en Triton X-100 al 1% (ARNm total).
  5. Mida el pKa de los ARNm-LNP realizando un ensayo de cloruro de 6-(p-toluidino)-2-naftalenosulfonilo (TNS).
    1. Prepare el reactivo de TNS creando una solución de 0,16 mM de TNS en agua ultrapura.
      NOTA: Cuando utilice el reactivo, asegúrese de mantenerlo en hielo y alejado de la luz para evitar la degradación.
    2. Prepare soluciones tamponadas de cloruro de sodio 150 mM, fosfato de sodio 20 mM, citrato de amonio 25 mM y acetato de amonio 20 mM ajustadas a diferentes valores de pH que van de 2 a 12 en incrementos de 0,5.
    3. Agregue 2,5 μL de LNP a cada solución tampón de pH ajustado en una placa de 96 pocillos de fondo negro de pared negra.
    4. Agregue reactivo de TNS a cada pocillo de modo que la concentración final de TNS sea de 6 μM.
    5. Incube la placa de 96 pocillos en un lugar oscuro durante 5 minutos.
    6. Mida la fluorescencia a una excitación/emisión de 322 nm/431 nm utilizando un lector de placas de fluorescencia.
    7. Ajuste los datos a una curva sigmoidal y calcule el pKa utilizando la ecuación ajustada para encontrar el pH al que se observó el 50% de la intensidad máxima.
  6. En la Tabla 3 se muestran resultados representativos para el tamaño hidrodinámico de ARNm-LNP, PDI, eficiencia de encapsulación y pKa.

5. Transfección in vitro de células HepG2

NOTA: Se pueden utilizar otras líneas celulares, como las células HeLa o las células HEK-293T, para evaluar la eficacia de la transfección de las LNP in vitro. Todas las células deben dar negativo para micoplasma antes de los estudios de transfección de LNP.

  1. Colocar 5.000 células HepG2 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo transparente de pared blanca en 100 μL de medio de cultivo celular completo (DMEM suplementado con un 10 % de suero fetal bovino y un 1 % de penicilina-estreptomicina)
    1. Dejar que las células se adhieran durante la noche en una incubadora controlada de CO 2 a 37 °C y 5% de CO2.
  2. Diluir los ARNm-LNP en un medio de cultivo celular completo para que la dosis total se administre en 100 μL.
    1. Retire el medio completo de los pocillos.
    2. Tratar las células con ARNm-LNP diluidos en medio de cultivo celular completo a las dosis deseadas o con medio completo (control).
    3. Vuelva a colocar la placa de 96 pocillos que contiene las células tratadas en la incubadora de CO2 controlada durante 24 horas.
  3. Evalúe la eficiencia de la transfección mediante la realización de un ensayo de luciferasa.
    1. Prepare el reactivo de luciferasa y 1x tampón de lisis celular según las instrucciones del fabricante.
    2. Saque la placa de 96 pocillos que contiene las células de la incubadora y llévela a un gabinete de bioseguridad.
    3. Retire el medio de cultivo celular de cada pocillo de la placa de 96 pocillos.
    4. Agregue 20 μL de tampón de lisis 1x a cada pocillo, seguido de 100 μL del reactivo de ensayo de luciferasa previamente preparado.
    5. Proteja la placa de la luz y colóquela en un lector de placas para medir la señal bioluminiscente de cada pocillo.
      NOTA: En la Figura 1 se muestran resultados representativos que demuestran el tratamiento de células HepG2 con ARNm-LNP C12-200 previamente formulados.

6. Evaluación in vivo de ARNm-LNPs en ratones tras la inyección en la vena de la cola

  1. Diluir la solución de ARNm-LNP con PBS estéril 1x de modo que haya 2 μg de ARNm total en un volumen de inyección de 100 μL en la vena de cola, lo que corresponde a una dosis de peso corporal de aproximadamente 0,1 mg/kg para un ratón de 20 g.
  2. Sujete cada ratón con un método aprobado y limpie la cola con una almohadilla humedecida con alcohol al 70%.
    1. Llene una jeringa de insulina de 29 G con 100 μl de ARNm-LNP (2 μg) o 100 μl de 1x PBS. Retire las burbujas de la jeringa.
    2. Inserte la aguja con el bisel hacia arriba en la vena lateral de la cola del ratón e inyecte lentamente los 100 μL de ARNm-LNP o 1x PBS.
    3. Retire la aguja y aplique presión hasta lograr la hemostasia.
  3. Prepare una solución madre de 15 mg/ml de sal potásica de d-luciferina en 1x PBS estéril 6 horas después de la inyección.
    1. Encienda el sistema de imágenes in vivo (IVIS) y abra el software de imágenes.
    2. Presione Inicializar para preparar el instrumento para la adquisición de datos.
    3. Marca la casilla junto a Luminiscencia y establece el tiempo de exposición en automático. Asegúrese de seleccionar el campo de visión correcto para el número de ratones que se están fotografiando.
    4. Administrar 200 μL de d-luciferina por vía intraperitoneal (150 mg de luciferina por kg de peso corporal) a los ratones previamente tratados.
    5. Coloque a los ratones en una cámara de anestesia ajustada al 2,5% de isoflurano y un flujo de oxígeno de 2,0 L/min.
    6. Espere 10 minutos para que la señal de luciferasa se estabilice antes de obtener imágenes de los ratones tratados con ARNm-LNP.
    7. Asegúrese de que los ratones estén completamente anestesiados y redirija la línea anestésica para administrar isoflurano a través de los conos nasales dentro de la cámara de imágenes.
    8. Transfiera a los ratones a los conos de la nariz y asegúrese de que estén boca arriba con el abdomen expuesto.
    9. Cierre la puerta de la cámara y haga clic en el botón Adquirir en el software para obtener imágenes de bioluminiscencia.
      NOTA: En la Figura 2 se muestran los resultados representativos de las imágenes de cuerpo entero de ratón después del tratamiento con ARNm-LNP o PBS 1X.

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Resultados

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Los ARNm-LNP se formularon utilizando un instrumento microfluídico que poseía un diámetro hidrodinámico promedio de 76,16 nm y un índice de polidispersidad de 0,098. Se encontró que el pKa de los ARNm-LNPs era de 5,75 al realizar un ensayo TNS18. La eficiencia de encapsulación de estos ARNm-LNP se calculó en un 92,3% utilizando el ensayo de fluorescencia modificada y la ecuación 4.4. La concentración global de ARN que se utilizó para el tratamiento celular y la...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Con este flujo de trabajo, se puede formular y probar una variedad de ARNm-LNP para determinar su eficiencia in vitro e in vivo. Los lípidos y excipientes ionizables pueden intercambiarse y combinarse en diferentes proporciones molares y diferentes proporciones de lípidos ionizables a peso de ARNm para producir ARNm-LNP con diferentes propiedades fisicoquímicas22. Aquí, formulamos C12-200 ARNm-LNP con una relación molar de 35/16/46,5/2,5 (lípido ionizable: lípido auxiliar: colest...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No hay conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.J.M. agradece el apoyo de un Premio al Nuevo Innovador del Director de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) de los Estados Unidos (DP2 TR002776), un Premio a la Carrera del Fondo Burroughs Wellcome en la Interfaz Científica (CASI), un premio a la Carrera de la Fundación Nacional de Ciencias de los Estados Unidos (CBET-2145491) y fondos adicionales de los Institutos Nacionales de la Salud (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 y NIDDK R01 DK123049).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,1 m Ácido clorhídricoSigma7647-01-0
0,22 μ m Filtros de jeringaGenesee25-243
1 mL BD Punta deslizante JeringaBD 309659
1,2-dimyristoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio) (C14-PEG2000)Avanti Polar Lipids880150P
1,2-dioleoil-sn-glycero-3-fosfoetanolamina (DOPE)Avanti Polar Lipids850725P
1.5 mL Tubos EppendorfFisher Scientific05-408-129
15 mL Tubos CónicosFisher Scientific14-959-70C
200 prueba EtanolDecon Labs2716
23G AgujasFisher Scientific14-826-6C
3 mL BD Jeringas Desechables con puntas Luer-LokFisher Scientific14-823-435
3 mL Diálisis CasetesThermo ScientificA52976
96 Pozo Pared Negra Placa Inferior Negra FisherScientific07-000-135
96 Pozo Placa Inferior Blanca/Transparente, TC SurfaceThermo Scientific165306
Acetato de Amonio, 1 KilogramoResearch Products International  631-61-8
Citrato de amonio dibásicoSIgma3012-65-5
BD Luer-Lok Jeringa estéril, de un solo uso, 5 mLBD309646
C12-200 Lípidos ionizablesCayman Chemical36699
C57BL/6 RatonesLaboratorio Jackson000664
ColesterolSigma57-88-5
CleanCap FLuc mRNA (5moU)TriLink BiotechnologiesL-7202
Cubetas desechablesFisher Scientific14955129
D-Luciferina, Sal de PotasioThermo ScientificL2916
DMEM, alta glucosaThermofisher Scientific11965-084
Jeringas de insulina Exel - 0,5 mLFisher Scientific1484132
Suero fetal bovinoCorning35-010-CV
Hep G2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HyPure Biología Molecular Grado AguaCytivaSH30538.03
Infinite 200 PRO Lector de placasTecanN/A
IVIS Spectrum Sistema de imagen in vivoPerkin ElmerN/A
Toallitas Kimwipes grandesFisher Scientific06-666-11D
Kit de ensayo de luciferasaPromegaE4550
NanoAssemblr Cartuchos Ignite - Clásico - Paquete de 100Nanosistemas de precisión
NanoAssemblr Ignite InstrumentPrecision NanosystemsNIN0001
PBS - solución salina tamponada con fosfato (10x) pH 7.4, sin RNasaThermo ScientificAM9624
Penicilina-estreptomicinaThermofisher Scientific15140122
QB Tampón de citrato, (citrato 100 mM) pH 3.0TeknovaQ2442
Quant-it RiboGreen Kit de ensayo de ARNThermo ScientificR11490
Reporter Lysis 5x TampónPromegaE3971
RNase Away Descontaminante de superficieThermofisher Scientific7000TS1
Cloruro de sodioSigma7647-14-5
Hidróxido de sodioSigma1310-73-2
Fosfato de sodioSigma7601-54-9
Reactivo TNS (6-(p-toluidino)-2-naftalenosulfónico ácido sódico sal)SigmaT9792
Triton X-100Sigma9036-19-5
ZetasizerMalvern AnalíticaNanoZS
NIN0065

Referencias

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