Aquí, se presenta un protocolo para la formulación de nanopartículas lipídicas (LNPs) que encapsulan el ARNm que codifica la luciferasa de luciérnaga. La potencia de estos LNP se probó in vitro en células HepG2 e in vivo en ratones C57BL/6.
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Artículo de método
Prueba de la eficiencia in vitro e in vivo de nanopartículas lipídicas de ARNm formuladas mediante mezcla microfluídica
En este artículo
Resumen
Resumen
Las nanopartículas lipídicas (LNP, por sus siglas en inglés) han atraído una amplia atención recientemente con el exitoso desarrollo de las vacunas de ARNm contra la COVID-19 por parte de Moderna y Pfizer/BioNTech. Estas vacunas han demostrado la eficacia de las terapias de ARNm-LNP y han abierto la puerta a futuras aplicaciones clínicas. En los sistemas ARNm-LNP, los LNP sirven como plataformas de administración que protegen la carga de ARNm de la degradación por nucleasas y median su entrega intracelular. Los LNP suelen estar compuestos por cuatro componentes: un lípido ionizable, un fosfolípido, colesterol y un conjugado de polietilenglicol (PEG) anclado a lípidos (lípido-PEG). En este caso, los LNP que encapsulan el ARNm que codifica la luciferasa de luciérnaga se formulan mediante la mezcla microfluídica de la fase orgánica que contiene los componentes lipídicos de LNP y la fase acuosa que contiene el ARNm. A continuación, estos ARNm-LNP se prueban in vitro para evaluar su eficacia de transfección en células HepG2 mediante un ensayo bioluminiscente basado en placas. Además, los ARNm-LNP se evalúan in vivo en ratones C57BL/6 después de una inyección intravenosa a través de la vena lateral de la cola. Las imágenes de bioluminiscencia de cuerpo entero se realizan mediante el uso de un sistema de imágenes in vivo . Se muestran resultados representativos de las características de ARNm-LNP, su eficiencia de transfección en células HepG2 y el flujo luminiscente total en ratones C57BL/6.
Introducción
Las nanopartículas lipídicas (LNP) han demostrado ser muy prometedoras en los últimos años en el campo de la terapia génica no viral. En 2018, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) aprobó la primera terapia de ARN de interferencia (ARNi), Onpattro de Alnylam, para el tratamiento de la amiloidosis hereditaria por transtiretina 1,2,3,4. Este fue un importante paso adelante para las nanopartículas lipídicas y las terapias basadas en ARN. Más recientemente, Moderna y Pfizer/BioNTech r....
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Protocolo
NOTA: Mantenga siempre las condiciones libres de ARNasa cuando formule ARNm-LNP limpiando las superficies y el equipo con un descontaminante de superficie para ARNasas y ADN. Utilice únicamente puntas y reactivos sin RNasa.
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Pensilvania y un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Pensilvania.
1. Preparación previa a la formulación
- Llene un vaso de precipitados limpio de 4 ....
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Resultados
Los ARNm-LNP se formularon utilizando un instrumento microfluídico que poseía un diámetro hidrodinámico promedio de 76,16 nm y un índice de polidispersidad de 0,098. Se encontró que el pKa de los ARNm-LNPs era de 5,75 al realizar un ensayo TNS18. La eficiencia de encapsulación de estos ARNm-LNP se calculó en un 92,3% utilizando el ensayo de fluorescencia modificada y la ecuación 4.4. La concentración global de ARN que se utilizó para el tratamiento celular y la.......
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Discusión
Con este flujo de trabajo, se puede formular y probar una variedad de ARNm-LNP para determinar su eficiencia in vitro e in vivo. Los lípidos y excipientes ionizables pueden intercambiarse y combinarse en diferentes proporciones molares y diferentes proporciones de lípidos ionizables a peso de ARNm para producir ARNm-LNP con diferentes propiedades fisicoquímicas22. Aquí, formulamos C12-200 ARNm-LNP con una relación molar de 35/16/46,5/2,5 (lípido ionizable: lípido auxiliar: colest.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
M.J.M. agradece el apoyo de un Premio al Nuevo Innovador del Director de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) de los Estados Unidos (DP2 TR002776), un Premio a la Carrera del Fondo Burroughs Wellcome en la Interfaz Científica (CASI), un premio a la Carrera de la Fundación Nacional de Ciencias de los Estados Unidos (CBET-2145491) y fondos adicionales de los Institutos Nacionales de la Salud (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 y NIDDK R01 DK123049).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,1 m Ácido clorhídrico | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0,22 μ m Filtros de jeringa | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Punta deslizante Jeringa | BD 309659 | ||
| 1,2-dimyristoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoil-sn-glycero-3-fosfoetanolamina (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Tubos Eppendorf | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Tubos Cónicos | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 prueba Etanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Agujas | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Jeringas Desechables con puntas Luer-Lok | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Diálisis Casetes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Pozo Pared Negra Placa Inferior Negra Fisher | Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Pozo Placa Inferior Blanca/Transparente, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Acetato de Amonio, 1 Kilogramo | Research Products International | 631-61-8 | |
| Citrato de amonio dibásico | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Jeringa estéril, de un solo uso, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Lípidos ionizables | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Ratones | Laboratorio Jackson | 000664 | |
| Colesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Cubetas desechables | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferina, Sal de Potasio | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, alta glucosa | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Jeringas de insulina Exel - 0,5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Suero fetal bovino | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Biología Molecular Grado Agua | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Lector de placas | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum Sistema de imagen in vivo | Perkin Elmer | N/A | |
| Toallitas Kimwipes grandes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Kit de ensayo de luciferasa | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Cartuchos Ignite - Clásico - Paquete de 100 | Nanosistemas de precisión | ||
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS - solución salina tamponada con fosfato (10x) pH 7.4, sin RNasa | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicilina-estreptomicina | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Tampón de citrato, (citrato 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen Kit de ensayo de ARN | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Tampón | Promega | E3971 | |
| RNase Away Descontaminante de superficie | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Cloruro de sodio | Sigma | 7647-14-5 | |
| Hidróxido de sodio | Sigma | 1310-73-2 | |
| Fosfato de sodio | Sigma | 7601-54-9 | |
| Reactivo TNS (6-(p-toluidino)-2-naftalenosulfónico ácido sódico sal) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Analítica | NanoZS |
Referencias
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran ....
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Reimpresiones y permisos
