Artículo de método

Estrategias de detección de moléculas pequeñas: desde la identificación de prospectos hasta la validación

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DOI:

10.3791/64811

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20 de enero de 2023

1Department of Cancer Biology, Chemical Biology Program, Dana-Farber Cancer Institute

En este artículo

Resumen

ARTÍCULOS DISCUTIDOS:

Festa, F., Labaer, J. Cribado de inhibidores de quinasa en microarrays de proteínas humanas autoensambladas. Revista de Experimentos Visualizados. 152, E59886 (2019).

Stockman, B. J. et al. Ensayos de actividad basados en RMN para determinar la inhibición de compuestos, los valores de IC50, la actividad artifactual y la actividad de toda la célula de las ribohidrolasas nucleósidas. Revista de Experimentos Visualizados. 148, E59928 (2019).

Gao, S. et al. Un ensayo de alto rendimiento para la predicción de la toxicidad química mediante el perfil fenotípico automatizado de Caenorhabditis elegans. Revista de Experimentos Visualizados. 145, E59082 (2019).

Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Uso de imágenes de alto contenido para cuantificar la participación del objetivo en las células adherentes. Revista de Experimentos Visualizados. 141, E58670 (2018).

Chorba, J. S., Galván, A. M., Shokat, K. M. Un ensayo de luciferasa de alto rendimiento para evaluar la proteólisis de la proteasa de recambio único PCSK9. Revista de Experimentos Visualizados. 138, E58265 (2018).

Sullivan, C. et al. Uso de modelos de pez cebra de infecciones por el virus de la influenza A humana para detectar medicamentos antivirales y caracterizar las respuestas de las células inmunitarias del huésped. Revista de Experimentos Visualizados. 119, E55235 (2017).

Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Evaluación de la resistencia a los inhibidores de la tirosina quinasa mediante una interrogación de las vías de transducción de señales por matrices de anticuerpos. Revista de Experimentos Visualizados. 139, E57779 (2018).

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPasa acoplado a NADH para el cribado de inhibidores de moléculas pequeñas. Revista de Experimentos Visualizados. 150, E60017 (2019).

Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Desarrollo de inhibidores de interacciones proteína-proteína a través de REPLACE: Aplicación al diseño y desarrollo de inhibidores de CDK competitivos no ATP. Revista de Experimentos Visualizados. 104, E52441 (2015).

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identificación de mediadores de la señalización del receptor de células T a través del cribado de bibliotecas de inhibidores químicos. Revista de Experimentos Visualizados. 143, E58946 (2019).

Takakusagi, Y. Estrategia de análisis bioinformático y biopanning de alto rendimiento basada en biosensores para la validación global de las interacciones fármaco-proteína. Revista de Experimentos Visualizados. 166, E61873 (2020).

Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. Perfil celular de alto rendimiento de compuestos de degradación de proteínas dirigidos utilizando líneas celulares HiBiT CRISPR. Revista de Experimentos Visualizados. 165, E61787 (2020).

Editorial

La revolución genómica ha dado lugar a una gran cantidad de conocimiento sobre la asociación entre la perturbación genética y los diferentes fenotipos de enfermedades1. Esto ha llevado a la anotación de numerosas proteínas como posibles dianas farmacológicas y ha estimulado el interés en el descubrimiento y desarrollo de compuestos que inhiban estas dianas2. En este contexto, diferentes estrategias de cribado han surgido como enfoques importantes para el descubrimiento de compuestos de éxito, la validación de objetivos, la medición de las afinidades de unión, la selectividad, la toxicidad y el compromiso de los objetivos en las células, así como la reactividad, la estabilidad y las propiedades farmacocinéticas de los compuestos. Esta colección captura algunos de los avances metodológicos en esta área con el objetivo de mostrar una multitud de estrategias que se pueden utilizar para detectar y evaluar la actividad bioquímica y / o biológica de moléculas pequeñas.

Las proteínas quinasas representan una gran familia de enzimas con más de 500 miembros. Estas enzimas son reguladores clave de todos los procesos celulares, y su mal funcionamiento se ha relacionado con numerosas enfermedades3. Por lo tanto, han sido el foco de un intenso interés en el descubrimiento de fármacos y, por extensión, en el desarrollo de metodologías. Así, cuatro artículos de esta colección informan sobre los avances en este espacio. Festa et al. describen una plataforma de cribado para el descubrimiento de inhibidores de quinasas que utiliza matrices de proteínas programables de ácidos nucleicos autoensambladas (NAPPA)4. Estas matrices muestran quinasas humanas de longitud completa y permiten el cribado multiplexado de compuestos en una gran colección de quinasas, lo que permite no solo identificar aciertos sino también perfilar la selectividad. Tieman et al. describen un método basado en microarrays de fosfoanticuerpos desarrollado para detectar cambios en el estado de fosforilación de toda la célula como una lectura de la actividad del inhibidor de la quinasa5. Esto puede conducir a comprender la naturaleza de las vías que se han vuelto resistentes a la inhibición, que es un parámetro importante relevante para comprender la respuesta y la eficacia de los fármacos. Chen et al. describen un ensayo de citometría de flujo para el cribado de colecciones de inhibidores de quinasas para identificar compuestos que afectan la señalización del receptor de células T (TCR)6. Esta estrategia condujo a la rápida identificación de quinasas involucradas en la señalización de TCR, lo que indica su potencial como objetivos para el desarrollo de fármacos inmunoterapéuticos. Por último, la actividad de muchas quinasas está regulada a través de interacciones proteína-proteína (IBP), lo que sugiere que los compuestos que se dirigen a estos IBP podrían ser de interés. Nandha Premnath et al. describen un método llamado REPLACE (reemplazo con alternativas de ligando parcial mediante enriquecimiento computacional) que se puede utilizar para desarrollar PPI competitivos de quinasas sin ATP mediante la conversión de características de los aglutinantes peptídicos en pequeñas moléculas que se acoplan a la misma superficie de unión7.

Además de las quinasas, muchas otras enzimas desempeñan un papel en la enfermedad y se han perseguido en el descubrimiento de fármacos. Por lo tanto, también son de interés los métodos optimizados para enzimas distintas de las quinasas. Por ejemplo, Stockman et al. describen ensayos de actividad basados en espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) para descubrir y evaluar inhibidores de nucleósidos ribohidrolasas del parásito Trichomonas vaginalis8. Estos ensayos también se pueden utilizar para la determinación de valores de IC50 . Para detectar inhibidores de la ATPasa, Radnai et al. desarrollaron un método de cribado de semi-alto rendimiento que utiliza un formato de ensayo enzimático acoplado que involucra dos enzimas (piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa) que finalmente traduce la actividad de la ATPasa en fluorescencia intrínseca del dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADH) como lectura9. A diferencia de todas las enzimas descritas hasta ahora que son procesivas y catalizan múltiples pasos, la proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9) es una proteasa de recambio único que se autoinhibe por su sustrato. Esto hace que la detección de inhibidores de PCSK9 sea un desafío, y Chorba et al. describen un método basado en células de alto rendimiento que vincula la actividad de escisión de PCSK9 con la actividad de luciferasa secretada como una lectura, lo que permite la detección de inhibidores10.

Además de encontrar compuestos que inhiben la actividad de varios objetivos, los ensayos que confirman que el compuesto se acopla a su objetivo previsto en las células también son de gran interés. Axelsson et al. describen una estrategia para validar el compromiso de la diana en células adherentes basada en la combinación de imágenes de alto contenido mediante anticuerpos inmunofluorescentes y un ensayo de cambio térmico celular (CETSA)11. Este ensayo utiliza un desafío de calor isotérmico a las células tratadas con una gran colección de compuestos para identificar compuestos estabilizadores. Un método que puede evaluar el compromiso objetivo y la actividad de las moléculas degradadoras, desarrollado por Riching et al., utiliza la tecnología de etiquetado HiBiT / LgBiT para producir una proteína luminiscente y monitorear los parámetros de degradación a través de una disminución en la luminiscencia12. Por último, Takakusagi et al. describen un método para validar las interacciones proteína-fármaco que se basa en el uso de pantallas de péptidos basadas en fagos para detectar la unión entre motivos peptídicos de unión a fármacos y moléculas pequeñas13. La pantalla de visualización de péptidos se combina con el análisis bioinformático para validar la unión de la diana.

Otra capa de validación de moléculas pequeñas es la caracterización de sus efectos en modelos animales. Esta colección incluye dos de estos métodos, uno que utiliza modelos de pez cebra (Danio rerio) de infección por el virus de la influenza A humana para evaluar la eficacia de compuestos con actividad antiviral, así como la respuesta inmune del huésped14, y otro que emplea Caenorhabditis elegans como modelo para perfilar la toxicidad de los compuestos15. Ambos estudios destacan la necesidad de métodos optimizados que puedan evaluar la eficacia y la toxicidad in vivo.

En conclusión, el descubrimiento y desarrollo de fármacos son procesos formidables con numerosos cuellos de botella, desafíos y una alta probabilidad de fracaso. Además, la carga continua de enfermedades, ya sea en el área de enfermedades infecciosas donde el número de patógenos resistentes a los medicamentos ha estado creciendo a un ritmo alarmante o en las áreas de creciente prevalencia de enfermedades crónicas y enfermedades asociadas con el envejecimiento de la población, exige nuestra atención y acción enfocadas. Esta colección destaca varios métodos que tienen como objetivo acelerar el descubrimiento, la validación y la caracterización de fármacos. En el futuro, esperamos ver más innovaciones en este espacio, especialmente aquellas destinadas a mejorar el rendimiento del cribado, aumentar la diversidad de bibliotecas químicas y desarrollar modelos in vivo compatibles con el cribado de alto rendimiento (HTS). Además, los flujos de trabajo que brindan una visión holística de la potencia, selectividad, especificidad, eficacia y toxicidad a una escala más rápida y menor podrían ser especialmente habilitantes.

Divulgaciones

M.K. es consultor remunerado de Life Science Editors.

Agradecimientos

M.K. es parcialmente compatible con el NCI T32 CA236754.

Referencias

  1. Vincent, F., et al. Phenotypic drug discovery: recent successes, lessons learned and new directions. Nature Reviews Drug Discovery. , (2022).
  2. Ha, J., Park, H., Park, J., Park, S. B. Recent advances in identifying protein targets in drug discovery. Cell Chemical Biology. 28, 394-423 (2021).
  3. Attwood, M. M., et al. Trends in kinase drug discovery: targets, indications and inhibitor design. Nature Reviews. Drug Discovery. 20, 839-861 (2021).
  4. Festa, F., Labaer, J. Kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays. Journal of Visualized Experiments. (152), e59886(2019).
  5. Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays. Journal of Visualized Experiments. (139), e57779(2018).
  6. Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of mediators of T-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries. Journal of Visualized Experiments. (143), e58946(2019).
  7. Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Development of inhibitors of protein-protein interactions through REPLACE: Application to the design and development non-ATP competitive CDK inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (104), e52441(2015).
  8. Stockman, B. J., et al. NMR-Based activity assays for determining compound inhibition, IC50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases. Journal of Visualized Experiments. (148), e59928(2019).
  9. Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A semi-high-throughput adaptation of the NADH-coupled ATPase assay for screening small molecule inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (150), e60017(2019).
  10. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. A high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease PCSK9. Journal of Visualized Experiments. (138), e58265(2018).
  11. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (141), e58670(2018).
  12. Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. High-Throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using HiBiT CRISPR cell lines. Journal of Visualized Experiments. (165), e61787(2020).
  13. Takakusagi, Y. Biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions. Journal of Visualized Experiments. (166), e61873(2020).
  14. Sullivan, C., et al. Using zebrafish models of human influenza A virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses. Journal of Visualized Experiments. (119), e55235(2017).
  15. Gao, S., et al. A high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by Automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (145), e59082(2019).

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