Se describe un protocolo para realizar imágenes en vivo en tiempo real para cuantificar cómo la proteína accesoria TnpB afecta la dinámica de transposición en células vivas individuales de Escherichia coli .
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Artículo de método
Cuantificación en tiempo real de los efectos de la TnpB asociada a la familia IS200/IS605 sobre la actividad de transposones
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Resumen
Resumen
Aquí, se describe un protocolo para realizar imágenes en vivo y en tiempo real de la actividad de elementos transponibles en células bacterianas vivas utilizando un conjunto de reporteros fluorescentes acoplados a la transposición. En particular, demuestra cómo se pueden utilizar las imágenes en tiempo real para evaluar los efectos de la proteína accesoria TnpB sobre la actividad del elemento transponible IS608, un miembro de la familia de elementos transponibles IS200/IS605. La familia de elementos transponibles IS200/IS605 son elementos móviles abundantes conectados con uno de los genes más innumerables que se encuentran en la naturaleza, tnpB. Las homologías de secuencia proponen que la proteína TnpB puede ser un precursor evolutivo de los sistemas CRISPR/Cas9. Además, TnpB ha recibido un renovado interés, habiéndose demostrado que actúa como una endonucleasa de ADN guiada por ARN similar a Cas. Se cuantifican los efectos de TnpB en las tasas de transposición de IS608, y se demuestra que la expresión de TnpB de IS608 da como resultado ~ 5 veces mayor actividad de transposones en comparación con las células que carecen de expresión de TnpB.
Introducción
Los elementos transponibles (ET) son elementos genéticos que se movilizan dentro de sus genomas del huésped por escisión o copia catalizada seguida de reintegración genómica. Los TE existen en todos los dominios de la vida, y la transposición reestructura el genoma del huésped, mutando las regiones codificantes y de control1. Esto genera mutaciones y diversidad que juegan un papel importante en la evolución2,3, el desarrollo4,5 y varias enfermedades humanas6, incluyendo el cáncer7.....
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Protocolo
1. Preparación de cultivos bacterianos
- Cultivar la cepa MG1655 de E. coli con construcciones de transposones plásmidos (descritas previamente en Kim et al.8) durante la noche en LB con los antibióticos apropiados (25 μg/ml de kanamicina, ver Tabla de materiales) a 37 °C.
NOTA: Las secuencias de los constructos utilizados y las secuencias relacionadas están disponibles como GenBank20 números de acceso OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 y OP717085. - Para lograr un crecimiento exponencial en estado estacionario, los cultivos diluidos ≥100 veces en el medio....
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Resultados
Este método de visualización de la actividad del transposón en células vivas mediante microscopía de fluorescencia, aunque tiene un rendimiento más bajo que las mediciones de fluorescencia a granel, permite la visualización directa de la actividad del transposón en células vivas individuales. Los eventos de escisión de transposones resultan en la reconstitución del promotor para mCerulean3 (Figura 1), permitiendo la identificación de células sometidas a actividad transposónica por fluorescencia azul brillante (
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Discusión
El método único presentado aquí para obtener imágenes en tiempo real de la actividad de elementos transponibles en células vivas es un ensayo sensible que puede detectar directamente la transposición en células vivas y en tiempo real y correlacionar esta actividad con la expresión de proteínas accesorias. Si bien el rendimiento es menor que el que se puede lograr con métodos a granel, este método logra mediciones detalladas de la actividad de TE y la expresión de proteínas en células vivas individuales.
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
El apoyo financiero para esta investigación fue proporcionado por fondos iniciales de la Universidad de California.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Epoxi transparente de 2 toneladas | Devcon | 31345 | |
| Agarosa | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Sulfato de amonio | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Clorhidrato de anhidrotetraciclina | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Cubo de filtro azul | Chroma | Ej: Z457/10X, EM: ET485/30M | |
| D(+)Glucosa | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscopio | Nikon | Descatalogado | |
| Eppendorf epTIPS Cajas y bandejas de recarga, volumen: 0,1 a 10 µ L, Longitud: 3,4 cm, 1,33 pulg., PP (Polipropileno) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Cajas y bandejas de recambio Eppendorf epTIPS, Volumen: 50 a 1000 µ L, Longitud: 7,1 cm, 2,79 pulg., PP (Polipropileno) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Sulfato ferroso Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents Caldo LB, Miller (Granulado) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Corredera de cubierta de vidrio | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Sulfato de kanamicina | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Sulfato de magnesio Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Calentador de microscopio | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Fosfato de potasio monobásico | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Etapa | anterior | ||
| Cubo de filtro rojo | Chroma | Ex: ET560/40X, EM: ET645/75M | |
| Zafiro 561 LP Portaobjetos de | 1170412 | Coherente | |
| , Microscopio | Fisher Scientific | 125535B | |
| Clorhidrato de tiamina | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Lanzamiento láser | Nikon | ||
| Cubo de filtro amarillo | croma | Ej: Z514/10X, EM: ET535/30M |
Referencias
- Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).
- Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Micro....
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Reimpresiones y permisos
