Este protocolo describe la exposición quirúrgica del ganglio de la raíz dorsal (GRD) seguida de GCaMP3 (indicador de Ca2+ codificado genéticamente; Proteína fluorescente verde-Calmodulina-M13 Proteína 3) Imagen de Ca2+ de los conjuntos neuronales utilizando ratones Pirt-GCaMP3 mientras se aplica una variedad de estímulos a la pata trasera ipsilateral.
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Artículo de método
In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios intactos de la raíz dorsal
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Resumen
Resumen
Las imágenes de Ca 2+ se pueden utilizar como un proxy de la actividad celular, incluidos los potenciales de acción y varios mecanismos de señalización que implican la entrada de Ca 2+ en el citoplasma o la liberación de reservas intracelulares de Ca2+. Las imágenes de Ca2+ basadas en Pirt-GCaMP3 de neuronas sensoriales primarias del ganglio de la raíz dorsal (DRG) en ratones ofrecen la ventaja de la medición simultánea de un gran número de células. Se pueden monitorizar hasta 1.800 neuronas, lo que permite estudiar redes neuronales y procesos somatosensoriales como un conjunto en su contexto fisiológico normal a nivel poblacional in vivo. El gran número de neuronas monitoreadas permite la detección de patrones de actividad que serían difíciles de detectar utilizando otros métodos. Los estímulos se pueden aplicar a la pata trasera del ratón, lo que permite estudiar los efectos directos de los estímulos en el conjunto de neuronas DRG. El número de neuronas que producen transitorios de Ca 2+, así como la amplitud de los transitorios de Ca2+ indica sensibilidad a modalidades sensoriales específicas. El diámetro de las neuronas proporciona evidencia de tipos de fibras activadas (mecanos no nocivos vs. fibras nocivas del dolor, fibras Aβ, Aδ y C). Las neuronas que expresan receptores específicos pueden ser marcadas genéticamente con td-Tomato y Cre específicas recombinasas junto con Pirt-GCaMP. Por lo tanto, las imágenes Pirt-GCaMP3 Ca2+ de DRG proporcionan una poderosa herramienta y modelo para el análisis de modalidades sensoriales específicas y subtipos de neuronas que actúan como un conjunto a nivel poblacional para estudiar el dolor, la picazón, el tacto y otras señales somatosensoriales.
Introducción
Las neuronas sensoriales primarias inervan directamente la piel y llevan la información somatosensorial de vuelta al sistema nervioso central 1,2. Los ganglios de la raíz dorsal (GRD) son grupos de células corporales de 10.000-15.000 neuronas sensoriales primarias 3,4. Las neuronas DRG presentan diversos tamaños, niveles de mielinización y patrones de expresión de genes y receptores. Las neuronas de diámetro más pequeño incluyen neuronas sensibles al dolor y las neuronas de mayor diámetro típicamente responden a estímulos mecánicos no dolorosos
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Protocolo
Todos los procedimientos descritos aquí se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio.
NOTA: Una vez iniciada, la cirugía con animales (paso 1) y las imágenes (paso 2) deben completarse de manera continua. El análisis de datos (paso 3) se puede realizar más adelante.
1. Cirugía y fijación del animal para la imagen L5 DRG del lado derecho
NOTA: En este estudio se utilizaron ratones Pirt-GCaMP3 C57BL / 6J machos y hembras de 8 semanas d....
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Resultados
Figura 4: Imágenes representativas de los ganglios de la raíz dorsal L5 de ratones Pirt-GCaMP3. (A,D) Se muestran escaneos de alta resolución de fotograma único de los ganglios de la raíz dorsal L5 de ratones Pirt-GCaMP3. (B,E) . Proyecciones de intensidad media de 15 fotogramas de ganglios Pirt-GCa.......
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Discusión
El dolor persistente está presente en una amplia gama de trastornos, debilitando y/o reduciendo la calidad de vida de aproximadamente 8% de las personas29. Las neuronas sensoriales primarias detectan estímulos nocivos en la piel, y su plasticidad contribuye al dolor persistente8. Si bien las neuronas se pueden estudiar en cultivo celular y explantes, al hacerlo las elimina de su contexto fisiológico normal. La exposición quirúrgica del DRG, seguida de imágenes Pirt-GCaMP3 C.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01DE026677 y R01DE031477 de los Institutos Nacionales de Salud (a Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.) y un premio Rising STAR del sistema de la Universidad de Texas (YSK).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Inyección anasada (xilacina) | Covetrus, Akorn | 33197 | |
| C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC | Cal Zeiss | 422642-9900-000 | |
| Aplicadores con punta de algodón | McKesson | 24-106-1S | |
| Hemostático curvo | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| DC Controlador de temperatura | FHC | 40-90-8D | |
| Almohadilla térmica del controlador de temperatura de CC | FHC | 40-90-2-05 | |
| Pinzas con recubrimiento cerámico Dumont | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| FHC Controlador de temperatura de CC | FHC | 40-90-8D | |
| Fluriso (isoflurano) | MWI Salud animal, Grupo Piramal | 501017 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| GelFoam | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Ketaset (Ketamina) | Zoetis | KET-00002R2 | |
| Cinta de escenario verde luminiscente | JSITON/ Amazon | B803YW8ZWL | |
| Matrx VIP 3000 Vaporizador de isoflurano | Midmark 91305430 | ||
| Micro tijeras de disección | Roboz | RS-5882 | |
| Micro resorte de disección tijeras | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Micro tijeras de disección | Roboz | RS-5677 | |
| Mini Sonda de termistor rectal | FHC | 40-90-5D-02 | |
| Tijeras de operación | Roboz | RS-6812 | |
| Pirt-GCaMP3 C57BL/6J ratones | Johns Hopkins University | N/A | Cualquiera de los dos sexos puede ser visualizado igual de bien. Los ratones deben tener al menos 8 semanas de edad debido a la expresión débil o intermitente del promotor Pirt en los ratones más jóvenes. |
| Algómetro para animales pequeños SMALGO | Bioseb Instrumentos de investigación in vivo | BIO-SMALGO | |
| Marco estereotáxico | Kopf Modelo 923-B | 923-B | |
| td-Tomato C57BL/6J | ratones Jackson Laboratory | 7909 | |
| Placa superior, 6 in x 10 in | Newport | 290-TP | |
| TrpV1-Cre C57BL/6J ratones | Jackson Laboratory | 17769 | |
| Microscopio confocal Zeiss LSM 800 | Cal Zeiss | LSM800 | |
| Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software | Cal Zeiss | Zen (Blue Edition) 2.6 |
Referencias
- Rivero-Melián, C., Grant, G. Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate. The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).
- Wessels, W. J., Marani, E.
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Reimpresiones y permisos
