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Sistema de detección de virus de ADN basado en RPA-CRISPR/Cas12A-SPM y Deep Learning

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DOI:

10.3791/64833

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10 de mayo de 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Precision Medicine and Healthcare, Tsinghua-Berkeley Shenzhen Institute, 2Institute of Biopharmaceutics and Health Engineering, Tsinghua Shenzhen International Graduate School

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Presentamos un protocolo que combina la amplificación de la polimerasa recombinasa con un sistema CRISPR/Cas12a para la detección de trazas de virus de ADN y construye una microscopía portátil para teléfonos inteligentes con una clasificación asistida por inteligencia artificial para la detección de virus de ADN en el punto de atención.

Resumen

Presentamos un sistema de detección de virus de ADN rápido, fácil de implementar, altamente sensible, específico de secuencia y en el punto de atención (POC), que combina la amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) y el sistema CRISPR/Cas12a para la detección de trazas de virus de ADN. El ADN objetivo es amplificado y reconocido por RPA y CRISPR/Cas12a por separado, lo que desencadena la actividad de escisión colateral de Cas12a que escinde un reportero de ADN marcado con extintores de fluoróforos y generaliza la fluorescencia. Para la detección de POC, la microscopía portátil de los teléfonos inteligentes está diseñada para tomar imágenes fluorescentes. Además, se despliegan dentro del sistema modelos de aprendizaje profundo para la clasificación binaria de muestras positivas o negativas, logrando una alta precisión. El virus de la rana 3 (FV3, géneros Ranavirus, familia Iridoviridae) se probó como ejemplo para este sistema de detección POC de virus de ADN, y los límites de detección (LoD) pueden alcanzar 10 aM en 40 minutos. Sin operadores cualificados ni instrumentos voluminosos, el RPA-CRISPR/Cas12a-SPM portátil y en miniatura con clasificación asistida por inteligencia artificial (IA) muestra un gran potencial para la detección de virus POC DNA y puede ayudar a prevenir la propagación de dichos virus.

Introducción

En los últimos años, se han producido con frecuencia epidemias de enfermedades infecciosas causadas por diferentes virus, como la epidemia de enfermedad por el virus del Ébola (EVE) en 20141 y 20182, el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) en 20153, la epidemia de enfermedad por el virus del Zika en 20154, la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) causada por el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2)5 y la continuación de la viruela del mono causada por el virus de la viruela del mono (MKPV) en 20226. Estos brotes repentinos de enfermedades infecciosas epidémicas causan un gran número de muertes y traen enormes pérdidas económicas y disturbios sociales. Se requiere urgentemente un sistema de detección rápido y preciso para diagnosticar rápidamente la infección y evitar una mayor propagación del virus.

Recientemente, las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) y las proteínas asociadas a CRISPR (Cas) han ganado atención mundial y han mostrado resultados prometedores en la detección de ácidos nucleicos 7,8,9,10,11,12,13,14,15 . La proteína CRISPR/Cas12a, guiada por el ARN CRISPR (crRNA), se une y escinde el ADN diana. Esta actividad conduce a la liberación de ADN monocatenario inespecífico (ssDNA), conocido como trans-escisiones, y se puede utilizar para mejorar la señal de detección para la detección de ácidos nucleicos. Algunos métodos de detección tradicionales, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) y el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA), son complicados, lentos y costosos para la detección en el punto de atención (POC). Nuestro trabajo anterior desarrolló con éxito un sistema de detección automatizado, integrado y rentable para el virus de la peste porcina africana (PPA) basado en la tecnología CRISPR/Cas12a. En este sistema, logramos un límite de detección de 1 pM en un período de tiempo de 2 horas sin necesidad de amplificación. El sistema CRISPR/Cas12a y la amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) se combinan para mejorar la sensibilidad y la especificidad de la detección de trazas de ADN. En comparación con otras técnicas de amplificación isotérmica, RPA tiene un diseño simple y una operación conveniente, ya que tiene un tiempo de reacción más corto sin un equipo sofisticado de control de temperatura.

Para la detección de patógenos POC, se desarrollan instrumentos como la microscopía de teléfono inteligente (SPM), el fluorímetro de mano o las tiras de flujo lateral para las lecturas de resultados 16,17,18. SPM captura imágenes a través de una cámara y las sube a algunas aplicaciones móviles para un análisis rápido de los datos. Dicha microscopía es un sistema de adquisición de señales portátil, barato y en miniatura con alta sensibilidad y ha demostrado ventajas en la detección de patógenos como el H5N1, el virus del Zika y el SARS-CoV-219,20. Por lo tanto, construimos un SPM portátil para captar las señales de fluorescencia desencadenadas por la detección de RPA-CRISPR/Cas12a del virus de ADN objetivo. La sonda reportera de ssDNA que conecta un fluoróforo y un extintor, se escindirá cuando CRISPR/Cas12a reconozca el virus de ADN objetivo, y la fluorescencia emitida por el fluoróforo pueda ser capturada por SPM.

En comparación con el software profesional que se suele utilizar para obtener la información de los resultados de las imágenes de fluorescencia de SPM21, algunos expertos utilizan el aprendizaje automático y el aprendizaje profundo para cuantificar las concentraciones de ADN del virus después de obtener imágenes de fluorescencia22, lo que requiere más tiempo. Cuando se trata de clasificar imágenes médicas, las redes neuronales convencionales (CNN) se utilizan a menudo para aprender características de las imágenes pixeladas en bruto de manera integral 23,24,25,26. Los modelos populares de aprendizaje profundo basados en CNN, como AlexNet, DenseNet-121 y EfficientNet-B7, se han aplicado con éxito en este campo27,28. Sin embargo, la obtención de grandes conjuntos de datos en dominios específicos puede ser un desafío, lo que requiere un aprendizaje por transferencia29,30. Este enfoque entrena previamente un modelo de aprendizaje profundo con un conjunto de datos grande, y el modelo entrenado previamente se usa como punto de partida para una nueva tarea con un conjunto de datos pequeño. Esta técnica puede reducir la necesidad de grandes conjuntos de datos, combatir el sobreajuste y reducir el tiempo de entrenamiento31. En este trabajo, utilizamos modelos de aprendizaje profundo con aprendizaje por transferencia para la clasificación binaria de las imágenes de fluorescencia de las muestras positivas y negativas.

En este método, combinamos RPA y el sistema CRISPR/Cas12a para la detección de trazas de virus de ADN. El ADN objetivo es amplificado y reconocido por RPA y CRISPR/Cas12a por separado, lo que desencadena la actividad de escisión colateral de Cas12a que escinde un reportero de ADN marcado con extintores de fluoróforos y generaliza la fluorescencia. Construimos un SPM portátil para tomar las imágenes fluorescentes para la detección de POC y desarrollamos modelos de aprendizaje profundo para la clasificación binaria. El esquema del sistema de detección POC incorporado se muestra en la Figura 1. Sin operadores cualificados e instrumentos voluminosos, la clasificación asistida por RPA-CRISPR/Cas12a-SPM con inteligencia artificial (IA) muestra un gran potencial para la detección de virus POC ADN.

figure-introduction-1
Figura 1: Esquema del sistema de detección RPA-CRISPR/Cas12-SPM junto con la clasificación de IA para las imágenes recopiladas. Los ácidos nucleicos de las muestras de origen animal son liberados por PINDBK. El ADN diana del virus es amplificado y reconocido específicamente por el sistema RPA-CRISPR/Cas12a. CRISPR/Cas12a se une con el crRNA y el complejo Cas12a-crRNA se une con el ADN objetivo, lo que desencadena la escisión colateral de CRISPR/Cas12a en las sondas reporteras de ssDNA. El fluoróforo en el reportero se libera y la fluorescencia es detectada por un lector de placas comercializado o el SPM que construimos. Se utilizan tres modelos diferentes de aprendizaje profundo, incluidos AlexNet, DenseNet-121 y EfficientNet-B7 con aprendizaje por transferencia, para clasificar las imágenes de fluorescencia. Esta figura es reutilizada con permiso de Lei et al.35. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

1. Procesamiento de muestras

  1. Tomemos como ejemplo el Virus de la Rana 3 (FV3, género Ranavirus, familia Iridoviridae), un virus de ADN bicatenario. Seleccione el gen principal de la cápside (mcp) como objetivo para la detección de FV3, ya que está altamente conservado y generalmente se considera el objetivo para la detección de ranavirus. La secuencia objetivo seleccionada se muestra en la Tabla 1.
    NOTA: Frog Virus 3 se toma como ejemplo en este protocolo.
  2. Para la preparación de fragmentos de ADN diana, utilice fragmentos de ADN del gen mcp de FV3 y del virus infeccioso del bazo y la necrosis renal (ISKNV, otro ranavirus).
    NOTA: En este estudio, los fragmentos de ADN objetivo se obtuvieron comercialmente de una empresa que figura en la Tabla de Materiales. Se consideran como el objetivo y el control de la detección posterior.
NombreSecuencia
FV3 MCPNTS: 5' ... gtaacccggctttcGGGCAGCAGTTTCGGTCGGCGTtcccaggtcg... 3' (240 bp)
TS: 5' ... ccgacctgggaACGCCGACCGAAACTGCTGCCCtgctgcccgaaagc... 3' (240 bp)
ISKNV MCPNTS: 5' ... ggccatgccaatttTGGGCAGGAGTTTAGTGTGACGgtggcgaggg... 3' (231 pb)
TS: 5' ... ccctcgccaccgtcACACTAAACTCCTGCCCAAAAATtggcatggcc... 3' (231 pb)

Tabla 1: Secuencia objetivo seleccionada en este método.

2. Reacción de RPA

  1. Diseñe y sintetice los pares de cebadores RPA para la secuencia objetivo. Las secuencias de los pares de cebadores de RPA se describen en la Tabla 2.
  2. Prepare el tampón de reacción RPA 5x (Tabla 3) y MgCl2 (100 mM).
  3. Mezcle las cuatro enzimas clave de RPA (UvsX, UvsY, GP32, proteína Bsu) en el tampón de reacción RPA 1x, junto con los cebadores diseñados de antemano, como se detalla en la Tabla 4.
  4. Agita la mezcla a fondo.
  5. Añadir 1 μL del objetivo obtenido en el paso 1 para cada reacción de RPA, y mezclar bien mediante vórtice de nuevo.
  6. Añadir 7 μL de MgCl2 (100 mM) para iniciar la reacción. El volumen final de cada reacción de RPA es de 50 μL.
  7. Realice el ensayo a 37 °C durante 30 min.
  8. El producto RPA se puede almacenar a 4 °C durante unos días. A medida que los productos de RPA se degradan, utilícelos para una mayor detección lo antes posible para obtener mejores resultados de diagnóstico.
  9. [Opcional] Realizar electroforesis en gel de ADN.
    1. Retire 5 μL de productos RPA, agregue un volumen adecuado de tampón de carga de ADN 6x y realice electroforesis en gel de ADN en el tampón de trisacetato EDTA (TAE).
    2. Ejecute la electroforesis a menos de 120 V durante unos 20 minutos hasta que las bandas de tampón de carga lleguen al fondo del gel.
    3. Determine si la secuencia objetivo se amplifica con éxito a partir de la muestra comparando el tamaño de las bandas de la muestra con las bandas del marcador.
NombreSecuencia
Imprimación RPA FATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
Imprimación RPA RGGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG

Tabla 2: Imprimaciones RPA utilizadas en este método.

ComponenteConcentración originalAdición
PEG 20.000-114 mg
ATP100 mM125 μL
dNTPs25 mM48 μL
Tris-HCl1 M125 μL
TDT1 M125 μL
Fosfocreatina1 M250 μL
Creatina quinasa10 μg/μL50 μL
ddH2O-277 μL
Volumen total-1 mL

Tabla 3: Composición del tampón de reacción RPA 5x (pH 7,5).

ComponenteConcentración originalAdición
5 tampones de reacción RPA-10 μL
Proteína UvsX5 mg/mL2,6 μL
Proteína UvsY5 mg/mL0,9 μL
Proteína GP325 mg/mL2,54 μL
Proteína Bsu5 mg/mL0,88 μL
Cebador delantero100 μM0,25 μL
imprimación invertida100 μM0,25 μL
ddH2O-24,58 μL
Blanco-1 μL
*MgCl2100 mM7 μL
Volumen total50 μL
*Por último, es necesario añadir MgCl2 para iniciar la reacción de RPA.

Tabla 4: Composición de la reacción RPA.

3. Detección de CRISPR/Cas12a sin SPM

  1. Utilice los crRNAs (Tabla de Materiales) de la secuencia diana y la sonda reportera de ssDNA que conecta un fluoróforo y un extintor para CRISPR/Cas12a. Aquí, la carboxitetrametilrodamina (TAMRA) está unida como fluoróforo en los extremos 5' de las sondas reporteras de ssDNA y Black Hole Quencher-2 (BHQ2) como el extinguidor en los extremos 3'. La secuencia detallada del crRNA y el reportero de ssDNA se describe en la Tabla 5.
  2. Prepare la proteína Cas12a (LbCas12a) de la bacteria Lachnospiraceae con tampón de reacción 10x CRISPR/Cas12a.
  3. Disuelva 1 μL de producto de reacción RPA de la sección 2 en 1x tampón de reacción CRISPR/Cas12a con complejos LbCas12a-crRNA y sonda reportera de ssDNA de 500 nM en un volumen de reacción de 100 μL.
  4. Después de mezclar LbCas12a y crRNA, deje reposar la mezcla durante al menos 5 minutos para formar un complejo funcional. Después de la incubación, agregue otros componentes a la mezcla de reacción y realice toda la reacción a 37 °C. El volumen final de cada reacción CRISPR/Cas12a es de 100 μL. Las concentraciones detalladas de cada componente en cada reacción CRISPR/Cas12a se describen en la Tabla 6.
  5. Realice la reacción de detección CRISPR/Cas12a de 100 μL a 37 °C durante 30 min.
  6. Examine las señales de fluorescencia constantemente con un lector de microplacas a una longitud de onda de excitación de 535 nm y una longitud de onda de emisión de 595 nm con una ganancia de 60.
    NOTA: La detección de diferentes longitudes de onda de excitación y emisión de luz depende de la elección del fluoróforo y el extindor en las sondas reporteras de ssDNA previamente diseñadas.
  7. Para estos datos recopilados, divida el valor de control por la medición de las muestras positivas para normalizar todos los datos, luego intégrelos para un análisis de prueba t de dos muestras.
NombreSecuencia
LbCas12a crRNA para FV3uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGT
Reportero de ssDNA/5TAMRA/TTATT/3BHQ2

Tabla 5: Secuencias de crRNA CRISPR/Cas12a y reportero de ssDNA utilizadas en este método.

ComponenteConcentración originalAdición
NEBuffer r2.1-10 μL
lba cas12a (cpf1)10 μM0,5 μL
ARNcr10 μM0,625 μL
Espere al menos 5 minutos para que el complejo LbCas12a/crRNA se combine.
Reportero de ADN100 μM0,5 μL
ddH2O-87.375 μL
Blanco-1 μL
Volumen total-100 μL

Tabla 6: Composición de la reacción CRISPR/Cas12a.

4. Configuración de SPM

  1. Para la trayectoria de excitación, configure un rayo láser para que pase a través de los filtros de densidad neutra (ND) para atenuar la intensidad del láser.
  2. Genere un haz colimado a partir de una lente asférica (en lo sucesivo denominada L1) y refleje mediante el espejo dicroico (DM).
  3. Dirija la luz sobre el portaobjetos de vidrio donde se coloca la muestra a través del objetivo (20x) para iluminar y excitar la fluorescencia de la muestra. La etapa de muestreo permite un ajuste preciso del plano focal, dirigiendo el haz al plano focal posterior del objetivo. Los pasos mencionados anteriormente forman la ruta de excitación del instrumento SPM.
  4. Para la trayectoria de emisión, coloque una lente externa (en lo sucesivo denominada L2) para formar una imagen intermedia en el otro lado del objetivo. El objetivo ilumina simultáneamente la muestra y recoge la señal de emisión.
  5. Registre la señal de fluorescencia de la muestra utilizando el teléfono inteligente ubicado al final de la ruta de emisión. Use un soporte estable para evitar temblores.
  6. Establezca un filtro de paso de banda entre L1 y la cámara del teléfono inteligente para filtrar la luz excitada y permitir que solo la luz emitida por la muestra llegue a la cámara, lo que puede optimizar la detección.
  7. Inmovilice la configuración de SPM en una placa de pruebas para una implementación portátil.
    NOTA: En la Figura 2 se muestra el esquema y el aspecto físico del dispositivo SPM para la detección de fluorescencia basado en la reacción RPA-CRISPR/Cas12a. La detección de CRISPR/Cas12a se lleva a cabo en el portaobjetos de vidrio pretratado descrito en el siguiente paso.

figure-protocol-1
Figura 2: Aspecto esquemático y físico del dispositivo SPM utilizado para la detección de fluorescencia. (A) El aspecto físico del dispositivo SPM para la recogida de imágenes de fluorescencia después de la reacción RPA-CRISPR/Cas12a. (B) Esquema del dispositivo SPM para la detección de fluorescencia basado en la reacción RPA-CRISPR/Cas12a. Esta figura ha sido modificada (se ha ajustado la posición y el color de la imagen) con permiso de Lei et al.35. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Tratamiento de portaobjetos de vidrio para detección con SPM

  1. Prepare el polidimetilsiloxano (PDMS) mezclando la base y el agente de curado en una proporción de 10:1, seguido de una cocción en una placa calefactora a 80 °C durante 2 h.
  2. Trate tanto el PDMS como el portaobjetos de vidrio (Longitud: 75 mm; Altura: 50 mm) con tratamiento con plasma de oxígeno durante 120 s, luego presiónelos juntos.
  3. Hornee el vaso/PDMS a 95 °C durante 2 h; está sellado permanentemente por el enlace Si-O-Si. PDMS tiene alta transparencia y no tiene autofluorescencia, lo que favorece la detección de SPM. El tratamiento del portaobjetos de vidrio y PMDS se realiza según He et al.32

6. Detección de CRISPR/Cas12a con SPM

  1. Utilice los crRNAs (Tabla de Materiales) de la secuencia diana y la sonda reportera de ssDNA que conecta un fluoróforo y un extintor para CRISPR/Cas12a. En este método, la carboxitetrametilrodamina (TAMRA) se une como fluoróforo en los extremos 5' de las sondas reporteras de ssDNA y Black Hole Quencher-2 (BHQ2) como el extinguidor en los extremos 3'. La secuencia detallada del crRNA y el reportero de ssDNA se describe en la Tabla 5.
  2. Prepare la proteína Cas12a (LbCas12a) de la bacteria Lachnospiraceae con 10x tampón de reacción CRISPR/Cas12a.
  3. Disuelva 1 μL de producto de reacción RPA de la sección 2 en 1x tampón de reacción CRISPR/Cas12a con complejos LbCas12a-crRNA y sonda reportera de ssDNA de 500 nM en un volumen de reacción de 100 μL.
  4. Después de mezclar LbCas12a y crRNA, deje reposar la mezcla durante al menos 5 minutos para formar un complejo funcional. Después de la incubación, agregue otros componentes a la mezcla de reacción y complete la reacción a 37 °C. El volumen final de cada reacción CRISPR/Cas12a es de 100 μL. Las concentraciones detalladas de cada componente en cada reacción CRISPR/Cas12a se describen en la Tabla 6.
  5. Realice la reacción de detección CRISPR/Cas12a de 100 μL en el portaobjetos de vidrio pretratado y cúbralo con un cubreobjetos. Incubar el portaobjetos de vidrio con reacción a RT durante 10 min.
  6. Mida las señales de fluorescencia por el SPM. Coloque el portaobjetos de vidrio con la reacción de detección en la etapa del SPM, mantenga una distancia adecuada, ajuste la distancia focal y la claridad, luego busque el campo de visión de la reacción y enfóquelo para capturar una imagen.
    NOTA: Primero se debe obtener una curva estándar para que los datos de las muestras se puedan escalar al rango de concentración aproximado. Se utilizan varias concentraciones de objetivos purificados, incluidos 10 nM, 1 nM, 100 pM y 10 pM, otro virus como control negativo (antes de RPA).

7. Aumento de conjuntos de datos y datos

  1. Recopile las imágenes de fluorescencia del ensayo de detección de la sección 6 como conjuntos de datos. Repita al menos tres detecciones paralelas para cada muestra a fin de garantizar el paralelismo de los datos.
    1. Se pueden aprobar algunas formas apropiadas de lograr un mayor paralelismo. Por ejemplo, al recolectar las imágenes de fluorescencia de cada muestra, enfoque manualmente y busque un campo relativamente más brillante para tomar imágenes. Al mismo tiempo, fotografíe cada muestra para obtener la señal de fluorescencia en más de cinco ubicaciones diferentes.
  2. Mida el valor medio de gris de cada imagen y la desviación estándar del valor medio de gris en un grupo de concentración por ImageJ.
  3. Establezca un rango de intensidades [mediana - desviación estándar, mediana + desviación estándar] para la limpieza de datos.
    NOTA: En las imágenes obtenidas en los primeros pasos, puede haber imágenes con grandes diferencias, por lo que es necesario cribar las imágenes. Si las intensidades de las imágenes están fuera del umbral establecido, deben considerarse valores atípicos y excluirse.
  4. Etiquete las imágenes para el objetivo purificado a concentraciones crecientes con 0-6 en orden ascendente, respectivamente.
  5. Para mejorar la robustez del sistema y evitar el sobreajuste, implemente técnicas de aumento de imagen como el volteo horizontal, el volteo vertical y el ruido aleatorio a través de funciones de transformación en Python. Esto ayuda a introducir variaciones en el conjunto de datos.

8. Transferir el aprendizaje

  1. Como red troncal, adopte el modelo de aprendizaje profundo AlexNet33 para la clasificación.
  2. Para satisfacer la restricción del modelo previamente entrenado en la sección 7, cambie la forma de las imágenes de entrada a 224 píxeles x 224 píxeles x 3 canales (altura y anchura de 224 píxeles y una profundidad de 3 canales para los canales de color rojo, verde y azul) a través de funciones de transformación en Python.
    NOTA: Este paso es un preprocesamiento común para datos heterogéneos en el aprendizaje por transferencia, incluida la transformación.
  3. Utilice una red troncal previamente entrenada con el dataset de ImageNet para extraer entidades mientras aprovecha los pesos de las capas ocultas intermedias que se aprendieron.
  4. En el contexto del trabajo de clasificación de fluorescencia, sustituya la capa final completamente conectada de la red neuronal, que originalmente incluía 1000 neuronas para la tarea ImageNet, por una capa completamente conectada con 2 o 7 neuronas.
  5. Evalúe el rendimiento del modelo de entrenamiento de configuración mediante una serie de métricas, incluida la matriz de confusión, la exactitud, la precisión, el recuerdo y la puntuación F1 basada en Lawton y Viriri34.

Resultados

Este método se centra en un sistema de detección de virus de ADN rápido, fácil de implementar, altamente sensible y en el punto de atención (POC). El diseño de pares de cebadores para la reacción RPA y el diseño de crRNA para la reacción CRISPR/Cas12a son dos de las partes esenciales, ya que afectarán a la eficiencia de la reacción RPA-CRISPR/Cas12a e influirán en la posterior detección y clasificación.

En este método, FV3 se considera un ejemplo de detección de virus de ADN. Se diseñan algunos pares de cebadores RPA para FV3, y se elige el más eficiente y se asegura de que muestre una buena eficiencia de amplificación, lo que se puede confirmar asegurando el brillo y el tamaño de las bandas a través de la electroforesis en gel de los productos RPA como se menciona en el paso 2.8. Al mismo tiempo, hemos diseñado crRNAs CRISPR/Cas12a y hemos elegido el más eficiente en función de la señal de fluorescencia más fuerte desencadenada en la reacción CRISPR/Cas12a sin RPA. En la Tabla 7 se muestra la secuencia de los tres cebadores directos y los tres cebadores retrógrados para RPA y los tres crRNA para Cas12a. Según los resultados de la electroforesis en gel de agarosa que se muestran en la Figura 3, el6º par de cebadores proporciona una mejor eficiencia de amplificación (F2 y R1), que se selecciona para el método. Como se muestra en la Figura 4, el crRNA-3 es el más eficiente para la escisión colateral, que se selecciona en el método.

Imprimación RPA F1ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACAAG
Imprimación RPA F2ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
Imprimación RPA F3TCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACAAGTGGT
Imprimación RPA R1GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG
Imprimación RPA R2GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAA
Imprimación RPA R3CGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAACG
LbCas12a crRNA-1uaauuucuacuaaguguagauATCGACTTGGCCACTTATGACAA
LbCas12a crRNA-2uaauuucuacuaaguguagauTCAAGGAGCACTACCCCGTGGGG
LbCas12a crRNA-3uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGT

Tabla 7: Los cebadores RPA y las secuencias de crRNA para la optimización de la reacción.

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Figura 3: Resultados de la electroforesis en gel de agarosa para la evaluación de la eficiencia de RPA. Las reacciones de RPA se llevaron a cabo utilizando diferentes combinaciones de cebadores en la misma condición con un objetivo purificado de 1 nM. El número 1 se consideró como la combinación de RPA-F3 y RPA-R3, 2 como RPA-F3 y RPA-R2, 3 como RPA-F3 y RPA-R1, 4 como RPA-F2 y RPA-R3, 5 como RPA-F2 y RPA-R2, 6 como RPA-F2 y RPA-R1, 7 como RPA-F1 y RPA-R3, 8 como RPA-F1 y RPA-R2, 9 como RPA-F1 y RPA-R2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 4: Detección de los fragmentos diana de FV3 con tres crRNAs diferentes por CRISPR/Cas12a. Las concentraciones de fragmentos purificados aplicados en la detección fueron de 10 nM a 100 pM de ADN objetivo frente a 10 nM de ADN de control con 30 min de incubación. Esta figura es reutilizada con permiso de Lei et al.35. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para generar los datos de la Figura 5, aplicamos cebadores de RPA optimizados, crRNA y la configuración de SPM. Para tener una mejor idea de la concentración en las muestras, amplificamos 240 pb fragmentos de ADN del gen altamente conservado de la cápside mayor (MCP) de FV3 y el virus infeccioso del bazo y la necrosis renal (ISKNV, Iridoviridae) como objetivo y control a través de un kit de amplificación de PCR, que se ejecuta con los procedimientos que se muestran en la Tabla 8. El tamaño del ADN amplificado se confirma a través de electroforesis en gel de agarosa, y extrajimos el objetivo y el control de dsDNA purificado del gel. Los fragmentos de ADN purificados se cuantifican mediante el uso de un espectrofotómetro NanoDrop 2000.

figure-results-3
Figura 5: Las imágenes de fluorescencia del ADN objetivo purificado y el ADN de control. (A) El control negativo. (B) ADN diana purificado (100 pM). Esta figura es reutilizada con permiso de Lei et al.35. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

EtapaTemperatura (°C)HoraCiclo(s)
Arranque en caliente955 minutos1
Desnaturalización9530 s35
Recocido6045 s
Extensión7230 s
Extensión725 minutos1
Almacenamiento4--

Tabla 8: Procedimiento de amplificación por PCR.

Solo como referencia, se obtiene un conjunto de datos que incluye 162 imágenes de fluorescencia después de la limpieza de datos. Es necesario ampliar el número de imágenes de fluorescencia para un análisis posterior, y entrenamos el conjunto de datos utilizando 337 imágenes de fluorescencia para la clasificación binaria y 398 para la clasificación multiclase.

Logramos la detección en alrededor de 40 minutos, incluidos 30 minutos para la amplificación de RPA y 10 minutos para la detección de LbCas12a después de RPA. Cuando se utiliza el sistema de detección desarrollado con cebadores RPA y crRNA seleccionados, la intensidad de la señal de 10 aM FV3 y control muestra diferencias significativas, como se muestra en la Figura complementaria 1.

Figura complementaria 1: Las estadísticas de la intensidad de la señal para las imágenes de fluorescencia recogidas en las reacciones RPA-LbCas12a con varias concentraciones de fragmentos purificados. *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001; : p < 0,0001; F: FV3, I: ISKNV; U.A.: Unidad de absorbancia. Esta figura es reutilizada con permiso de Lei et al.35. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En este método, desarrollamos un sistema de detección de virus de ADN POC rápido, fácil de implementar, altamente sensible, específico de secuencia y POC con asistencia de IA. Después de obtener las muestras, se aplica RPA para amplificar la secuencia objetivo, y luego CRISPR/Cas12a puede reconocer el ADN objetivo y liberar fluorescencia, lo que amplía la señal de detección. La microscopía portátil de los teléfonos inteligentes está diseñada para tomar imágenes de fluorescencia, y los modelos de aprendizaje profundo con aprendizaje por transferencia se utilizan para la clasificación binaria de las imágenes de las muestras positivas y negativas. FV3 se toma como muestra positiva en este método y luego se investiga desde múltiples perspectivas para mejorar la especificidad y sensibilidad del sistema propuesto.

La primera estrategia consiste en diseñar cebadores específicos de RPA y seleccionar los cebadores más eficientes. La eficiencia de amplificación de la reacción RPA está influenciada por diferentes cebadores36. La especificidad de los cebadores utilizados para amplificar el gen diana de las cepas de virus de ADN puede confirmarse mediante el uso comparado con la base de datos estándar de secuenciación de nucleótidos. Dado que no existe una guía para diseñar pares de cebadores de RPA eficientes, se requiere una validación experimental37.

Otro enfoque es diseñar el crRNA del virus objetivo para la reacción CRISPR/Cas12a, ya que la eficiencia de la escisión colateral contribuye significativamente a la sensibilidad de detección38,39. La fuerza de la señal de fluorescencia activada en la reacción CRISPR/Cas12a sin RPA debe tenerse en cuenta a la hora de seleccionar el mejor crRNA. Además, la actividad colateral de la proteína LbCas12a se activa constantemente durante 24 h32, lo que puede beneficiar la detección.

Con el objetivo de identificar virus y visualizar partículas virales, se ha aplicado microscopía de fluorescencia 40,41. Sin embargo, la microscopía convencional es engorrosa y costosa para el diagnóstico rápido de POC. Por lo tanto, en el sistema propuesto, se construye un SPM portátil con menos costo para obtener la señal de fluorescencia mediante la captura de las imágenes para la detección POC. Este SPM portátil cuesta mucho menos que un lector de placas comercializado o una máquina de PCR en tiempo real, que es rentable para la configuración del sistema de detección.

Esta plataforma propuesta también necesita ser mejorada en algunos aspectos. Al aplicar esta plataforma de detección a la detección de otros virus de ADN, es necesario rediseñar tanto el cebador RPA como la secuencia Cas12a-crRNA. Dado que no existe una guía para su diseño, es necesario realizar experimentos para evaluar su eficiencia. Aunque el sistema propuesto puede cumplir con las ventajas de la portabilidad, el tamaño de todo el sistema aún debe reducirse aún más para obtener uno más liviano. Dado que la cámara del teléfono móvil en sí no es fácil de enfocar para disparar a corta distancia, se necesita tiempo para ajustarla durante el proceso de obtención de imágenes fluorescentes, incluido el campo de visión, para obtener imágenes de mejor calidad.

Con los avances en la tecnología relacionada y las nuevas aplicaciones de la misma, la eficiencia en la detección de POC seguirá mejorando. El método presentado aquí es un ejemplo de una mejora que puede ayudar con la detección de POC basada en el sistema CRISPR/Cas12a y la plataforma SPM, con una novedosa asistencia de IA. Además, el sistema integrado podría utilizarse para identificar cualquier objetivo de ADN debido a la reprogramabilidad del crRNA. El sistema RPA-CRISPR/Cas12a-AI tendrá una posición importante en la identificación de patógenos de ADN en términos de sensibilidad de detección, especificidad, tiempo y fiabilidad.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China 31970752, Ciencia, Tecnología e Innovación de la Comisión de JCYJ20190809180003689, JSGG20200225150707332, JSGG20191129110812708, WDZC20200820173710001; Financiación abierta del Laboratorio de la Bahía de Shenzhen, SZBL2020090501004; Fundación de Ciencias Postdoctorales de China 2020M680023; y Administración General de Aduanas de la República Popular China 2021HK007.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Amplificación 20xOLYMPUSOPLN20X
láser verde de 532 nmThorlabsPL201con potencia de salida de 0,9 mW
Longitud de onda de corte de 535 nmcromoAT535
6x Tampón de carga de ADNThermo scientificR0611
Microplaca negra de 96 pocillosCorning Incorporated3603Negro con fondo plano y transparente
Lente asféricaLubangN/A
Filtro de paso de bandaSEMROCKFF01-542/27-25
Bsu ADN polimerasaATG BiotechnologyM103Fragmento grande
crRNASangon BiotechN/A
Fragmentos de ADNSangon BiotechN/A Soportes
dicroicosRuicageN/A
Espejo dicroicoSEMROCKFF555-Di03-25x36con una longitud de onda de corte de 535 nm
E.Z.N.A Kit de extracción de gelOmega BiotekD2500-02
EnGen Lba Cas12a (Cpf1)New England Biolabs (Beijing) LTDM0653T
PortafiltrosRuicageN/A
Fluoróforo-ssDNA-Quencher sondas reporterasSangon BiotechN/ATAMRA (carboxitetrametilrodamina) como fluoróforo en los 5 extremos; BHQ2 (Black Hole Quencher-2) como el extinguor en los 3 extremos
GP32ATG BiotechnologyM104
ImageJCódigo abiertoVersión 1.53t 24Descargado de https://imagej.nih.gov/ij/ 
Lector de microplacasSPARK, TECANN/A
Termociclador multibloque Instrumento de PCRLongGeneN/A
NanoDrop 2000/2000c EspectrofotómetrosThermo ScientificND-2000
NEBuffer r2.1New England Biolabs (Beijing) LTDB6002S10x CRISPR/Cas12a Tampón de reacción
Tratamiento con plasma de oxígeno Electro-Tecnica  Productos/A
Inactivado por patógenos, sin extracción de ácidos nucleicos, Tampón directo a PCR con proteinasa K (PINDBK)EbioPINDBK -25mL
Pares de cebadoresSangon BiotechN/A
PDMSDow CorningSylgard 184
Pares de cebadoresSangon BiotechN/A
SmartphoneHuaweiMate10
Etapas de traslaciónRuicageN/A
Filtros de densidad neutra transmitidosThorlabsND40A
Lentes acromáticas tripletesThorlabsTRH127-020-A
UvsXATG BiotechnologyM105
UvsYATG BiotechnologyM106
N

Referencias

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