Aquí, la inyección intraperitoneal de células leucémicas se utiliza para establecer y propagar la leucemia mieloide aguda (LMA) en ratones. Este nuevo método es eficaz en el trasplante seriado de células de LMA y puede servir como una alternativa para aquellos que pueden experimentar dificultades e inconsistencias con la inyección intravenosa en ratones.
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Artículo de método
Trasplante intraperitoneal para la generación de leucemia mieloide aguda en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
Existe una necesidad insatisfecha de nuevas terapias para tratar la leucemia mieloide aguda (LMA) y la recaída asociada que involucra células madre de leucemia persistente (LSC). Un modelo experimental de roedores AML para probar terapias basadas en el trasplante exitoso de estas células a través de inyecciones retroorbitarias en ratones receptores está lleno de desafíos. El objetivo de este estudio fue desarrollar un método fácil, confiable y consistente para generar un modelo murino robusto de LMA utilizando una ruta intraperitoneal. En el presente protocolo, las células de la médula ósea se transdujeron con un retrovirus que expresa la oncoproteína de fusión MLL-AF9 humana. Se probó la eficiencia de las poblaciones de linaje negativo (Lin-) y Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) como LSC de donantes en el desarrollo de LMA primaria, y se adoptó la inyección intraperitoneal como un nuevo método para generar LMA. La comparación entre las inyecciones intraperitoneales y retroorbitarias se realizó en trasplantes seriados para comparar y contrastar los dos métodos. Tanto las células Lin como las LSK transducidas con el virus MLL-AF9 humano se injertaron bien en la médula ósea y el bazo de los receptores, lo que llevó a una LMA en toda regla. La inyección intraperitoneal de células del donante estableció la LMA en los receptores tras el trasplante seriado, y la infiltración de células de LMA se detectó en la sangre, la médula ósea, el bazo y el hígado de los receptores mediante citometría de flujo, qPCR y análisis histológicos. Por lo tanto, la inyección intraperitoneal es un método eficiente de inducción de LMA mediante el trasplante en serie de células leucémicas de donantes.
Introducción
La leucemia mieloide aguda (LMA) es un tipo de neoplasia maligna hematológica de etiología diversa con mal pronóstico1. La generación de modelos animales de LMA sienta las bases para la comprensión de sus complejas variaciones y patobiología en un esfuerzo por descubrir nuevas terapias2. La leucemogénesis en ratones implica el trasplante de células donantes que expresan oncoproteínas de fusión, incluidas las fusiones que involucran el gen de la leucemia de linaje mixto (MLL) para inducir potentemente la LMA, para imitar la enfermedad en humanos3. Se han reportado varios orígenes celulares de célul....
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Protocolo
Todos los experimentos fueron aprobados previamente por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Pensilvania.
1. Preparación de tampones y reactivos
- Preparar ampicilina suplementada (AP) con placas de agar LB (placas estériles de 10 cm). Para hacer esto, disuelva 10 g de caldo LB con agar en 400 ml de agua destilada, revuelva y lleve el volumen hasta 500 ml. Esterilice la solución en autoclave, luego deje que la solución se enfríe, agregue 0.5 ml de ampicilina (stock: 150 mg / ml) en la solución y agítela para mezclar. Añadir inmediatamente 18 ml de solución a una placa est....
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Resultados
Comparación de la eficiencia del trasplante de células murinas de LMA mediante las vías de trasplante r.o. e i.p.
Anteriormente, se informó el establecimiento de 1° LMA en ratones receptores trasplantados retroorbitalmente con células LSK transducidas por MLL-AF9, y la capacidad de trasplante de células de LMA de 1° se demostró mediante trasplante seriado30. El presente estudio es el primero en evaluar la posibilidad de utilizar células Lin- de médula ósea para reali.......
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Discusión
Estos estudios descritos anteriormente proporcionan evidencia de apoyo de que el trasplante de células Lin es comparable a las células LSK en la generación de LMA murina de 1°. Además, los datos actuales también muestran que la inyección i.p. es un método eficiente y conveniente para establecer la LMA murina en comparación con la inyección intravenosa (o r.o.).
Además de las células LSK, se ha informado que otras poblaciones como el progenitor granulocítico-monocitos (GMP), el proge.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Instalación Central de Citometría de Flujo del Instituto Huck y a la Instalación Central de Histopatología del Laboratorio de Diagnóstico Animal, Departamento de Ciencias Veterinarias y Biomédicas, Universidad Estatal de Pensilvania, por brindar apoyo técnico oportuno. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Americano para la Investigación del Cáncer (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA project 4771, Número de Acceso 00000005 a K.S.P. y R.F.P.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| a-Seleccionar células competentes | Bioline | BIO-85027 | |
| Cloruro de amonio (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Gato# A-9434 | |
| Ampicilina | Sigma Aldrich | Gato# A0797 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA), fracción V— Bioproductos Gemini de grado de baja endotoxina | Cat # 700-102P | ||
| Ciprofloxacina HCl | GoldBio.com | Cat # C-861-100 | |
| DMEM, alto contenido de glucosa, sin glutamina | Gibco | Cat # 11960-044 | |
| Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Sal Disódica (EDTA-2Na), Dihidratado, Grado de Biología Molecular | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Suero Fetal Bovino - Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holotransferrina, Sigma bovino | Aldrich | Cat# T1283 | |
| Solución de insulina Sigma humano | Cat# I-9278 | ||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamina 200 mM (100×) solución | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB caldo, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Caldo con agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Ratón anti-ratón CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Interleucina-3 de ratón (IL-3) | Bioproductos de Gemini | Cat# 300-324P | |
| Interleucina-6 de ratón (IL-6) | Bioproductos de Gemini | Cat# 300-327P | |
| Factor de células madre de ratón (SCF) | Bioproductos de Gemini | Cat# 300-348P | |
| Solución de penicilina-estreptomicina, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Células Phenix-Eco (pECO) | ATCC | CRL-3214 | |
| Bicarbonato de potasio (KHCO3), granular | JT. Panadero | Cat# 2940-01 | |
| Rata anti-ratón CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Gato # 105812 | |
| Rata anti-ratón Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Ligando recombinante murino Flt3 Pepro | Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Fragmento de fibronectina humana recombinante | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reactivo | MirusBio Cat | # MIR 2705 | |
| TRI Reactivo | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Solución de Azul de Tripano, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Tripsina-EDTA (0.25%), rojo | fenolGibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoetanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Ensayos comerciales | |||
| EasySep Kit de aislamiento de células progenitoras hematopoyéticas de ratón | Tecnologías StemCell | Cat# 19856A | |
| Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad | Thermo Fisher | Gato# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR | SuperMix Quanta Bio | Gato# 95051-500 | |
| Plásmido Maxi Kit (25) | Qiagen | Gato#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato ratones | Jackson Laboratory Strain | # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J ratones& nbsp; | Cepa | de laboratorio Jackson # 002014 | |
| ratones CD45.2 C57BL6/J | Cepa de laboratorio Jackson | # 000664 | |
| Instrumentos y softwares | |||
| Adobe illustrator | Versión 25.2.3 | ||
| Citómetro de flujo BD accuri C6 | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys programa de software | Versión 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism versión 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Sistema de PCR en tiempo real | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
Referencias
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Erns....
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Reimpresiones y permisos
