Detección de alteraciones dinámicas en las proteínas de los glóbulos rojos basada en inmunotinción

Resumen

La captura de los cambios dinámicos en la activación proteica de los glóbulos rojos enucleados plantea desafíos metodológicos, como la preservación de los cambios dinámicos en los estímulos agudos para su posterior evaluación. El protocolo presentado describe las técnicas de preparación y tinción de muestras que permiten la preservación y el análisis de los cambios proteicos relevantes y su posterior detección.

Resumen

El marcaje de anticuerpos de las proteínas de los glóbulos rojos (RBC) es un método semicuantitativo de uso común para detectar cambios en el contenido general de proteínas o alteraciones agudas en los estados de activación de las proteínas. Facilita la evaluación de los tratamientos con hematíes, la caracterización de las diferencias en ciertos estados de la enfermedad y la descripción de las coherencias celulares. La detección de la activación de proteínas agudamente alterada (por ejemplo, a través de la mecanotransducción) requiere una preparación adecuada de la muestra para preservar las modificaciones proteicas que de otro modo serían temporales. El principio básico incluye la inmovilización de los sitios de unión diana de las proteínas glóbulos rojos deseadas para permitir la unión inicial de anticuerpos primarios específicos. La muestra se procesa posteriormente para garantizar las condiciones óptimas para la unión del anticuerpo secundario al anticuerpo primario correspondiente. La selección de anticuerpos secundarios no fluorescentes requiere un tratamiento adicional, incluido el acoplamiento biotina-avidina y la aplicación de 3,3-diaminobencidina-tetraclorhidrato (DAB) para desarrollar la tinción, que debe controlarse en tiempo real bajo un microscopio para detener la oxidación y, por lo tanto, la intensidad de la tinción, a tiempo. Para la detección de la intensidad de las manchas, las imágenes se toman con un microscopio óptico estándar. En una modificación de este protocolo, se puede aplicar en su lugar un anticuerpo secundario conjugado con fluoresceína, lo que tiene la ventaja de que no es necesario ningún paso de desarrollo adicional. Este procedimiento, sin embargo, requiere un objetivo de fluorescencia conectado a un microscopio para la detección de manchas. Dada la naturaleza semicuantitativa de estos métodos, es imperativo proporcionar varias tinciones de control para tener en cuenta las reacciones de anticuerpos no específicas y las señales de fondo. Aquí, presentamos tanto los protocolos de tinción como los procesos analíticos correspondientes para comparar y discutir los respectivos resultados y ventajas de las diferentes técnicas de tinción.

Introducción

Los glóbulos rojos (RBC) atraviesan el sistema cardiovascular durante 70 a 140 días, con una edad media de los glóbulos rojos de aproximadamente 115 días ^1,2. Los glóbulos rojos senescentes o dañados son eliminados de la circulación por eritrofagocitosis, un proceso de limpieza eficiente impulsado por los macrófagos³. La vida útil predeterminada de estas células es una consecuencia de la entrega de los orgánulos celulares, incluidos el núcleo, las mitocondrias y los ribosomas, durante la diferenciación^{y la} maduración. Por lo tanto, los glóbulos rojos circulantes ....

Protocolo

Los protocolos aquí descritos están alineados con la Declaración de Helsinki y fueron aprobados por los Comités de Ética de la Universidad Alemana del Deporte de Colonia (16/09/2013) y de la Universidad de Griffith (2019/808). Los voluntarios fueron examinados para garantizar la ausencia de patologías relevantes y proporcionaron su consentimiento informado por escrito.

1. Tinción de proteínas de glóbulos rojos mediante protocolos de inmunohistoquímica

NOTA: En la Tabla de Materiales se proporciona una lista detallada de los productos químicos y materiales necesarios. En las siguien....

Resultados

El protocolo presentado, que describe los métodos que facilitan la detección de alteraciones agudas en las proteínas de los glóbulos rojos, se probó en una alteración proteica mecánicamente sensible bien conocida: la fosforilación de los glóbulos rojos en el residuo de serina 1177. La sangre entera se obtuvo de voluntarios sanos y posteriormente se dividió en dos alícuotas separadas. Una muestra de sangre dada se expuso a un esfuerzo de cizallamiento mecánico de magnitud fisiológica (5 Pa) durante 300 s, que previamente .......

Discusión

La literatura reciente sugiere que la proteína RBC-NOS es de crucial importancia para la regulación de la deformabilidad de los glóbulos rojos 15,22,23^, lo que a su vez facilita su paso a través de capilares estrechos ²⁴. La actividad proteica depende en gran medida de las modificaciones proteicas postraduccionales, en particular de la fosforilación de ciertos residuos¹⁸. El foco .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
3,3′-Diaminobencidina -tetraclorhidrato de hidrato Sigma	/Merck	D5637	DAB
Cloruro de amonio	Centrífuga	101145	< > Cl
5427 R	Cubreobjetos Eppendorf	5409000010
	VWR	631-0147
Fosfato de hidrógeno di-sódico dihidratado	Merck /Millipore	106580	Na2HPO4. 2 H2O
Pipetas de transferencia desechables	VWR	612-6803
Entellan	Merck /Millipore	107961	medio de montaje rápido para microscopía
Etanol desnaturalizado con 1 % de metiletilcetona (MEK)	Hofmann	642
Glucosa-Oxidasa	Sigma/Merck	G2133
Lápiz graso	Dako	S 2002
Peroxidasa de rábano picante/ExtrAvidin− Peroxidasa	Sigma/Merck	E-2886	HRP
Ácido clorhídrico	Merck /Millipore	109057	HCl
Peróxido de hidrógeno, 30%	Merck /Millipore	107203 H	2O2
ImageJ Software	Freeware
Analizador óptico de células rotacionales asistido por láser (LORCA)	RR Mecatrónica	Ektacitómetro instrumento utilizado para el cizallamiento
Portaobjetos de microscopio	VWR	630-1985
Sulfato de níquel (II) hexahidratado	Sigma/Merck	N4882	NiSO4.6H2O
Suero de cabra normal	Agilent/DAKO	X0907	NGS
Paraformaldehído Merck	/Millipore	818715	Pipetas PFA
Eppendorf Referencia 2	VWR	613-5836/ 613-5839
Anticuerpo eNOS antifosfo-fosfo de conejo (Ser1177)	Merck/Millipore	07-428-I	anticuerpos primarios
, 2 ml	Eppendorf	30120094
Anticuerpo secundario anti conejo	de cabra Agilent/DAKO	E0432	Anticuerpo secundario
Leche desnatada en polvo	Bio-Rad	170-6404
Cloruro de sodio	Merck /Millipore	106404	NaCl
Dihidrógeno Fosfato de Sodio Monohidrato	Merck /Millipore	106346	NaH2PO4. H2O
Hidróxido de sodio, 1 M	Merck /Millipore	150706	NaOH
Tris(hidroximetil)-aminometano	Merck /Millipore	108382	Tris
Tripsina	Sigma/Merck	T7409
Tween20	Merck /Millipore	822184
Whatman Filtro de microfibra Glas, calidad GF/F	Merck /Millipore	WHA1825047
Xylol	VWR Chemicals	2,89,73,465
ß-D-Glucosa monohidrato	Merck /Millipore	14431-43-7