Modelos volumétricos simplificados como estrategia efectiva para segmentar redes de actina en tomografías crioelectrónicas

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para colocar modelos volumétricos simplificados en volúmenes 3D tomográficos ruidosos y complejos. Esto permite la segmentación rápida de las densidades de los filamentos de actina, la detección de la flexión sistemática del filamento y de los huecos en los filamentos del haz piloso, así como la cuantificación conveniente de las propiedades volumétricas del modelo, como las distancias.

Resumen

Los métodos eficientes para la extracción de características de interés siguen siendo uno de los mayores desafíos para la interpretación de tomografías crioelectrónicas. Se han propuesto varios enfoques automatizados, muchos de los cuales funcionan bien para conjuntos de datos de alto contraste en los que las características de interés se pueden detectar fácilmente y están claramente separadas entre sí. Nuestros conjuntos de datos de tomografía crioelectrónica de estereocilios del oído interno se caracterizan por una densa matriz de filamentos de actina empaquetados hexagonalmente que con frecuencia están conectados entre sí. Estas características hacen que la segmentación automatizada sea muy desafiante, agravada aún más por el entorno de alto ruido de los tomogramas crioelectrónicos y la alta complejidad de las características densamente empaquetadas. Utilizando el conocimiento previo sobre la organización del haz de actina, hemos colocado capas de un modelo de actina de bola y palo altamente simplificado para obtener primero un ajuste global al mapa de densidad, seguido de ajustes regionales y locales del modelo. Demostramos que la construcción de modelos volumétricos no solo nos permite lidiar con la alta complejidad, sino que también proporciona mediciones y estadísticas precisas sobre el haz de actina. Los modelos volumétricos también sirven como puntos de anclaje para la segmentación local, como en el caso de los conectores cruzados actina-actina. La construcción de modelos volumétricos, particularmente cuando se aumenta aún más con enfoques de ajuste automatizados basados en computadora, puede ser una alternativa poderosa cuando los enfoques convencionales de segmentación automatizada no tienen éxito.

Introducción

La criotomografía electrónica permite visualizar orgánulos enteros o partes de células y tejidos a resoluciones nanométricas en su estado casi nativo ^1,2,3 utilizando la congelación por inmersión⁴ o la vitrificación ultrarrápida por congelación a alta presión⁵. Dado que solo una dosis limitada de electrones puede ser tolerada por la muestra criopreservada, sin teñir e hidratada congelada, los datos tomográficos en 3D son muy ruidosos. Este ruido a menudo se puede reducir significativamente mediante una variedad de algoritmos de filtrado de ruido ^6,7, incluida la difusión anisotrópica no lineal⁸, el filtrado bilateral⁹ y el filtrado mediano recursivo¹⁰.

Además, las limitaciones de inclinación de la platina del microscopio, que dan lugar a la falta de información, y el hecho de que el grosor de la muestra aumenta a ángulos de inclinación altos, conducen a reconstrucciones 3D con resolución anisotrópica. Esto significa que la densidad se difumina en la tercera dimensión debido a la menor resolución en la dirección Z. Como resultado, la forma de las macromoléculas aparece distorsionada (es decir, menos definida y alargada en la tercera dimensión).

Entre los mayores desafíos en la interpretación de los datos tomográficos se encuentra la extracción automatizada de las características relevantes, también conocida como segmentación¹¹. Con suficientes características de forma únicas y bajo nivel de ruido, las máquinas macromoleculares en volúmenes 3D complejos se pueden identificar mediante la coincidencia de plantillas 12,13,14; Sin embargo, el éxito de la coincidencia de plantillas depende de la resolución del tomograma, de un modelo de búsqueda adecuado, así como de las características de tamaño y forma de los volúmenes de características. Si las características de interés están suficientemente espaciadas y los motivos repetitivos (como las grandes máquinas macromoleculares) se pueden identificar fácilmente, los subvolúmenes del tomograma se pueden combinar para aumentar la relación señal-ruido y promediar las distorsiones de la forma de las partículas individuales. Se ha descrito la segmentación automatizada de una red de filamentos de actina en tomografías electrónicas del borde delgado de células de Dictyostelium discoideum hidratadas congeladas mediante la coincidencia de plantillas¹⁵.

Sin embargo, si las características de interés están muy espaciadas, la anisotropía de la resolución de los datos puede conducir a una mancha de las densidades del mapa en la dirección Z (a lo largo de la dirección del haz de electrones), lo que resulta en una fusión aparente de la envolvente de densidad de máquinas macromoleculares muy espaciadas o complejos supramoleculares. En tales casos, es posible que los enfoques automatizados para la segmentación, como la cuenca hidrográfica¹⁶, la segmentación de límites¹⁷ o una variedad de enfoques de clasificación basados en el aprendizaje automático^18,19, no puedan reconocer las características de interés o establecer un límite correcto alrededor de un objeto de interés. A menudo, uno termina con unas pocas piezas muy grandes o con un volumen muy segmentado, donde se necesita mucho esfuerzo para fusionar muchas piezas pequeñas hasta que se perciba que la característica de interés está completa. Esta curación manual de los resultados de la segmentación puede ser muy laboriosa e incluso puede fracasar por completo cuando la estructura de interés es una matriz de filamentos muy espaciados que están interconectados a través de enlaces cortos. En esta gigantesca red de estructuras filamentosas, puede ser difícil orientarse. Esto se debe a que, debido a la anisotropía de resolución, las densidades parecen mezclarse entre sí, lo que presenta un desafío formidable tanto para los enfoques de segmentación manual automatizados como para los interactivos. Como consecuencia, uno puede "saltar" fácilmente entre filamentos cuando solo inspecciona visualmente regiones pequeñas.

Afortunadamente, en el caso del haz de actina en los estereocilios de las células ciliadas del oído interno, tenemos conocimiento sobre la organización general del haz de actina y la direccionalidad de los filamentos de actina^20,21. El haz de actina consta de cientos de filamentos de actina hexagonalmente densamente empaquetados de 6-8 nm de diámetro, que están espaciados entre sí unos 12-13 nm entre sí.

Esto nos permitió adoptar un enfoque bastante diferente de la segmentación que se basa en modelos simplificados de bola y palo para representar filamentos de actina. La estrategia consistió en colocar simultáneamente una matriz regular idealizada de modelos de filamentos en losas de los mapas de densidad de tomografía crioelectrónica para construir un modelo 3D del haz de actina capa por capa. Nos aseguramos de que el modelo tuviera un ajuste general al mapa de densidad antes de realizar ajustes locales en modelos de filamentos individuales o grupos de modelos de filamentos para que coincidan estrechamente con el mapa de densidad. Mediante la codificación automática por colores del valor de densidad del mapa en la ubicación del modelo de filamento, pudimos detectar fácilmente las brechas aparentes en el haz de actina. Los modelos volumétricos permiten un análisis cuantitativo de las propiedades volumétricas, como las distancias entre los filamentos de actina, y también conducen a una visualización simplificada de la organización general de la red filamentosa en 3D.

Además, los modelos también pueden servir como estructuras de anclaje para la segmentación de características adicionales, como los enlazadores actina-actina, ya que se pueden seleccionar (partes de) modelos de filamentos individuales, alrededor de los cuales se pueden generar zonas de densidad de mapa de radio adecuadas para la inspección y posterior segmentación.

Creemos que nuestro enfoque de segmentación basado en modelos volumétricos es particularmente útil para grandes redes de estructuras filamentosas que pueden contener brechas y conexiones cruzadas entre filamentos. Los algoritmos de segmentación tienden a operar localmente, mientras que el cerebro humano tiene en cuenta áreas más grandes y, por lo tanto, es superior a las computadoras cuando se trata de reconocer estructuras de filamentos, incluso en un entorno complejo y de alto ruido.

Protocolo

El protocolo sigue las directrices del comité de ética de investigación en seres humanos de la Universidad del Sureste.

1. Fuente de datos de tomografía crioelectrónica para la construcción de modelos volumétricos

NOTA: Las reconstrucciones crio-electrónicas de estereocilios utilizadas para un edificio de modelos volumétricos han sido publicadas previamente^22,23 y se obtuvieron según lo descrito por Metlagel et ^al.22.

Los scripts de python de UCSF Chimera para el modelado de estereocilios se proporcionan en el Archivo Suplementario 1, el Archivo de Codificación Suplementario 1, el Archivo de Codificación Suplementario 2, el Archivo de Codificación Suplementaria 3, el Archivo de Codificación Suplementaria 4 y el Archivo de Codificación Suplementaria 5.

1. Brevemente, borre los estereocilios de la superficie apical del epitelio sensorial del utrículo del ratón en la película de soporte de carbono de encaje de una rejilla de microscopio electrónico (EM). A continuación, realice la vitrificación ultrarrápida por congelación por inmersión y la recopilación de datos de tomografía crioelectrónica de un solo eje en una microscopía electrónica de transmisión criogénica (crio-TEM), operada a 300 kV con un desenfoque nominal de 3,5-4,5 μm, utilizando una cámara de tipo CMOS en modo de integración, con un tamaño de píxel de 0,47 a 0,59 nm (ver Tabla de Materiales).
2. Una dosis típica para la recopilación de datos de un solo eje suele ser de 80-100 electrones/Ų. Reconstruya los volúmenes 3D del tomograma utilizando el paquete de software IMOD²⁴, ya sea mediante retroproyección ponderada o el método SIRT ^25,26.
3. Elimine el ruido de los tomogramas utilizando el filtrado recursivo mediano o bilateral en Priism²⁷ o la opción de difusión anisotrópica no lineal en IMOD.
   NOTA: El paquete de software clave utilizado para la visualización interactiva, la construcción de modelos volumétricos y el análisis cuantitativo fue el software UCSF Chimera^28,29. Todos los paquetes de software utilizados se enumeran en la Tabla de materiales.

2. Preparación de datos de tomografía crioelectrónica para la construcción de modelos volumétricos

1. Rotación del tomograma
   NOTA: El propósito de este paso es encontrar los "ángulos óptimos" en los que el núcleo de actina está alineado en dos de los tres ejes (x y z), de modo que la colocación de los modelos en 3D se pueda hacer con un solo eje del que preocuparse. Los siguientes pasos se llevan a cabo dentro del paquete de software IMOD.
   1. Abra 3dmod (IMOD) y abra el archivo de pila de imágenes 3D en formato de archivo .mrc. Asegúrese de que la pila 3D esté en modo de escala de grises de 16 bits y muestre las dimensiones X, Y, Z correctas en el encabezado del archivo de imagen. Si es necesario, realice correcciones utilizando el comando alterheader : alterheader -d (x_pixelspacing),(y_pixelspacing),(z_pixelspacing) inputfilename.mrc en el símbolo del sistema. Si la pila 3D está en formato de archivo TIFF, utilice el comando tif2mrc inputfilename.tif outputfilename.mrc en el símbolo del sistema para crear un archivo .mrc.
   2. Inspeccione visualmente el tomograma y abra el "cortador" (presionando la barra invertida "\") para encontrar los mejores ángulos de rotación en las dimensiones X, Y y Z para la alineación del plano de filamento de actina con el plano Z. Manipule la rotación X, la rotación Y, la barra de rotación Z para averiguar el ángulo óptimo en el que se alinean los filamentos de actina en los planos X y Z. Tenga en cuenta que cambiar el grosor promedio para la visualización del tomograma (Grueso: Img) puede ayudar a encontrar una cantidad ideal de promedio de la densidad en el plano Z y, por lo tanto, aumentar el contraste. Acérquese y aléjese del tomograma utilizando las teclas + y -, respectivamente, en el teclado.
   3. Una vez que se hayan identificado los ángulos ideales para la rotación, gire el tomograma escribiendo el comando IMOD rotatevol -a (Z ángulos de rotación),(Y ángulos de rotación),(X ángulos de rotación) -s (x-ancho),(y-altura),(z-profundidad) inputfilename.mrc outputfilename.mrc en el símbolo del sistema. Asegúrese de dejar al mapa suficiente espacio para acomodar la rotación para evitar cortar partes del mapa durante la rotación.
      NOTA: Para obtener más información sobre cómo utilizar el comando rotatevol, utilice la opción del menú de ayuda o visite la siguiente URL (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/man/rotatevol.html). Este comando (rotatevol) no altera el mapa que se muestra actualmente en la ventana IMOD, sino que crea un nuevo archivo de mapa con un mapa de densidad que se está girando.
   4. Con la ventana de segmentación, identifique las coordenadas X, Y y Z de dos esquinas opuestas de un mapa para identificar la región de recorte que contiene el estereocilio mediante el comando trimvol .
   5. Utilice el comando IMOD Trimvol para recortar el mapa en las coordenadas obtenidas anteriormente, escribiendo trimvol -x (x-coordiante 1),( x-coordiante 2) -y (y-coordiante 1),( y-coordiante 2) -z (z-coordiante 1),( z-coordiante 2) inputfilename.mrc outputfilename.mrc en el símbolo del sistema. Ahora, el mapa es mucho más pequeño y, por lo tanto, es más fácil y rápido trabajar con él a partir de este punto.
      NOTA: Para obtener más información sobre cómo utilizar el comando trimvol, utilice la opción del menú de ayuda o visite la siguiente URL (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/man/trimvol.html). Estos pasos crean un archivo .mrc que se ha girado y recortado.
2. Filtrado de tomografías
   NOTA: Este paso utiliza un filtro de difusión anisotrópica no lineal (NAD) proporcionado por IMOD para la reducción de ruido. Se utilizaron como valor inicial los recomendados en la página de ayuda del IMOD para el filtrado de difusión anisotrópica no lineal, tal y como se indica en la siguiente URL (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/NADexample.html), y se utilizaron como valores iniciales.
   1. Escriba etomo en el símbolo del sistema para iniciar la interfaz gráfica de usuario de etomo de IMOD.
   2. Seleccione la opción Difusión anisotrópica no lineal en el menú de etomo y seleccione el archivo de mapa (Elegir un volumen).
   3. Para encontrar un valor K y el número de iteraciones que proporcionan los mejores resultados de filtrado, a juzgar por la inspección visual, aplique el filtro NAD a un volumen de prueba más pequeño para extraer el volumen de prueba del filtro NAD especificado. Haga clic en la herramienta Rubberband en la parte superior de la interfaz 3dmod, haga clic con el botón izquierdo del ratón arrastrando para seleccionar el volumen de prueba y haga clic en los botones Hi y Lo para indicar que el Z-slice es el límite del volumen de prueba (Obtener rango de volumen de prueba de 3dmod). Extraiga el volumen de prueba haciendo clic en Extraer volumen de prueba.
   4. Filtre el volumen de prueba utilizando varios valores K (Buscar un valor K para el volumen de prueba > Lista de valores K), como 0,1, 1,5, 10, 15, 25, 30, 50 y 75. Realice el filtrado de NAD con cada uno de los valores K especificados (Ejecutar con diferentes valores K > Ver los resultados de la prueba de diferentes valores K). Utilice la ventana de segmentación para evaluar el rendimiento del filtro NAD y seleccione un valor K que se utilizará para filtrar todo el volumen.
   5. Utilice el valor K identificado en el paso 2.2.4 y pruebe diferentes números de iteraciones, como 2, 5, 8, 11, 15 y 21 (Buscar un número de iteración para el volumen de prueba > Lista de iteraciones). Evalúe el rendimiento del filtro NAD para diferentes iteraciones haciendo clic en Ver resultados de pruebas de diferentes iteraciones o utilizando una herramienta de segmentación. Elija un valor para un número diferente de iteraciones.
   6. Utilice el valor K identificado y el número de iteraciones (Filtrar volumen completo > valor K e Iteraciones) y filtre todo el volumen (Filtrar volumen completo). Aparecerá un volumen recién filtrado en el mismo directorio donde se encuentra el volumen completo cargado con una extensión de archivo .nad adjunta al archivo .mrc.
      NOTA: Estos pasos crean un archivo .mrc que se ha filtrado con un filtro NAD y muestra un ruido más bajo y, por lo tanto, una relación señal-ruido mejorada.

3. Construcción de modelos volumétricos

1. Preparación de la colocación del modelo 3D
   NOTA: El propósito de este paso es preparar y analizar el mapa para colocar modelos volumétricos 3D en el mapa de densidad rotado y sin ruido utilizando el programa Chimera de UCSF.
   1. Utilizando la ventana de segmentación, obtenga una vista de sección transversal (losa de 30 cortes/28,4 nm) para identificar las coordenadas Z del centro de la losa de densidad, en la que se colocará el modelo de filamento de actina. Haga clic en el centro de la densidad del filamento y observe las coordenadas Z en la ventana principal del IMOD.
   2. Tome nota de las coordenadas identificadas para la futura colocación del modelo en UCSF Chimera.
      NOTA: Las coordenadas Z anotadas en este paso se utilizan durante el paso 4 para encontrar y colocar fácilmente modelos de filamento de actina prefabricados a las alturas Z correctas, lo que hace que la colocación del modelo sea más rápida.
2. Colocación de modelos 3D
   NOTA: El propósito de este paso es colocar un modelo volumétrico 3D en el mapa de densidad preparado utilizando UCSF Chimera.
   1. En UCSF Chimera, abra el mapa filtrado y girado (Archivo > Abrir)
   2. Compruebe si los parámetros del mapa están configurados correctamente seleccionando Entidades > Planos y Coordenadas > Entidades en el Visor de volúmenes para abrir la interfaz de entidades y coordenadas. Compruebe Tamaño de vóxel para ver si se establece el espaciado de vóxel correcto mediante el comando header en el símbolo del sistema (en IMOD). Si no es así, corrija la interfaz Tamaño de vóxel al espaciado de vóxel correcto. Centre el mapa para colocar la cámara en el centro de la ventana de visualización (Índice de origen > Centro).
   3. Abra la ventana Control de cámara (Herramientas > Control de visualización > cámara). A continuación, establezca la visualización de la cámara en la vista ortográfica (proyección > ortográfica)
   4. Cargue el modelo de script de python prefabricado (Archivo > Abrir > ActinFilamentPlane.py) y abra tantos scripts de plano de filamento de actina como planos de filamento de actina haya en el mapa.
   5. Reubique los modelos cargados activando el modo de movimiento del ratón (Herramientas > movimiento > modo de movimiento del ratón). Habilite la opción de movimiento del mouse (Establecer modo de movimiento del mouse > Selección de movimiento). Utilice Ctrl + Arrastrar para seleccionar varios modelos presentes en la sesión y haga clic con el botón derecho (o cualquier otra tecla especificada en Preferencias > Ratón) para mover los modelos en la dirección deseada.
      NOTA: Los modelos han sido creados con bolas y palos con cierto grosor (radio de ActinFilamentPlane.py escritura) y con ciertos espaciados (Lattice_Spacing de ActinFilamentPlane.py escritura).
   6. Para visualizar solo el modelo que le interesa, abra el Panel Modelo (Herramientas > Controles generales > Panel Modelo). Haga clic en las casillas de verificación debajo de S (Mostrar) para habilitar o deshabilitar la visibilidad de un modelo determinado.
   7. Active el panel de línea de comandos (Herramientas > Controles generales > línea de comandos).
   8. Después de colocar cada modelo de plano de filamento de actina a su altura Z adecuada, elimine cualquier exceso de filamentos de actina en cada modelo de plano de filamento de actina seleccionando la parte excesiva de los modelos y escribiendo del sel (Eliminar seleccionado) en la línea de comandos en la parte inferior de la ventana de vista principal de UCSF Chimera.
   9. Visualice solo un plano de filamento de actina a la vez, yendo a la ventana del Panel de modelos y seleccionando y ocultando todos los demás modelos de filamento de actina (Ctrl + Clic > Ocultar).
   10. Para visualizar las partes de la densidad del mapa que se encuentran en las proximidades inmediatas del modelo de plano de filamento de actina único de interés, seleccione el modelo (Panel Modelo > seleccione) y abra el panel de control de zona en Visor de volumen (Visor de volumen > Entidades > Zona). Establezca el radio de la zona en 100 Å y, a continuación, haga clic en Zona para zonificar el mapa en un radio de 100 Å (= 10 nm) desde el modelo seleccionado. Tenga en cuenta que la dimensión en Chimera se establece en Angstrøm (1 Å = 0,1 nm).
   11. Si es necesario, ajuste el modelo para que se ajuste al mapa de densidad activando el modo de movimiento del ratón. Seleccione varias veces los modelos que no estén en la posición correcta para mover los modelos para que se coloquen correctamente dentro del mapa de densidad por zonas.
   12. Para superar un error de programación en ActinFilamentPlane.py, ejecute el script FixingMarkerID.py , que corrige el MarkerID que falta de los "átomos" (bolas en el modelo de bola y palo). Seleccione todo el modelo y escriba runscript FixingMarkerID.py en la línea de comandos (el script debe especificarse mediante el directorio correcto, como C: \ directorio \ Script.py).
   13. Si el mapa de densidad indica que el filamento de actina está curvado, asegúrese de dividir el filamento recto de actina en varias partes para adaptarse a la curvatura seleccionando los modelos deseados y escribiendo el número de dividelinks.py runscript. Los marcadores adicionales (especificados por el número en el comando) se colocan dentro del modelo de actina equidistantes entre sí, formando "articulaciones" donde se puede doblar el modelo.
   14. Ajuste las articulaciones para reflejar la curvatura moviendo "articulaciones" de marcadores adicionales a lo largo del mapa zonificado mediante el modo de movimiento del ratón. Agregue marcadores adicionales al modelo según sea necesario mediante el dividelinks.py script.
   15. Para verificar que todos los filamentos de actina están colocados correctamente dentro de las densidades de actina, use barras de recorte haciendo clic en Herramientas > Control de visualización > cámara en el menú desplegable UCSF Chimera para abrir la ventana Control de la cámara , luego seleccione Vista lateral para ver las dos barras de recorte (planos de recorte cercanos y lejanos) de la cámara. Arrastre dos barras amarillas en una ranura estrecha haciendo clic con el botón izquierdo y arrastre la parte de recorte usando el botón central del mouse para inspeccionar los modelos un poco a la vez.
       NOTA: El modelo central de actina de estereocilio ya está completo.
3. Segmentación de membranas
   NOTA: El propósito de este paso es crear un modelo de superficie de la membrana de los estereocilios.
   1. La segmentación de superficies utiliza la herramienta Volume Tracer (Herramientas > Volume Data > Volume Tracer).
   2. En la ventana Volume Tracer , haga clic en Mouse y marque solo las opciones Colocar marcadores en planos de datos y Vincular nuevo marcador al marcador seleccionado. Esto permite colocar con precisión los marcadores en el mismo plano Z (cuando se muestra un solo plano Z). También marque Colocar marcadores usando el botón central del mouse en la ventana Rastreador de volumen .
   3. Cree un nuevo conjunto de marcadores (Archivo > Nuevo conjunto de marcadores). El conjunto de marcadores 1 debe crearse y seleccionarse en la ventana Volume Tracer .
   4. Utilice el Visor de volumen para mostrar planos Z individuales en la ventana de visualización principal (Eje a Z > Uno).
   5. Con el botón central del ratón, trace la membrana de un extremo de la membrana visible a otro. Todos los marcadores deben estar conectados por enlaces de un extremo a otro.
   6. Anule la selección del último marcador colocado presionando Ctrl + clic en el fondo donde no se encuentra ni un solo elemento seleccionable. Esto asegura que el siguiente marcador que se va a colocar esté conectado con enlaces en el nuevo plano, y no con una traza de membrana anterior de otro plano Z.
   7. Repita el trazado de la membrana cada 10 nm en la misma dirección de trazado desde un extremo de la membrana visible hasta el otro lado.
   8. Una vez que se hayan segmentado muchas bandas paralelas de membranas, vaya a la ventana Volume Tracer y haga clic en Características > superficies. Esto habilita la interfaz de superficie en la ventana Volume Tracer . Haga clic en Crear junto a la interfaz Superficies para crear superficies entre bandas de segmentación de membrana. Esto crea una solapa delgada del modelo de superficie que rellena los trazos de membrana espaciados.
      NOTA: La creación del modelo de superficie de membrana de estereocilio ya se ha completado.
4. Modelado de reticulación
   NOTA: El propósito de este paso es modelar los reticulantes entre filamentos de actina.
   1. Los reticulantes también se pueden colocar utilizando la herramienta Volume Tracer .
   2. En la ventana Volume Tracer , haga clic con el botón izquierdo para marcar solo Colocar marcadores en superficies y Vincular nuevo marcador al marcador seleccionado. Luego, marque Colocar marcadores usando el botón central del mouse en la ventana Volume Tracer .
   3. Visualice únicamente las densidades alrededor del modelo de plano de filamento de actina único de interés mediante la función de zona. Establezca el radio de la zona en 100 Å para visualizar el mapa dentro de un radio de 100 Å desde el modelo seleccionado.
   4. Coloque marcadores a través de las densidades visibles de los reticulantes haciendo clic en el botón central del ratón. Una vez que se colocan dos marcadores (y, por lo tanto, se modela un solo reticulante), asegúrese de anular la selección del segundo marcador para evitar que los enlaces se conecten continuamente al siguiente modelo de reticulante.
   5. Repita los pasos anteriores para cada plano de filamento de actina y repita todo el proceso anterior en las tres direcciones principales en las que se pueden ubicar los reticulantes. Al zonificar los planos de filamento de actina en la dirección diagonal, seleccione manualmente los modelos de filamento de actina individualmente.
      NOTA: Para cada uno de los modelos de reticulantes de actina, podemos registrar la posición en los filamentos de actina a los que se conectan los reticulantes putativos. Esta información podría, en principio, extraerse para un análisis de seguimiento utilizando el promedio de subtomografía, que está fuera del alcance de este estudio.

4. Análisis cuantitativo del modelo 3D

1. Análisis de brechas
   NOTA: El propósito de este paso es detectar espacios en los filamentos de actina.
   1. Los elementos seleccionados se pueden analizar. Especifique sus parámetros, como su color, utilizando la herramienta Inspeccionar selección (Acción > Inspeccionar).
   2. El color del elemento seleccionado se puede especificar seleccionando cualquier elemento seleccionable en UCSF Chimera y cambiando el color junto a la sección Color de la ventana Inspeccionar selección .
   3. Especifique el tamaño de los marcadores y vínculos seleccionando los marcadores y vínculos en UCSF Chimera y cambiando los valores junto a la sección de radio de la ventana Inspeccionar selección , donde las unidades están en Angstrøm.
   4. Realice análisis de brechas mediante la detección automática de brechas de densidad, utilizando la función Valores en las posiciones de los átomos (Herramientas > los valores de los datos de volumen > en las posiciones de los átomos).
   5. Seleccione el mapa en el que se leerán los valores seleccionando el mapa deseado junto a la sección Datos de volumen de la ventana Valores en posiciones de átomos . Seleccione el modelo en el que se asignará un parámetro a todos los marcadores seleccionando el modelo deseado junto a la sección Molécula .
   6. Con el botón Histograma en la parte inferior de la ventana Valores en Posiciones de átomos , se crea un histograma en una nueva ventana denominada Renderizar/Seleccionar por atributo. Ctrl + clic en el histograma se agregarán o eliminarán puntos de corte, para los cuales se pueden seleccionar diferentes colores. Desmarque Mantener opaco para aplicar un color transparente a la escena. Los marcadores con una densidad por debajo de un umbral dado, que representa espacios, no solo se pueden colorear, sino que también se pueden seleccionar y, por lo tanto, nos permiten contar los marcadores numéricos en la región del espacio. Para seleccionar, haga clic en Seleccionar > atributo > value_mapname.
2. Determinación de las distancias entre interacciones
   1. Para medir distancias entre actuaciones, coloque marcadores en un solo plano XZ (denominado en UCSF Chimera como un plano Y) utilizando la ventana Volume Tracer , haciendo clic en Mouse y marcando solo Colocar marcadores en planos de datos y desactivando Vincular nuevo marcador al marcador seleccionado. Esto permite colocar con precisión los marcadores en el mismo plano Y (cuando se muestra un solo plano Z). Marque también Colocar marcadores con el botón central del ratón en la ventana Rastreador de volumen y coloque los marcadores en un plano Y de interés objetivo para la medición de la distancia entre interacciones.
   2. Una vez que las posiciones de actina de un solo plano Y se hayan marcado correctamente, seleccione todos los marcadores y escriba el comando findclash #model-spec test self overlapCutoff -200 hbondAllowance 0 log true Linewidth 10 pbColor black en la línea de comandos en la parte inferior del plano de filamento de actina. De este modo, se encuentran todas las colisiones entre marcadores dentro de una distancia de 200 Å (overlapCutoff -200) y se crean líneas negras (pbColor black) con un grosor de 10 Å (Linewidth 10) entre los marcadores.
   3. Dado que hay marcadores superpuestos dentro del rango dado de 200 Å, elimine las mediciones redundantes que no sean enlaces solo entre los marcadores adyacentes más cercanos. Para ello, utilice el script de RemoveCross.py proporcionado en el sitio web de UCSF Chimera, que elimina todos los enlaces superpuestos que no son el enlace más corto con sus marcadores adyacentes.
   4. Para medir la distancia de los enlaces que quedan, seleccione todos los pseudoenlaces (enlaces creados por findclash) y utilice el script de python pblengths.py escribiendo runscript pblengths.py. Consulte los valores medidos en el registro de respuestas (Herramientas > utilidades > Registro de respuestas). A continuación, copie los valores obtenidos del registro de respuestas y transfiéralos a una hoja de cálculo o a cualquier otra herramienta adecuada para crear un histograma.

Resultados

Utilizando tomografía crioelectrónica de estereocilios individuales no teñidos, congelados e hidratados incrustados en hielo vítreo, obtuvimos mapas de densidad del haz de actina con sus filamentos de actina dispuestos hexagonalmente, unidos por proteínas de conector cruzado²³. La dimensión de un vóxel individual era de 0,947 nm. La inspección visual en el programa de corte IMOD de una representación volumétrica de todo el tomograma (400 cortes/379 nm) indicó la presencia de estructuras filamentosas alineadas con el eje longitudinal de los estereocilios, como se puede ver en las vistas longitudinales (plano XY; Figura 1A-C, paneles superiores), así como en vistas transversales (plano XZ; Figura 1A-C, paneles inferiores). Nos dimos cuenta de que la vista de proyección a través de la red de filamentos de 400 cortes/379 nm se volvía más clara al girar el volumen reconstruido original en -6° alrededor del eje X, -13,5° alrededor del eje Y y 5° alrededor del eje Z. En este ángulo, todos los filamentos están alineados uno encima del otro, por lo que el contraste es máximo, como se puede apreciar en las vistas transversales (Figura 1B). Dado que los cortes de una sola sección transversal no tienen suficiente señal para distinguir inequívocamente los filamentos de actina, optamos por renderizar en volumen una losa de 30 cortes/28,4 nm, que muestra claramente un patrón hexagonal en la vista de sección transversal. Las líneas azules de la Figura 1C (paneles superiores) indican la posición del centro de las losas de sección transversal correspondientes de 30 rebanadas/28,4 nm en los paneles inferiores.

Pequeñas desviaciones de este ángulo de visión óptimo, en tan solo ±2°, redujeron significativamente el orden percibido de la red de filamentos de actina (Figura 1A, C), lo que es una indicación de la facilidad con la que se pierde en el volumen 3D de la tomografía.

Para ilustrar el desafío de usar enfoques de segmentación automatizados, como la segmentación de cuencas hidrográficas, elegimos un pequeño subvolumen (representado como oro) para la segmentación de cuencas hidrográficas, tal como se implementó en el paquete de software UCSF Chimera (Tools > Volume Data > Segger > Segment). La posición del subvolumen en relación con todo el mapa de estereocilios se indica mediante el pequeño recuadro de la Figura 1B.

La Figura 1D-F muestra el subvolumen elegido en diferentes orientaciones, con la Figura 1D,E que muestra la dirección de visualización longitudinal y la Figura 1F que muestra una dirección de visualización de sección transversal. Las flechas en el lado izquierdo de la Figura 1D-F indican la dirección de los filamentos de actina.

La Figura 1D-F (paneles derechos) muestra los resultados de la segmentación de cuencas hidrográficas. El subvolumen se codifica por colores según la identidad del objeto, y los colores se asignan aleatoriamente a los diferentes objetos. Diferentes colores indican una identidad de objeto diferente, por lo tanto, se hace evidente en la Figura 1D-F que las densidades del mapa para los filamentos estaban fragmentadas a lo largo del eje del filamento, mientras que el mismo color y, por lo tanto, la identidad del objeto se dieron a las densidades del mapa que conectaban los filamentos vecinos. En otras palabras, el algoritmo de segmentación de la cuenca hidrográfica no fue capaz de seguir el mapa de densidad de los filamentos de actina durante un período prolongado y, en cambio, condujo a la conexión de densidades de filamentos vecinos. Si bien es posible seleccionar manualmente la selección (por ejemplo, eliminando o fusionando objetos), este enfoque es bastante laborioso y, por lo tanto, requiere mucho tiempo.

Aunque no es absolutamente necesario para que nuestra estrategia de construcción de modelos volumétricos funcione, ayudó a reorientar (rotar) el mapa 3D para que el eje de la red de filamentos de actina se alineara con el eje Y y los planos del modelo de filamento de actina se alinearan con el plano X-Y del tomograma. Nos referimos a esta orientación como la orientación estándar para la visualización tomográfica de estereocilios.

Por lo tanto, decidimos explorar una estrategia diferente para la segmentación de imágenes, aprovechando el hecho de que los filamentos de actina mostraban una organización general regular (empaquetamiento hexagonal), con un espaciado regular y una orientación general definida del haz. Nuestra estrategia consistió en encontrar un ajuste general de los modelos de un haz de actina, como una matriz de filamentos, seguido de ajustes regionales y luego locales de la posición del modelo para ajustarse al mapa de densidad experimental. Al colocar un modelo general en primer lugar, podemos superar las ambigüedades del mapa local y detectar tendencias regionales de desviaciones del modelo de su organización original, como la flexión del filamento.

Para colocar el modelo, mostramos losas de la densidad (10 cortes/9,47 nm) en la orientación estándar que correspondía a un espesor de una sola capa de los filamentos de actina, a los que se les colocó una capa de modelos de filamentos de actina rectos y espaciados regularmente. Esto es, por supuesto, una simplificación excesiva de los filamentos de actina, cada uno de los cuales consta de una matriz lineal de monómeros de actina con simetría helicoidal. La Figura 2A-C muestra tres capas representativas a diferentes alturas Z, con las varillas de color rojo que representan los filamentos de actina. Los paneles superiores, que representan secciones transversales de ~30 rebanadas/28,4 nm de grosor, muestran a qué altura Z se colocó una capa individual de modelo de actina de 19 varillas, mientras que los paneles inferiores muestran una orientación longitudinal (aunque se muestran en perspectiva). La Figura 2D muestra el modelo simplificado completo, tanto en la vista en perspectiva transversal (panel superior) como en la longitudinal (panel inferior). La orientación de la sección transversal nos permitió posicionar los filamentos con buena confianza. En este caso, nuestro movimiento original de reorientar todo el volumen para que coincida con los ejes principales de los tomografías resultó ser útil, ya que significaba que la orientación de nuestro modelo en nuestra dirección de visualización estándar también era paralela a los ejes principales. Sin embargo, estrictamente hablando, nuestro enfoque también habría funcionado sin la reorientación del tomograma, solo la colocación del modelo a la densidad habría sido más desafiante.

Tras una inspección cuidadosa de las losas individuales del mapa de densidad, notamos que un modelo de actina perfectamente recto no se ajustaba al mapa de densidad observado que se movía desde el extremo proximal hasta el extremo distal (es decir, hacia la punta) de los estereocilios (Figura 3A-C). Cerca de la punta de los estereocilios, la densidad del mapa para los filamentos se desplazó en más de 13 nm (espaciado actina-actina), lo que pudimos compensar ajustando el modelo mientras nos movíamos de la porción proximal a la distal del mapa de densidad de estereocilios, introduciendo así una curvatura gradual pequeña pero distinguible en nuestro modelo de actina. La Figura 3D muestra una sola losa del mapa de densidad del filamento de actina, con un modelo volumétrico ajustado al mapa de densidad. En la Figura 3E se muestra una comparación entre el modelo recto (rojo) y el modelo curvo (amarillo). Esta curvatura se aprecia mejor inclinando una losa del mapa de densidad con el modelo colocado 80° alrededor del eje X, lo que permite tener una vista en perspectiva a lo largo de la dirección de los filamentos de actina (Figura 3D,E).

La desviación de los dos modelos, con la posición del modelo de actina cerca de la punta desplazada aproximadamente a la misma distancia que el espaciado de los filamentos de actina, podría haber causado mucha confusión si no hubiéramos procedido de la manera en que lo hicimos. Este posicionamiento "global" de una capa del modelo de filamento de actina, seguido de un ajuste "regional", nos permitió detectar esta curvatura, que apenas se nota en la vista longitudinal o transversal. Sin embargo, la superposición de los dos modelos, como se muestra en la Figura 3E, revela la sutil diferencia.

La repetición de este enfoque para múltiples capas permite obtener un modelo 3D completo (Figura 3F), solo limitado por la incertidumbre de los datos en la parte superior e inferior de los estereocilios, cuando se observa en la orientación de la sección transversal (Figura 3G). Esta falta de densidad es causada por la falta de cuña en la recolección de datos tomográficos (de un solo eje) y la correspondiente anisotropía de resolución de datos, y su efecto está indicado por la ausencia de una densidad de mapa bien definida para las membranas de estereocilios.

Una vez que tuvimos un modelo 3D, codificamos por colores cada ubicación del modelo volumétrico de acuerdo con el valor de densidad del mapa en esa posición. Las regiones del modelo con una densidad de mapa débil subyacente se colorearon de rojo, mientras que las regiones del modelo con una señal de densidad de mapa fuerte se colorearon de amarillo (Figura 4A). Interpretamos estas regiones de color rojo, que pueden extenderse hasta decenas de nanómetros, como brechas en las estructuras del filamento de actina que, debido a su extensión, no se pueden atribuir a las variaciones de densidad que se encuentran con frecuencia en el entorno de alto ruido de un mapa crio-EM. El ruido tiende a afectar a vóxeles individuales o a pequeños grupos de vóxeles, pero es poco probable que sea la fuente de volúmenes formados por cientos de vóxeles, para los que falta densidad de filamentos. En cambio, es probable que tales brechas sean una característica real de la malla de actina de estereocilios y pueden constituir sitios de recambio de actina. La Figura 4A tiene dos valores de densidad de mapa diferentes, que se muestran en azul claro y azul oscuro. Cabe señalar explícitamente que nuestro enfoque de construcción de modelos volumétricos, combinado con un código de colores automatizado de nuestro modelo en regiones de densidad débil, es una forma rápida y conveniente de detectar y visualizar la distribución de tales brechas en el modelo de filamento de actina, lo que habría sido muy difícil de otra manera.

Como se muestra en la Figura 4B, las partes del modelo volumétrico en ubicaciones con una densidad comparativamente débil pueden ocultarse fácilmente en función de los resultados obtenidos en la Figura 4A. Esto da como resultado un modelo más fragmentado que puede representar de manera más realista el modelo de actina en estereocilios. La alternativa de construir pequeños tramos de filamentos de actina habría sido muy laboriosa y puede haber fracasado por completo, debido a los problemas discutidos al describir la Figura 1.

Además, el modelo volumétrico nos permite modelar fácilmente los conectores cruzados simplemente colocando una conexión (mostrada en rojo) entre las posiciones de los puntos del modelo del filamento de actina a cada lado de la conexión cruzada (Figura 4C). En nuestro enfoque simplificado, no necesitamos hacer ninguna suposición sobre la identidad exacta de cada proteína de conexión cruzada, lo que requeriría una mayor resolución y/o enfoques de etiquetado sofisticados. En cambio, todo lo que necesitamos determinar es si existe una densidad que conecte los filamentos de actina adyacentes; Si lo hay, podemos colocar una conexión corta de un filamento a su contraparte adyacente. En la Figura 4D, se muestra un modelo de cinco filamentos de actina con sus conectores cruzados, lo que da una impresión de la distribución de los conectores cruzados a lo largo del eje del filamento de actina.

Otra ventaja de la construcción de un modelo volumétrico del haz de actina es que se puede determinar rápidamente el espaciado entre los filamentos de actina adyacentes (Figura 4E-H). La Figura 4E, F muestra una vista transversal del mapa de densidad sin y con un modelo ajustado a la red hexagonal de la densidad del mapa, respectivamente. La figura 4G muestra el modelo con las conexiones entre las bolas vecinas más cercanas. UCSF Chimera permite el cálculo automático de la distancia de los centros vecinos más cercanos, cuyo resultado se puede trazar como una distribución de distancia (Figura 4H). La construcción de modelos para dos conjuntos de datos adicionales se muestra en la Figura complementaria 1 y en la Figura complementaria 2.

Figura 1: Los desafíos encontrados por la segmentación de cuencas hidrográficas de tomografías de estereocilios de células ciliadas. (A-C) Proyecciones longitudinales (400 cortes/379 nm) a través del mapa tomográfico 3D en el plano XY (paneles superiores) y vistas transversales (30 cortes/28.4 nm) en el plano XZ (paneles inferiores). (A) Mapa tomográfico girado -2° a lo largo del eje Y desde su orientación óptima. (B) Mapa tomográfico en la orientación óptima, determinada por el ajuste de los ángulos de rotación de los ejes X, Y y Z (X = -6°, Y = -13,5° y Z = 5°) y que revela un alto grado de orden en el mapa de densidad, lo que sugiere una red de filamentos de actina altamente ordenada. (C) Mapa tomográfico girado +2° a lo largo del eje Y desde su orientación óptima; la rotación de tan solo 2° alrededor del eje Y lejos de la dirección de visualización óptima compromete gravemente la regularidad percibida del mapa de densidad. Los paneles inferiores revelan la regularidad de la matriz de filamentos de actina cuando se ve en la dirección de la sección transversal. La línea azul en A-C indica la posición de la losa de sección transversal. (D-F) Un cubo de 50 nm x 50 nm x 50 nm visto desde tres direcciones diferentes antes (paneles izquierdos) y después (paneles derechos) de la segmentación de la cuenca hidrográfica. Tenga en cuenta que la segmentación de cuencas hidrográficas no detecta la densidad continua de filamentos de actina, mientras que los filamentos de actina adyacentes y su conexión cruzada comparten la misma identidad de objeto, lo que sugiere que la segmentación de cuencas hidrográficas no es un enfoque adecuado para la segmentación por tomografía. En los paneles D-F, el mapa de densidad en Chimera se muestra como el estilo de mapa "Superficie". (A-C) Barras de escala = 100 nm. (D-F) Barras de escala = 50 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Construcción de un modelo volumétrico de filamento de actina de bola y palo. (A-C) Arriba: vistas transversales de 30 cortes/28,4 nm del mapa de densidad con un modelo de filamento de actina simplificado de una sola capa colocado a una altura Z diferente. Abajo: una sola losa de 10 cortes/9,47 nm del mapa de densidad con un modelo de filamento de actina simplificado de una sola capa. (D) Modelo completo de filamento recto de actina en una vista de sección transversal de 30 cortes/28,4 nm (arriba) y vista en perspectiva (abajo); Barras de escala = 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ajuste del modelo para corregir la flexión detectada de la densidad del filamento de actina. (A-C) Una inspección visual cuidadosa del modelo, ya sea en vista transversal (paneles superiores) o longitudinal (paneles inferiores), reveló un buen ajuste del modelo con el mapa de densidad en el extremo proximal de los estereocilios. Sin embargo, a medida que uno se mueve hacia el extremo distal de los estereocilios, el ajuste se vuelve cada vez peor para todos los modelos de filamento de actina. Esto se puede corregir moviendo las bolas del modelo de bola y palo a la posición correcta del mapa de densidad, lo que da como resultado un modelo de filamento de actina ligeramente curvado. El modelo recto se muestra en rojo y el modelo doblado corregido se muestra en amarillo. (D) Losa única del mapa de densidad con el modelo curvo ajustado a ella, revelando la curvatura de la densidad de actina hacia la punta de los estereocilios. El modelo de actina se ha girado 80° alrededor del eje X para mostrar mejor esta flexión sutil pero significativa de los filamentos de actina. (E) Comparación entre el modelo de actina recto y sin corregir que se muestra en rojo y el modelo de actina curvado y corregido que se muestra en amarillo. Por razones de claridad, solo se muestra una capa del modelo de filamento de actina. (De F a G) Modelo de haz de actina con filamentos de actina curvados y corregidos que se muestran en orientación longitudinal (F) y transversal (G). La membrana segmentada se muestra en azul. En el panel D, el mapa de densidad en Chimera se muestra como el estilo de mapa "Malla". Barras de escala = 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Detección de huecos en el haz de actina mediante la construcción de modelos volumétricos. Cuantificación de propiedades volumétricas mediante modelos de bola y palo. (A-C) Una pequeña región de una losa longitudinal de ~10 cortes/9,47 nm de espesor del mapa de densidad de estereocilios se muestra en azul, junto con el modelo de filamento de actina curvado y corregido. (A) El mapa de densidad se muestra en un umbral de densidad más bajo (azul claro) y un umbral de densidad más alto (azul oscuro). Hay regiones del modelo de filamento de actina para las que no existe una densidad correspondiente. En tales ubicaciones, el modelo ha sido codificado por colores rojos para representar una falta de densidad. Interpretamos estas ubicaciones como brechas en los filamentos de actina. (B) Modelo de los filamentos de actina que aparece fragmentado, lo que refleja la falta de densidad de filamentos de actina en tales ubicaciones de brecha. (C) Modelo de los filamentos de actina con enlaces de conexión cruzada (mostrados en rojo) agregados en lugares donde se encontró una fuerte densidad para unir filamentos de actina adyacentes. (D) Se muestran tres filamentos de actina modelo seleccionados con conectores cruzados a filamentos de actina adyacentes (que no se muestran para mayor claridad). Tenga en cuenta que muchas, pero no todas, las posibles posiciones de los filamentos de interacción están siendo ocupadas por proteínas conectoras; (E) Una losa transversal de 30 cortes/28,4 nm de la densidad de estereocilios. (F) Modelo de filamentos de actina ajustados a la losa de densidad de estereocilios de 30 cortes/28,4 nm de sección transversal. (G) Modelo de filamentos de actina sin la densidad del mapa subyacente. Detección automática de las distancias de los filamentos de actina vecinos más cercanos, como lo indican las conexiones delgadas entre las bolas del modelo de filamento de actina. (H) Histograma de las distancias del modelo de filamento de actina. En los paneles A-C, el mapa de densidad en Chimera se muestra como el estilo de mapa "Malla". (A-C) Barras de escala = 50 nm. (D) Barra de escala = 25 nm. (E-G) Barras de escala = 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Construcción de modelos para el primero de dos conjuntos de datos adicionales de estereocilios. (A-C) Una pequeña región de una losa longitudinal de ~10 cortes/9,47 nm de espesor del mapa de densidad de estereocilios se muestra en azul utilizando la visualización del modo de malla. El modelo colocado inicialmente se muestra en rojo y el modelo corregido se muestra en amarillo. (A) Densidad del mapa solamente. (B) Modelo inicial colocado en el mapa de densidad. (C) Modelo corregido colocado en el mapa de densidad. (D-E) Región de estereocilios más grande sin (D) y con (E), el modelo corregido se ajustó a una losa longitudinal de ~10 cortes/9,47 nm de espesor del mapa de densidad de estereocilios. (De F a G) Se muestra toda la región del tomógrafo de estereocilios. (F) Mapa solamente. (G) Mapa con el modelo corregido. (H) Superposición de los modelos inicial y corregido. Barras de escala = 100 nm Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Construcción de modelos para el segundo de dos conjuntos de datos adicionales de estereocilios. (A-C) Una pequeña región de una losa longitudinal de ~10 cortes/9,47 nm de espesor del mapa de densidad de estereocilios se muestra en azul utilizando la visualización del modo de malla. El modelo colocado inicialmente se muestra en rojo y el modelo corregido se muestra en amarillo; (A) Densidad del mapa solamente. (B) Modelo inicial colocado en el mapa de densidad. (C) Modelo corregido colocado en el mapa de densidad. (D-E) Región de estereocilios más grande sin (D) y con (E), el modelo corregido se ajustó a una losa longitudinal de ~10 cortes/9,47 nm de espesor del mapa de densidad de estereocilios. (De F a G) Se muestra toda la región del tomógrafo de estereocilios. (F) Mapa solamente. (G) Mapa con el modelo corregido. (H) Superposición del modelo inicial y corregido. Barras de escala = 100 nm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 1: Scripts de python de UCSF Chimera para el modelado de estereocilios. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Fichero de codificación suplementario 1: pblengths.py. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Fichero de codificación suplementaria 2: RemoveCross.py. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Fichero de codificación suplementaria 3: ActinFilamentPlane.py. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Fichero de codificación suplementaria 4: dividelinks.py. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Fichero de codificación suplementaria 5: FixingMarkerID.py. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Hemos demostrado que los enfoques automatizados para la segmentación, como la segmentación de cuencas hidrográficas, pueden fallar en el entorno de alto ruido y alta complejidad de las estereocilias ciliadas. Distinguir qué parte de esta red filamentosa representa filamentos de actina y qué constituye enlaces cruzados a nivel de entorno local parece, en el mejor de los casos, un desafío cuando se inspeccionan pequeños subvolúmenes tomográficos. El enfoque de construcción de modelos utilizado en este estudio se beneficia del conocimiento previo del orden a gran escala del haz de actina, lo que ayuda a desarrollar una expectativa sobre la orientación de los filamentos de actina y las densidades de reticulación. Quizás aún más significativo es que un cerebro humano puede encontrar patrones fácilmente considerando el contexto más amplio más allá de la distribución de densidad local, mientras que un algoritmo informático solo funciona para una región relativamente pequeña que es considerada por el algoritmo; Por lo tanto, las tendencias a mayor escala no pueden tenerse en cuenta fácilmente. Al ajustar un modelo globalmente a una capa de densidad, evitamos la confusión que puede ocurrir al intentar crear un modelo para pequeñas porciones de filamentos de actina individuales a la vez. Por supuesto, tal ajuste global supone un orden que se extiende a lo largo de grandes distancias. Sin embargo, dado que tuvimos una inesperada flexión gradual pequeña pero significativa de los filamentos de actina, el ajuste global fue solo una aproximación inicial y requirió ajustes locales del modelo para ajustarse al mapa de densidad. Dado que el modelo inicial era un buen punto de partida, los ajustes se pudieron realizar con un alto nivel de confianza. Una gran ventaja de nuestro enfoque fue que podíamos elegir mostrar solo una zona definida de densidad, lo que ayudó a reducir la complejidad del paisaje. Además, la visualización de la losa de densidad del mapa a lo largo del eje del modelo de filamento ayudó a identificar la curvatura inesperada, que probablemente habríamos pasado por alto al mostrar simplemente subvolúmenes más pequeños. La colocación del modelo inicial también facilitó un rápido acercamiento y alejamiento, para alternar entre una vista general de la capa respectiva de filamentos de actina y las vistas detalladas para realizar ajustes en el modelo.

Los pasos críticos dentro del protocolo incluyeron la rotación del mapa después de la inspección visual, la creación y colocación del modelo en el mapa de densidad, así como la división del modelo de filamento en segmentos más pequeños. La posición del átomo de los segmentos podría ajustarse espacialmente para ajustarse al mapa de densidad y/o codificarse por colores para detectar brechas.

Este enfoque de construcción de modelos de actina también se puede modificar colocando un conjunto de "átomos" (es decir, las bolas del modelo de bola y palo) en densidades de filamento mediante el uso de una vista de sección transversal de una losa de densidad promediada de 10-30 cortes/9,47-28,4 nm, que luego se puede conectar mediante enlaces (es decir, los palos del modelo de bola y palo). Hemos utilizado este enfoque, que es una modificación del protocolo descrito aquí en detalle, para la construcción del modelo volumétrico en la región cónica de los estereocilios de las células ciliadas²³. Además, como hemos descrito aquí, nuestro enfoque de construcción de modelos volumétricos también es muy adecuado para la segmentación y la construcción de modelos de membranas.

Si bien la construcción de modelos volumétricos se puede aplicar a cualquier mapa de densidad que muestre características filamentosas, la técnica que hemos descrito aquí es más eficiente cuando tenemos una matriz de filamentos espaciados regularmente, para los cuales se puede obtener un ajuste global de un modelo volumétrico. También depende de las características filamentosas alterar su direccionalidad de manera gradual. Si hay torceduras repentinas y giros bruscos en las estructuras filamentosas, nuestro enfoque puede no ser particularmente útil para la segmentación.

Mientras tanto, nuestros colaboradores han desarrollado un enfoque automatizado para el rastreo automatizado de filamentos que sigue un concepto similar al utilizado aquí para la segmentación manual^30,31. En el futuro, el mejor enfoque puede ser un híbrido de identificación manual y colocación de un modelo inicial disperso (incluso solo unas pocas bolas) en la densidad como punto de partida, y luego dejar que un algoritmo de búsqueda y ajuste termine el trazado de los filamentos.

Los modelos volumétricos simplificados reducen la complejidad de un sistema y permiten apreciar mejor ciertos patrones, como la flexión del filamento de actina cerca de la punta. Además, el modelo volumétrico se puede utilizar como un "ancla" para mostrar una zona de densidad alrededor del modelo de bola y palo de anclaje elegido, lo que permite la detección y visualización de densidades de reticulación entre filamentos de actina adyacentes. La capacidad de seleccionar filamentos individuales y establecer radios apropiados como una zona en la que se muestra nuevamente la densidad permite reducir la abrumadora complejidad del escenario a un nivel manejable.

Una ventaja de este enfoque de construcción de modelos volumétricos de ajuste global, seguido de ajustes locales, fue que pudimos identificar regiones donde los filamentos de actina parecían estar interrumpidos, y las brechas significativas en los filamentos de actina fueron indicadas por la ausencia de densidad de mapa. Dado que habíamos colocado un modelo volumétrico de bola y palo, pudimos hacer uso de una rutina en el paquete de software Chimera de UCSF que codifica por colores la posición de cada bola modelo de acuerdo con el valor de densidad del mapa en esa ubicación. Este enfoque permitió una rápida detección y visualización de las brechas de filamento de actina en el haz de actina, que es una característica biológicamente significativa que encontramos en nuestro tomograma crioelectrónico, y que habría sido muy difícil de detectar y visualizar con los enfoques de segmentación tradicionales. Otra ventaja de nuestro modelo volumétrico es que se pueden obtener fácilmente las propiedades volumétricas, incluidas las longitudes y las distancias, lo que permite obtener números reales y, por lo tanto, realizar un análisis estadístico.

En resumen, la colocación interactiva de puntos del modelo manual, posiblemente aumentada por las capacidades posteriores de ajuste local automatizado y rastreo de filamentos, es un enfoque bastante prometedor para la visualización y el análisis cuantitativo de los volúmenes subcelulares de tomografía electrónica. Esto se debe a que utiliza el poder del cerebro humano para el reconocimiento de patrones y el poder de la informática para la optimización de modelos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Chimera	RBVI		versión 1.16 https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html
Chimera	RBVI		versión 1.16 https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/cgi-bin/secure/chimera-get.py?file=win64/chimera-1.16-win64.exe
Chimera	RBVI		versión 1.16 https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/cgi-bin/secure/chimera-get.py?file=mac64/chimera-1.16-mac64.dmg
Chimera	RBVI		versión 1.16 https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/cgi-bin/secure/chimera-get.py?file=linux_x86_64/chimera-1.16-linux_x86_64.bin
Excel	Microsoft		versión 2211 https://www.office.com/?auth=1
Falcon II	Thermofisher		https://www.thermofisher.com/de/de/home/electron-microscopy/products/accessories-em/falcon-detector.html
IMOD	Universidad de Colorado		Versión 4.11.1 https://bio3d.colorado.edu/imod/download.html
PC Desktop	Intel		Windows 10, ver. 22H2
PC Laptop	Gigabyte		Windows 10, ver. 22H2
Powerpoint	Microsoft		versión 2211 https://www.office.com/?auth=1
titan Krios microscopio electrónico	thermofisher		https://www.thermofisher.com/de/de/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html
Word	Microsoft		versión 2211 https://www.office.com/?auth=1