Aquí, presentamos un protocolo de cultivo 3D efectivo, fácil y rápido para la formación de esferoides de dos líneas celulares de pez cebra (Danio rerio): ZEM2S (embrión) y ZFL (hepatocito normal).
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Un método de cultivo 3D de esferoides de líneas celulares embrionarias y hepáticas de pez cebra
En este artículo
Resumen
Resumen
Las líneas celulares de peces son modelos in vitro prometedores para la evaluación de la ecotoxicidad; sin embargo, los sistemas convencionales de cultivo monocapa (cultivo 2D) tienen limitaciones bien conocidas (por ejemplo, la longevidad del cultivo y el mantenimiento de algunas funciones celulares in vivo ). Así, se han propuesto cultivos 3D, como los esferoides, ya que estos modelos pueden reproducir estructuras similares a tejidos, recapturando mejor las condiciones in vivo . Este artículo describe un protocolo de cultivo 3D efectivo, fácil y rápido para la formación de esferoides con dos líneas celulares de pez cebra (Danio rerio): ZEM2S (embrión) y ZFL (hepatocito normal). El protocolo consiste en enchapar las celdas en una placa de 96 pocillos de fondo redondo, de fijación ultrabaja. Después de 5 días bajo agitación orbital (70 rpm), se forma un solo esferoide por pocillo. Los esferoides formados presentan tamaño y forma estables, y este método evita la formación de múltiples esferooides en un pozo; Por lo tanto, no es necesario seleccionar esferoides de tamaños similares. La facilidad, velocidad y reproducibilidad de este método esferoide lo hacen útil para pruebas in vitro de alto rendimiento.
Introducción
Los esferoides son pequeñas esferas de células que se forman cuando las células se cultivan en estrecho contacto de célula a célula en cultivo 3D. La capacidad de los esferoides para imitar el entorno tisular in vivo ya ha sido estudiada en una variedad de líneas celulares y células primarias 1,2. Sin embargo, aunque los esferoides están bien desarrollados para estudios de toxicidad en mamíferos, el desarrollo de esferoides para estudios de toxicidad con vertebrados no mamíferos (por ejemplo, peces) todavía está en curso3. Para las líneas celulares de peces, los esferoides se h....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Los pasos clave para generar esferoides 3D de líneas celulares ZFL y ZEM2S en una placa de fondo redondo de 96 pocillos se presentan en la Figura 1.
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales utilizados en este protocolo y la Tabla 1 para ver las soluciones y los medios de cultivo utilizados en este protocolo.
1. Medio de cultivo celular y cultivos monocapa
- Cultivar ambas líneas celulares (ZFL, ZEM2S) como monocapas en una incubadora a 28 °C sinCO2, y subcult....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Los esferoides individuales por pozo con un tamaño y forma estables se forman por este método. La Figura 2 ilustra el proceso de formación de esferoides individuales de células ZFL y ZEM2S en un pocillo de una placa ULA bajo agitación orbital (70 rpm). Las líneas celulares ZFL y ZEM2S tienen diferentes comportamientos en la cultura 3D. La línea celular ZEM2S presenta características que confieren la capacidad de formar fácilmente una forma esferoidal desde el primer día de la sacudida orbita.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este es un método simple, fácil y rápido para generar esferoides de hígado de pez cebra y líneas celulares embrionarias. Este método fue desarrollado por este grupo basado en modificaciones de los métodos de esferoides 3D existentes para superar los problemas reportados en estudios científicos relacionados con la formación de esferoides, así como las incertidumbres en la precisión de los datos de los ensayos de esferoides 3D. Por ejemplo, los problemas reportados radican en las dificultades de manejo, la naturaleza lenta.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
En memoria del Dr. Márcio Lorencini, coautor de este trabajo, excelente investigador en el campo de la cosmética y dedicado a promover la investigación cosmética en Brasil. Los autores agradecen al Laboratorio Multiusuario del Departamento de Fisiología (UFPR) por la disponibilidad de equipos y por el apoyo financiero de la Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Enseñanza Superior (CAPES, Brasil) (Código de Finanzas 001) y del Grupo Boticário.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microplaca transparente de ultra baja fijación con fondo redondo y transparente de 96 pocillos, envuelta individualmente, con tapa, estéril | Corning | 7007 | |
| DMEM, polvo, glucosa alta, piruvato | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, polvo | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Procesamiento y análisis de imágenes en Java ( ImageJ) software 1.52p | Institutos Nacionales < Salud de >, EE. UU | Disponible en: | |
| https://imagej.nih.gov/ij/index.html Leibovitz's L-15 Medium, polvo | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm de diámetro |
| de rotación Dulbeccos PBS (10x) con calcio y magnesio | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medio | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Suero fetal bovino, calificado, regiones aprobadas por el USDA | Gibco | 12657-029 | |
| Bicarbonato de sodio, polvo, biorreactivo para biología molecular | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Tinción azul de tripano (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Tripsina-EDTA (0,5%), rojo sin fenol | Gibco | 15400054 | |
| línea celular ZEM2S | ATCC | CRL-2147 | Esta línea celular fue amablemente donada por el Profesor Dr. Michael J. Carvan (Universidad de Wisconsin, Milwaukee, EE. UU.) |
| Línea celular ZFL | BCRJ | 256 |
Referencias
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
